鐘文權(quán)，鄭聯(lián)合，鄒 易，李豫強，張 威，戴 煌，肖安紅

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023; 2.湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點實驗室，武漢 430023; 3.海南省糧油科學研究所，?？?571400)

瓊崖海棠(CalophylluminophyllumL.)，又名海棠果、紅厚殼、胡桐、海桐、君子樹、海棠木，為藤黃科 (Guttiferae) 紅厚殼屬(Calophyllumgenus) 常綠喬木，喜高溫、耐旱熱、防海潮、抗強風，在熱帶沿海作為防風林和護堤林被廣泛種植，目前在我國廣東、廣西、臺灣及東南亞、非洲等熱帶地區(qū)均有分布[1]。瓊崖海棠籽富含油脂，種仁干基粗脂肪含量為 50%～60%[2]。瓊崖海棠籽油的主要脂肪酸為9-十八碳烯酸(27. 67%)、9, 12-十八碳二烯酸(16.78%)、9-十八碳烯酸(E)(13. 54%)、十八碳酸(12.92%)、十六碳酸(10.77%)、11, 14-二十碳二烯酸(7.17%)、正十六碳酸(5.24%)、十七碳酸(5.13%)[3]。在海南，瓊崖海棠籽油常被民間用作防腐劑、抗菌劑、收斂藥、止疼劑等，用于治療跌打損傷、外傷出血，減緩關節(jié)痛、神經(jīng)痛等疾病[4-5]。由于瓊崖海棠籽中含有具有一定毒性的酚類、香豆素類、黃酮類、三萜類[6]和生物堿[7]等物質(zhì)，在制油時，這些物質(zhì)會轉(zhuǎn)移至油中，并使油脂呈深綠色、渾濁、味苦并具有類似中草藥特殊氣味，所以瓊崖海棠籽未作為新食用油料資源進行研發(fā)。

為開發(fā)瓊崖海棠籽作為新的食用油料資源，前期本實驗室對瓊崖海棠籽毛油和精煉油進行了小鼠急性經(jīng)口毒性試驗，其中瓊崖海棠籽毛油急性經(jīng)口毒性試驗采用寇氏法[8]，精煉油采用限量法[8]。結(jié)果顯示：瓊崖海棠籽毛油對雄性小鼠的LD50為 9 217.6 mg/kg，LD50的95%可信限為8 606.4～9 871.3 mg/kg，雌性小鼠的LD50為9 066.4 mg/kg，LD50的95%可信限為8 546.9～9 617.5 mg/kg[9]；瓊崖海棠籽精煉油的LD50大于15 000 mg/kg。從而判定瓊崖海棠籽毛油毒性級別為實際無毒級，精煉油毒性級別為無毒[8]。在此基礎上，本文采用體內(nèi)與體外試驗、體細胞試驗與生殖細胞試驗相結(jié)合的原則，從不同的遺傳學終點和靶向的角度，即Ames試驗、小鼠骨髓紅細胞微核試驗和精子畸形試驗對瓊崖海棠籽毛油的遺傳毒性進行了全面評價，以期為海棠籽開發(fā)作為新食用油料資源積累基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

瓊崖海棠籽毛油，實驗室自制，主要理化指標和油脂伴隨物含量分別見表1和表2。

試驗用昆明種小鼠，清潔級，由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心提供。動物合格證號為SCXK(京)2019-0010，使用許可證號為SYXK(鄂)2016-0057。

Gimesa染液、小牛血清，江蘇南京建成生物工程研究所；玉米油，中糧福臨門食品有限公司；無水乙醇、環(huán)磷酰胺、甲醇、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

E3CMOS06300KPA生物顯微鏡，河南兄弟儀器設備有限公司。

表1 瓊崖海棠籽毛油主要理化指標

表2 瓊崖海棠籽毛油油脂伴隨物含量

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠骨髓紅細胞微核試驗[10]

選用昆明種健康成年小鼠，體重22～25 g，適應性喂養(yǎng)5 d。根據(jù)急性毒理試驗結(jié)果，按1/8 LD50、1/4 LD50和1/2 LD50分為3個劑量組，雌性分別為1 133.3、2 266.6、4 533.2 mg/kg，雄性分別為1 152.2、2 304.4、4 608.8 mg/kg，以玉米油為陰性對照組(劑量為1/8 LD50)，以環(huán)磷酰胺水溶液為陽性對照組(劑量為40 mg/kg)，隨機分組，每組10只，每組雌雄各半。0、24 h經(jīng)口2次灌胃，30 h時頸椎脫臼處死小鼠，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕，剖開胸腹部，取下胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型彎止血鉗將骨髓擠于有一滴小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片，自然晾干。按以下操作步驟制片：①浸入99.5%甲醇溶液缸中固定15 min，取出自然晾干；②將固定后的玻片浸入Gimesa染液缸中染色15 min，然后立即用pH為6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗掉玻片上的染色液，自然晾干，陰涼干燥處保存?zhèn)錂z。

將制好的骨髓片先在低倍顯微鏡下觀察，選擇細胞完整、分布均勻、染色較好的區(qū)域作為檢測區(qū)域；然后用油鏡閱片，觀察骨髓嗜多染紅細胞、正多染紅細胞、含微核細胞并計數(shù)。

每只小鼠計數(shù)1 000個骨髓嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocyte，PCE)，觀察含微核的嗜多染紅細胞數(shù)，并計數(shù)微核數(shù)，計算微核細胞率(微核細胞率=含微核的嗜多染紅細胞數(shù)/嗜多染紅細胞總數(shù)×100%)，計數(shù)200個細胞中骨髓嗜多染紅細胞與正多染紅細胞(normochromatic erythrocyte，NCE)的比值，結(jié)果采用U檢驗法檢驗結(jié)果的差異性。

飼養(yǎng)條件：試驗小鼠在19～25℃、相對濕度50%、光照強度130～325 lx、氨質(zhì)量濃度小于等于20 mg/L、噪聲小于等于50 dB環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，每天上午9點更換飼料、墊料和水并正常飼養(yǎng)，自由采食、飲水。

1.2.2 小鼠精子畸形試驗[11]

選用昆明種健康成年雄性小鼠，體重20～35 g，適應性喂養(yǎng)1周，劑量分組、飼養(yǎng)條件均同1.2.1。連續(xù)5 d上午9點灌胃，第35天脫臼處死小鼠，取出睪丸附近二側(cè)的附睪器官，放進裝有2 mL左右生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)的平皿里，用眼科剪將洗凈的附睪縱向剪1～2刀，靜置3～5 min，輕輕搖動，用四層擦鏡紙將剪碎的附睪溶液進行過濾，吸濾液進行涂片，在空氣中自然干燥后，浸入1%伊紅染液缸中染色1 h，再浸入99.5%甲醇溶解缸中5 min左右，取出自然晾干，1 h后用蒸餾水輕輕地沖掉染液，自然晾干，陰涼干燥處保存?zhèn)錂z。

首先在低倍顯微鏡下找到背景比較清晰而且精子重疊比較少的區(qū)域為受檢區(qū)域，然后再用高倍顯微鏡按從左到右和從上到下的順序逐個檢查并記錄精子的形態(tài)，其中無鉤、香蕉形、胖頭、無定形、尾折疊、雙頭等為畸形精子。每只試驗動物以1 000個結(jié)構(gòu)完整的精子為基數(shù)，計數(shù)精子畸形數(shù)，計算精子畸形率，并采用Wilcoson秩和檢驗法檢驗進行顯著性分析。

1.2.3 Ames試驗[12]

依照GB 15193.4—2014《食品安全國家標準 細菌回復突變試驗》中平板摻入法進行。試驗分瓊崖海棠籽毛油組、溶劑對照組(二甲基亞砜)、陽性對照組和空白對照組(不添加受試物)，陽性誘變劑采用敵克松(TA97、TA98, 不加S9)、甲基磺酸甲酯(TA100、TA102, 不加S9)、2-氨基芴(TA97、TA98、TA100, 加S9) 及1,8-二羥基蒽醌(TA102, 加S9)。

選用鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102，經(jīng)鑒定合格后開展試驗。活化系統(tǒng)為多氯聯(lián)苯誘導的大鼠肝S9, 蛋白質(zhì)含量為37.5 mg/mL, 其對2-氨基芴具良好代謝激活能力，每100 mL S9混合液中加入10 mL S9。

由于受試物對菌株無細菌毒性，設置受試物的最高劑量為5 μL/皿(約4 647 μg/皿)，在加與不加S9混合液的情況下，分兩次試驗，第一次以5.0、2.5、1.3、0.6 μL/皿及0.3 μL/皿劑量進行試驗，第二次以5.0、1.0、0.2、0.04 μL/皿及0.008 μL/皿劑量進行試驗，每個劑量設3個平行。受試樣品的稱量和配制均在無菌條件下進行，受試樣品用二甲基亞砜溶解配制成50 μL/mL高劑量組，以下8個劑量組分別用二甲基亞砜逐級稀釋，加樣量均為0.1 mL/皿。在2 mL頂層培養(yǎng)基中加入0.1 mL試驗菌株增菌液、0.1 mL 受試樣品溶液和0.5 mL S9混合液(當需要活化時)?；靹蚝笱杆賰A注在底層培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)，當受試物菌落回變數(shù)超過自發(fā)回變數(shù)的2倍以上并有劑量反應關系時判定為陽性。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠骨髓紅細胞微核試驗結(jié)果(見表3)

表3 小鼠骨髓紅細胞微核試驗結(jié)果

由表3可知，雌性和雄性小鼠陰性對照組微核細胞率分別為0.26%和0.24%，小于0.5%[10]，陽性對照組的微核細胞率相對陰性對照組存在極顯著差異(P<0.01)，說明陰性對照組可選擇玉米油進行試驗。瓊崖海棠籽毛油低、中、高劑量組均會引起小鼠發(fā)生微核突變，低劑量組相對陰性對照組均不存在顯著性差異；中、高劑量組相對陰性對照組存在極顯著差異(P<0.01)，且隨著劑量的增加，微核細胞率呈逐漸上升的趨勢，有明顯的劑量-反應關系[10]，結(jié)果顯示陽性。

2.2 小鼠精子畸形試驗(見表4)

由表4可見，陰性對照組的精子畸形率為2.19%，在0.8%～3.4%[11]范圍內(nèi)，中、高劑量組相對陰性對照組存在極顯著差異(P<0.01)，且隨著劑量的增加，精子畸形率呈逐漸上升的趨勢，有劑量-反應關系[11]，為陽性結(jié)果。

表4 小鼠精子畸形試驗結(jié)果

2.3 Ames試驗結(jié)果(見表5、表6)

瓊崖海棠籽毛油兩次細菌回復突變試驗，平板上菌株生長良好，未觀察到污染菌落。由表5和表6可知：空白對照組的試驗結(jié)果表明4種菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)與GB 15193.4—2014和文獻[13-14]報道一致，結(jié)合菌株鑒定結(jié)果，表明菌株狀態(tài)正常；陽性對照組的回變菌落數(shù)顯著高于自發(fā)突變，表明陽性誘變劑有效。將不同劑量的受試物樣品組與溶劑對照組的結(jié)果進行比較，結(jié)果表明，在添加與不添加S9混合物情況下，兩次試驗中所有劑量的受試物樣品組的回變菌落數(shù)均未超過溶劑對照組回變菌落數(shù)的2倍，且無劑量-反應關系。說明受試物瓊崖海棠籽毛油對鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100及TA102 4株試驗菌株，在添加與不添加S9混合物情況下，均未觀察到致基因突變作用。

表5 Ames試驗結(jié)果(第一次)

表6 Ames試驗結(jié)果(第二次)

2.4 討論

遺傳終點具有多樣化特性，本研究采用Ames試驗、小鼠精子畸形試驗和小鼠骨髓紅細胞微核試驗組合檢測多個遺傳終點。Ames試驗是檢測基因突變的體外試驗，利用鼠傷寒沙門氏菌的突變營養(yǎng)缺陷菌株為指示物，檢測DNA堿基序列是否改變。小鼠精子畸形試驗檢測受試物對精子不同發(fā)育階段的影響，評價生殖細胞的受損情況。小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遺傳性，許多染色體及X、Y性染色體基因直接或間接地決定精子形態(tài)。精子畸形主要是指形態(tài)的異常，已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。因此，形態(tài)的改變提示有關基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的改變，說明環(huán)境因子對精子生成、發(fā)育有影響。小鼠骨髓紅細胞微核試驗是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗方法。無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期仍留在子細胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核。有很多化學物質(zhì)能引起染色體的異常。染色體是遺傳物質(zhì)的載體并含有生物體全部的遺傳信息，染色體遺傳信息的異?？刹煌潭鹊赜绊懮餀C體的生存，輕者突變，重者死亡。染色體僅出現(xiàn)微小的異常變化，都可能對人體健康產(chǎn)生非常嚴重的影響。

本實驗室前期經(jīng)口急性毒性試驗結(jié)果顯示瓊崖海棠籽毛油屬于實際無毒，精煉油屬于無毒。在遺傳毒性試驗中，瓊崖海棠籽毛油各劑量組在Ames試驗(鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102)中結(jié)果均為陰性，表明瓊崖海棠籽毛油在體外試驗中未發(fā)現(xiàn)致突變作用。在小鼠骨髓紅細胞微核試驗中，與陰性對照組相比，瓊崖海棠籽毛油中、高劑量組微核細胞率存在極顯著差異(P<0.01)，有明顯的劑量-反應關系，為陽性結(jié)果，引起染色體異常。在小鼠精子畸形試驗中，相對陰性對照組，瓊崖海棠籽毛油中、高劑量組精子畸形率存在極顯著差異(P<0.01)，有劑量-反應關系，結(jié)果也為陽性，對決定精子形成的基因發(fā)生了突變。

目前，對于瓊崖海棠籽毛油中存在的化學成分未完全分析鑒定清楚，根據(jù)目前國外學者對紅厚殼屬植物的葉、莖、根、皮、種子等部位的化學成分進行分析研究結(jié)果推斷，瓊崖海棠籽毛油中可能有呫噸酮類、香豆素類、黃酮類、萜類[7]、酚類、生物堿類等多種化合物存在。其中呫噸酮類包括Calozeylo-xanthone、1,5-Dihydroxyxanthone、6-Deoxyjacareubin和Caledonixanthone等[6]，香豆素類包括Inophyllum A、B、C、D和Calophyllolide等[6]，黃酮類包括Amentoflavone、Biflavanone和Pyranoamentoflavone等[6]，萜類包括Canophyllal、Canophyllol和Taraxerone等[6]。本研究測定了瓊崖海棠籽毛油中黃酮、三萜、總酚、香豆素和生物堿含量(見表2)，這些成分有些具有一定的毒性。Oodyke[15]研究結(jié)果顯示，香豆素類對大鼠口服LD50為293 mg/kg，按照我國化合物經(jīng)口急性毒性分級標準[16]中的毒性分級判定可知，香豆素為中等毒性。香豆素類化合物在高劑量時具有遺傳毒性和肝臟毒性等[17]。由此可以推斷，瓊崖海棠籽毛油的小鼠骨髓紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗為陽性，可能與其含有呫噸酮類、香豆素類、萜類和生物堿類等化學物質(zhì)有關。

物質(zhì)的毒性不僅與物質(zhì)的本身性質(zhì)有關，也與攝入該物質(zhì)的劑量有關。若按照體重50 kg的成年人每人每天油脂的攝入量25～30 g[18]計算，則瓊崖海棠籽毛油或精煉油的攝入劑量為500～600 mg/kg，低于瓊崖海棠籽毛油小鼠骨髓紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗陰性結(jié)果的低劑量1 133.2 mg/kg(雌性)和1 152.2 mg/kg(雄性)。由此，可推斷對于瓊崖海棠籽毛油在推薦攝入劑量(500 ～ 600 mg/kg)時對受試物不具遺傳毒性。

3 結(jié) 論

瓊崖海棠籽毛油的小鼠骨髓紅細胞微核試驗和精子畸形試驗的中、高劑量組為陽性結(jié)果；Ames試驗結(jié)果均為陰性。瓊崖海棠籽毛油中所含呫噸酮類、香豆素類、萜類和生物堿等化學物質(zhì)可能是遺傳毒性為陽性的原因。小鼠骨髓紅細胞微核試驗、精子畸形試驗為陰性結(jié)果的低劑量，高于推薦油脂攝入量，說明在推薦油脂攝入量下，瓊崖海棠籽毛油對受試物不具遺傳毒性。