劉 琦 王玉霞 李芳東 孫慶田 張福興*

（1煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264005；2山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺(tái) 265500）

果實(shí)成熟是一個(gè)復(fù)雜的過程，包含著高度協(xié)調(diào)的遺傳調(diào)控過程。在此過程中伴隨著果實(shí)的顏色、質(zhì)地、氣味的變化，其中果實(shí)衰老的一個(gè)重要特征就是果實(shí)的軟化。有研究表明乙烯是果實(shí)衰老的重要激素，尤其是在躍變型的果實(shí)中必不可少，關(guān)于乙烯在果實(shí)成熟軟化中的作用及相關(guān)基因也報(bào)道頗多。促使果實(shí)軟化的主要原因是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)主要依靠細(xì)胞壁的支持，細(xì)胞壁中的組分發(fā)生了分解導(dǎo)致細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致果實(shí)軟化。細(xì)胞壁組分的變化受細(xì)胞壁內(nèi)的水解酶調(diào)控，細(xì)胞壁的降解過程有多種酶的參與，例如纖維素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠酯酶（PME）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）等，而這些酶的活性主要是受到基因的控制。

近年來，關(guān)于果實(shí)軟化，研究細(xì)胞壁解體、細(xì)胞壁相關(guān)酶活性及編碼這些酶的基因成為了主流。本文將與果實(shí)軟化有關(guān)的細(xì)胞壁相關(guān)酶基因的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為探索果實(shí)軟化機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 果實(shí)軟化相關(guān)酶降解基因研究進(jìn)展

1.1 果膠酯酶（PME）相關(guān)基因

PME是一種催化半乳糖醛殘基中C6羧基族脫甲基的酶，在決定果膠含量中起重要作用。在棗果實(shí)中PME基因在脆熟期表達(dá)出現(xiàn)了，但到軟化期反而逐漸減少，這說明PME基因具有果實(shí)軟化的先導(dǎo)作用。有實(shí)驗(yàn)表明PME的活性是由多個(gè)PME基因共同調(diào)控表達(dá)的，在不同品種的藍(lán)莓果實(shí)中，不同基因不僅品種間差異較大，而且在不同的發(fā)育階段也各不相同，其中調(diào)控最為明顯的是PE、PE31、PME3這三個(gè)基因。有研究者從杏果實(shí)中克隆出一條命名為PaPME1的PME的同源基因，其表達(dá)量會(huì)受1-MCP和水楊酸的抑制。研究證明桃基因組含有71個(gè)PME和30個(gè)PMEI基因，它們?cè)?條染色體上分布不均。將71個(gè)PME分為36個(gè)1型和35個(gè)2型PME，這兩類PME基因均在脫甲基酯化反應(yīng)中發(fā)揮作用。在鑒定的30個(gè)PMEI基因中，有15個(gè)在果實(shí)成熟過程中表達(dá)于兩種類型的果實(shí)中；5個(gè)PMEI基因在MF型桃中表達(dá)高于SH型桃，表明這些基因與果實(shí)成熟有關(guān)。1型PMEs的前區(qū)可能參與了活性的自抑制，防止在含有果膠的分泌囊泡中運(yùn)輸期間過早的去酯化。由于2型PMEs缺乏PMEI樣的前區(qū)，因此在果實(shí)成熟過程中，5種PMEI可能共同表達(dá)，以阻斷分泌囊泡內(nèi)的活性。通過對(duì)兩種不同質(zhì)地桃果實(shí)成熟過程中PME和PMEI基因表達(dá)譜的分析，研究了3個(gè)PMEE和5個(gè)PMEI基因的上游調(diào)控順式元件與激素反應(yīng)的關(guān)系。一個(gè)PME（Prupe.7G192800）和兩個(gè)PMEI（Prupe.1G114500 和 Prupe.2G279800）及其啟動(dòng)子被認(rèn)為是今后研究果實(shí)成熟的生化代謝和調(diào)控的潛在靶點(diǎn)。不同的品種基因表達(dá)的情況也不同，在桃果實(shí)中，PME基因‘沙紅’在貯藏期間其表達(dá)量持續(xù)增加，特別是貯藏末期，其表達(dá)量到達(dá)了采摘當(dāng)天的7 000倍，但在‘秦王’的整個(gè)貯藏期間PME表達(dá)量都極低。本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了乙烯的缺乏會(huì)導(dǎo)致PME、PG基因表達(dá)受阻，這兩種基因在桃果實(shí)軟化中協(xié)同發(fā)揮作用，且作用于軟化后期。除此之外，草莓果實(shí)中也被證明在成熟期PME非常豐富。Cristina Castillejo等人分離出4種不同的草莓PE cDNA，稱為FaPE1至FaPE4。FaPE1在果實(shí)中有特異表達(dá)，在果實(shí)成熟過程中表達(dá)量增加，在果實(shí)的轉(zhuǎn)折期達(dá)到最大值。在激素調(diào)控方面，生長素處理提高了青果中FaPE1的mRNA水平，而外源乙烯處理降低了成熟和衰老果實(shí)中FaPE1的mRNA水平。FaPE1表達(dá)的抑制可能與果實(shí)衰老過程中的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。但也有報(bào)道稱在蘋果軟化過程中PME家族中沒有一個(gè)候選基因受到調(diào)控，也沒有明顯的任何去甲基化。

1.2 纖維素酶（Cx）相關(guān)基因

Cx的主要功能是分解含1，4-葡萄糖基鏈的半纖維素基質(zhì)多糖。在棗果實(shí)中有2個(gè)纖維素合成酶基因在果實(shí)成熟前期大量表達(dá)，與纖維素的含量呈負(fù)相關(guān)，并證明了棗果實(shí)軟化使纖維素酶各個(gè)基因聯(lián)合調(diào)控的結(jié)果。在覆盆子核果軟化過程中纖維素酶活性顯著提高，在成熟的鱷梨、草莓、黑莓、桃子等果實(shí)中也發(fā)現(xiàn)了類似的變化。成熟樹莓核果中的纖維素酶水平只有鱷梨的0～3%。盡管存在這些相關(guān)性，但纖維素酶在果實(shí)軟化過程中壁破裂的確切作用尚不清楚。在葡萄柚貯藏的中和后期，Cx的活性上升較快，而且基因的表達(dá)量也明顯增加。有研究者認(rèn)為，Cx在果實(shí)軟化過程中可能對(duì)PG和PME具有補(bǔ)充的作用。研究者從草莓果實(shí)中分離并鑒定出2個(gè)不同的EGase cDNA克隆cel1和cel2，在草莓果實(shí)成熟過程中，單靠Cel1并不是果實(shí)軟化的主要決定因素。轉(zhuǎn)Cel1基因植株的EGase活性水平可能來自于Cel2或其它具有CMCase活性的細(xì)胞壁酶，這些酶的活性沒有降低，從而避免了果實(shí)硬度和細(xì)胞壁組成的任何變化。另外磷酸三鈉（TSP）處理對(duì)果膠甲酯、聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活性也有抑制作用，TSP通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁降解酶活性和控制果膠物質(zhì)，可以延緩棗果實(shí)軟化。

1.3 多聚半乳糖醛酸酶（PG）相關(guān)基因

最為常見的一種參與果實(shí)軟化的水解酶就是PG，植物中的PGs是一個(gè)非常龐大的基因家族。PG的主要作用就是半乳糖苷鍵發(fā)生水解，令細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生解體，從而使果實(shí)軟化。PG基因在不同的植物、不同的時(shí)期及不同的組織中表達(dá)的模式差異比較大，不同時(shí)空的表達(dá)由各基因家族成員分別調(diào)節(jié)。姜妮娜等從柿果實(shí)中克隆到PG基因的3個(gè)全長cDNA，分別命名為DkPG1-3，結(jié)果表明，柿果實(shí)中DkPG1基因的表達(dá)受乙烯調(diào)控，參與PG酶合成，從而調(diào)控柿果實(shí)的成熟衰老。后有研究者從杏果實(shí)中克隆出一條命名為PaPG1的PG基因（PaPG基因是杏果實(shí)軟化最明顯的候選基因）并證明了此基因的表達(dá)量和PaPME1同樣會(huì)受1-MCP和水楊酸抑制，因此，PG基因并非果實(shí)軟化的唯一因素。蘋果“長富2”果實(shí)在冷藏期間PG的活性以及MdPG1-3基因的表達(dá)量都增加了，因此成熟階段多聚半乳糖醛酸酶的活性是由MdPG1、MdPG2、MdPG3共同調(diào)控的。有實(shí)驗(yàn)者證明在棗果實(shí)中PG基因并非果實(shí)軟化的關(guān)鍵因子。有實(shí)驗(yàn)表明MPG1和MPG2與桃果實(shí)的衰老軟化均有關(guān)系。但也有實(shí)驗(yàn)表明僅僅是PG基因不足以引起果實(shí)軟化，PG并非唯一引起細(xì)胞壁降解的因素。研究表明，UV-C輻射延緩了貯藏草莓成熟過程中的軟化，UV-C輻射處理后的1小時(shí)內(nèi)，草莓軟化的延遲可能是通過降低一組與細(xì)胞壁解體有關(guān)的FaPG1基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。因此UV-C處理可以延緩果實(shí)的成熟，并保持果實(shí)的采后硬度，降低了果實(shí)的軟化程度。有研究者控制反義PG基因的劑量，增加反義RNA的表達(dá)，并使用反義RNA來增強(qiáng)破壞基因表達(dá)的能力。功能性PG活性在正常缺陷和含rin突變的水果中的表達(dá)，即使在rin的情況下，可溶性果膠增加，也不會(huì)引起軟化。有研究者在獼猴桃分離到了13個(gè)新的PG基因，并證明了AdPG1的啟動(dòng)子與AdBPC2和AdBPC3存在結(jié)合和調(diào)控效應(yīng)。另外，在藍(lán)莓果實(shí)中，不同品種和部位的PG基因的表達(dá)情況有所差異，PG（3）在‘奧尼爾’和‘燦爛’兩品種中的表達(dá)變化與酶活性時(shí)相似的，而PG(1)-(2)基因表達(dá)與酶的變化也有一定關(guān)系，這表明了酶活性的變化主要受到PG（3）基因的表達(dá)的影響，而PG(1)-(2)基因的表達(dá)在一定程度上與酶活性的變化也有關(guān)系。

1.4 β-半乳糖苷酶（β-Gal）相關(guān)基因

β-Gal能從β-半乳聚糖支鏈非還原末端切除β-半乳糖殘基，不但可以降解纖維素和果膠，而且可以降解蛋白和糖脂，令細(xì)胞壁的某些組分變得不穩(wěn)定，從而使細(xì)胞壁膨脹，進(jìn)而使果實(shí)發(fā)生軟化。研究者以蘋果果實(shí)“長富2”為試材證明了β-Gal的作用時(shí)期主要是果實(shí)成熟后期，MdGAL1、MdGAL2是重要的編碼基因，并且這兩種基因的表達(dá)是先于β-Gal活性到達(dá)高峰的，這說明酶活性的增加可能是由于基因的表達(dá)量的增加。Md-gal表達(dá)量隨著蘋果果實(shí)發(fā)育其基因表達(dá)水平顯著升高，且在品種間有顯著差異。另有研究者表明MdbGAL1、Mdb-GAL2和Mda-AF2是蘋果果實(shí)軟化的重要遺傳標(biāo)記，在今后的轉(zhuǎn)基因和QTL研究中應(yīng)予以考慮，以更好地了解蘋果果實(shí)軟化，尤其是Mdb-GAL2。周厚成等人從草莓果實(shí)中分離出了1個(gè) β-Gal基因家族中的 FaTβgal基因，隨著果實(shí)成熟，此基因的表達(dá)量軟質(zhì)品種‘豐香’和硬質(zhì)品種‘甜查理’中均快速增加；在果實(shí)完全成熟后，此基因在‘甜查理’中的表達(dá)量迅速下降到較低水平，而在‘豐香’中仍保持較高水平，這一結(jié)論證明了此基因與草莓果實(shí)軟化密切相關(guān)。目前有研究者從獼猴桃中克隆到兩個(gè)新的 β-Gal基因，分別命名為 AdβGal1和AdβGal2。初期開始，這兩個(gè)基因均從通過上調(diào)基因表達(dá)量來參與獼猴桃果實(shí)軟化，以此來提高β-Gal的活性，從而參與果實(shí)軟化進(jìn)程。在桃和香蕉果實(shí)中也被證明β-Gal是果實(shí)軟化所必需的基因。藍(lán)莓果實(shí)不同的發(fā)育時(shí)期，β-Gal16的表達(dá)量均在成熟期較高，這時(shí)β-Gal的酶活性也較高，這一結(jié)果表明β-Gal16基因的表達(dá)會(huì)影響酶的活性。

1.5 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）相關(guān)基因

α-L-Af屬于水解酶家族，可以從含有阿拉伯糖殘基的非還原末端水解成為一個(gè)L-阿拉伯糖分子。有研究者從日本梨（Pyrus pyrifolia）果實(shí)中分離純化了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arafase），并分離到一個(gè)相關(guān)的cDNA克?。≒pARF2）根據(jù)該酶的表達(dá)模式和性質(zhì)，它是從果實(shí)中分離得到的糖苷水解酶家族3的新成員，可能與果實(shí)軟化過程中細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。另有實(shí)驗(yàn)證明，在梨成熟過程中，β-Gal和α-L-Af酶活性的提高及其相關(guān)基因的表達(dá)表明，它們?cè)谂c果實(shí)成熟相關(guān)的細(xì)胞壁中起修飾作用，因此β-Gal和α-L-Af可能是梨果實(shí)軟化的必要條件。α-L-Af是香蕉果實(shí)成熟的特異誘導(dǎo)因子，在果實(shí)軟化過程中起重要作用。另外，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（LeARF1）的基因受到乙烯的負(fù)調(diào)控，乙烯可以控制其在成熟過程中的表達(dá)下降和mRNA翻譯或激活α-L-Af原蛋白。實(shí)驗(yàn)證明α-L-Af的基因表達(dá)量與果實(shí)硬度呈負(fù)相關(guān)，并且用1-MCP處理能明顯抑制貯藏中后期α-L-Af基因的表達(dá)量，尤其是貯藏后期抑制效果尤為明顯。也有實(shí)驗(yàn)表明果實(shí)采后使用外源鈣處理可以降低α-L-Af的活性和其基因表達(dá)。

2 存在問題及發(fā)展前景

果實(shí)軟化是果實(shí)衰老的一個(gè)重要特征，果實(shí)軟化主要是因?yàn)榧?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化，細(xì)胞壁相關(guān)酶的活性變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁降解。細(xì)胞壁水解酶的活性又會(huì)受到基因的調(diào)控，其基因的表達(dá)量會(huì)影響果實(shí)軟化。這一點(diǎn)在草莓、柿、桃、藍(lán)莓、獼猴桃等果實(shí)中已經(jīng)得到證實(shí)。

在果樹果實(shí)中 PG、PME、Cx、β-Gal和 α-L-Af基因的表達(dá)量對(duì)酶活性的影響和果實(shí)軟化的作用都有了一定的研究。但仍存在一些問題，目前大多數(shù)的研究僅限于對(duì)這些細(xì)胞壁相關(guān)水解酶基因單獨(dú)的研究，較少探索它們之間的相互關(guān)系及作用等，關(guān)于果實(shí)軟化的細(xì)胞壁相關(guān)水解酶基因之間可能存在這相互制約或者相互促進(jìn)的關(guān)系；與果實(shí)軟化相關(guān)的細(xì)胞壁水解酶的不同基因表達(dá)的時(shí)間和時(shí)期各不相同，同一基因在各個(gè)果樹果實(shí)中的表達(dá)時(shí)期也不盡相同，尚未見對(duì)此有系統(tǒng)性的研究。

未來關(guān)于果樹果實(shí)軟化細(xì)胞壁相關(guān)水解酶基因的研究可以從以下幾個(gè)方面入手：選擇某一種果樹果實(shí)，探究各相關(guān)水解酶基因與果實(shí)軟化的關(guān)系。總結(jié)不同成熟度與各個(gè)基因表達(dá)量的關(guān)系；探索新的可抑制各個(gè)與果實(shí)軟化相關(guān)基因的表達(dá)量的方法，為果實(shí)采摘后保鮮及貯藏提供科學(xué)依據(jù)；研究與果實(shí)軟化相關(guān)酶基因之間的相互關(guān)系及作用；測量同一果實(shí)不同成熟期的基因表達(dá)量和同一基因在不同果實(shí)成熟時(shí)期的基因表達(dá)量等；對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆，通過合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來確定基因的功能，探索更多同源基因家族；可以控制反義RNA的表達(dá)，并使用反義RNA來增強(qiáng)破壞基因表達(dá)的能力，以此來抑制功能基因的表達(dá)來控制果實(shí)軟化。