丁小伍 李輝

(1，安徽省涇縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)服務(wù)中心 242000；2，安徽省靈璧縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)服務(wù)中心尹集畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)站 234216)

非洲豬瘟傳入我國之后,對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)負(fù)面影響,準(zhǔn)確檢測是防控非洲豬瘟疫情的一個(gè)重要手段。疫情發(fā)生至今,熒光定量PCR 檢測技術(shù)在非洲豬瘟防控中發(fā)揮了重要作用,本文主要從熒光定量PCR 技術(shù)簡介、熒光定量PCR 在非洲豬瘟防控中的應(yīng)用、熒光定量PCR 檢測非洲豬瘟的質(zhì)量控制要點(diǎn)等方面進(jìn)行綜述。

1 熒光定量PCR 技術(shù)簡介

熒光定量PCR 是20 世紀(jì)末從美國引進(jìn)的核酸定量檢測技術(shù),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病原體檢測、遺傳疾病的早期診斷、轉(zhuǎn)基因檢測、遺傳育種、親自鑒定等,近年在動(dòng)物疫病檢測中逐步得到廣泛應(yīng)用,尤其是非洲豬瘟疫情發(fā)生后,一些縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室也配備了熒光PCR 檢測儀。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR,是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光染料或特異性熒光探針,利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR 進(jìn)程,使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”,最后通過Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA 進(jìn)行定性并對(duì)其起始濃度進(jìn)行定量的技術(shù)。非洲豬瘟熒光PCR 檢測中,主要采用TaqMan 探針檢測法,在PCR 反應(yīng)的退火階段,TaqMan 探針與靶序列DNA 特異性結(jié)合,在PCR 反應(yīng)的延伸階段,結(jié)合的探針由于其Taq 聚合酶的核酸外切酶活性而被降解,供體熒光分子與受體熒光分子分離,熒光信號(hào)得到釋放,此時(shí)檢測熒光信號(hào)的強(qiáng)度,就可確定與DNA特異性結(jié)合的探針數(shù)量,間接測出模板DNA 量,理論上熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物一樣是呈指數(shù)型增長；但如果PCR過程中,模板不能與引物探針互補(bǔ),探針將保持完整并處于游離狀態(tài),則不會(huì)釋放熒光信號(hào)。

與普通PCR 相比,熒光PCR 技術(shù)具有更高的靈敏度,臨床檢測結(jié)果表明一般要高出100 倍左右；熒光PCR 多一條探針,具有更強(qiáng)的特異性,可實(shí)現(xiàn)一管檢測多種疾病；全封閉的PCR 過程,無須后續(xù)處理,儀器自動(dòng)分析,直接讀出結(jié)果。在2018 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部非洲豬瘟試劑評(píng)價(jià)中,熒光PCR 試劑占比70%以上,近2 年的實(shí)踐證明,熒光PCR 已成為非洲豬瘟檢測的主流技術(shù)。

2 熒光定量PCR 在非洲豬瘟防控中的應(yīng)用

2.1 常規(guī)監(jiān)測

依靠熒光定量PCR 技術(shù)建立ASF 預(yù)警體系,定期開展監(jiān)測。對(duì)于未發(fā)生ASF 疫情的養(yǎng)殖場,重點(diǎn)放在異常豬、車輛、人員、生產(chǎn)資料、物品等能與外界接觸的環(huán)節(jié)和風(fēng)險(xiǎn)因素；對(duì)于周邊發(fā)生疫情的豬場,可先檢測外面環(huán)境和人員,再檢測場區(qū)內(nèi)環(huán)境,一般不輕易檢測豬群；如果場內(nèi)出現(xiàn)了問題,可對(duì)生豬各單元環(huán)境進(jìn)行檢測,主要是料槽、水管等環(huán)節(jié),同時(shí)對(duì)異常豬群及其鄰近豬群采樣監(jiān)測。

2.2 引種檢測

引進(jìn)種豬前,必須要全面了解供種場的基本情況,采集口鼻拭子、豬血液、環(huán)境拭子樣本進(jìn)行非洲豬瘟檢測,保證所供種豬安全,引進(jìn)精液也是如此。引種前一般雙方先要確定檢測方案,明確采樣數(shù)量、采樣類型,由誰來采樣,由誰來檢測,保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,確保雙方利益。國家最新修訂的《生豬產(chǎn)地檢疫規(guī)程》和《跨省調(diào)運(yùn)乳用種用動(dòng)物產(chǎn)地檢疫規(guī)程》明確要求對(duì)種豬調(diào)運(yùn)前必須進(jìn)行非洲豬瘟檢測,《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于規(guī)范生豬及生豬產(chǎn)品調(diào)運(yùn)活動(dòng)的通知》（農(nóng)牧發(fā)〔2018〕23 號(hào)）對(duì)檢測樣品類型和數(shù)量進(jìn)行了規(guī)定。

2.3 復(fù)養(yǎng)檢測

發(fā)生非洲豬瘟疫情的豬場復(fù)養(yǎng)前評(píng)估和復(fù)產(chǎn)過程中都離不開檢測。復(fù)產(chǎn)前,首先要對(duì)場內(nèi)疫源清除和滅活情況進(jìn)行評(píng)估,對(duì)環(huán)境進(jìn)行采樣檢測,對(duì)進(jìn)場物料進(jìn)行評(píng)估檢測；引入生豬后,要密切關(guān)注豬群,發(fā)現(xiàn)異常情況,及時(shí)檢測排除風(fēng)險(xiǎn)。

2.4 精準(zhǔn)清除

熒光定量PCR 是進(jìn)行精準(zhǔn)清除的重要手段,多數(shù)年出欄5000 頭以上養(yǎng)殖場都已建立了熒光PCR 檢測室。豬場出現(xiàn)異常時(shí),依靠檢測手段和流行病學(xué)調(diào)查,密切關(guān)注豬群,及時(shí)清除風(fēng)險(xiǎn)豬群。精準(zhǔn)清除中,采樣的合理和規(guī)范至關(guān)重要,一般口鼻拭子樣品的檢出時(shí)間要比血液早3 天左右,但口鼻拭子病毒含量較低,對(duì)檢測靈敏度要求較高,采樣技術(shù)要求較高,很多養(yǎng)殖場采用皮膚扎出少量血液與拭子樣品混樣檢測方式進(jìn)行,這樣不容易漏檢,拭子采樣可使用拭子咀嚼也可采用商品化的采樣包。

2.5 屠宰檢測

當(dāng)前生豬價(jià)格高,控制風(fēng)險(xiǎn)豬只屠宰后進(jìn)入市場對(duì)防控很關(guān)鍵,一旦陽性豬肉流入市場,那么傳染鏈條可直接到達(dá)養(yǎng)殖場,引發(fā)疫情。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部119 號(hào)公告要求屠宰場對(duì)宰后暫存血液進(jìn)行抽樣檢測,我省對(duì)此進(jìn)行了全面部署,宰后檢測方法均為熒光定量PCR。

3 熒光定量PCR 檢測非洲豬瘟的質(zhì)量控制要點(diǎn)

3.1 實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格分區(qū)

熒光定量PCR 檢測技術(shù)靈敏,極其微量的污染即可造成假陽性,對(duì)PCR 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分區(qū)管理可以避免檢測污染。一般將實(shí)驗(yàn)室分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、核酸提取區(qū)、PCR 擴(kuò)增區(qū),每個(gè)區(qū)的物品固定,不交叉使用,并做到相對(duì)獨(dú)立。

3.2 規(guī)范操作

從事檢測的人員必須經(jīng)培訓(xùn)合格后上崗,切實(shí)掌握實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟。試驗(yàn)操作不規(guī)范,移液器操作不當(dāng),容易使移液器與不同試劑和樣品之間發(fā)生交叉污染,而造成檢測結(jié)果錯(cuò)誤。養(yǎng)殖場或屠宰場應(yīng)加強(qiáng)檢測人員培訓(xùn),提高檢測能力和實(shí)驗(yàn)分析能力,這樣即使出了問題,也很容易找到根源。

3.3 做好質(zhì)控體系

目前主要采用陰性對(duì)照和陽性對(duì)照對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行質(zhì)控,陰性對(duì)照和陽性對(duì)照直接參與樣本提取過程,能夠質(zhì)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。但當(dāng)前很多實(shí)驗(yàn)室,陽性對(duì)照和陰性對(duì)照沒有參與提取過程,這樣不能監(jiān)控提取過程是否有誤或提取試劑是否失效。

3.4 核酸污染的處理措施

核酸污染是影響結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一,導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。預(yù)防核酸污染,首先要規(guī)范處理PCR 產(chǎn)物,可經(jīng)過消毒液浸泡、高壓、危廢回收；為防止PCR 管開蓋而形成高濃度核酸氣溶膠,造成環(huán)境污染,可選擇優(yōu)質(zhì)的PCR 反應(yīng)管,上機(jī)前蓋緊PCR 管。消除DNA 片段可采用商品化的DNA 去除劑噴灑擦拭,使用紫外燈照射,加強(qiáng)通風(fēng),也有的向空中噴水而使DNA 溶于水中；對(duì)于污染的移液器要進(jìn)行清洗或高壓,實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和生物安全柜可用DNA 去除劑擦拭,PCR 儀用DNA去除劑擦拭和紫外燈照射。