張方圓，王李平，朱大林，潘云山

(廣東省科學(xué)院 廣東省測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省保健食品功效成分檢測與風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心，廣州 510070)

縮水甘油酯(Glycidyl esters，GEs)是縮水甘油和脂肪酸的酯化產(chǎn)物。GEs在人體中會代謝為縮水甘油(又稱環(huán)氧丙醇)，在2017年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)公布的致癌物清單中，縮水甘油被列入了2A類致癌物清單。動物實(shí)驗(yàn)證明縮水甘油具有致癌作用，食用后容易對人體中樞神經(jīng)產(chǎn)生抑制作用，可能損害生育能力甚至致癌[1]。另外，縮水甘油在氯離子和酸性條件下，易轉(zhuǎn)換成氯丙醇，以3-氯-1，2-丙二醇(3-MCPD)為主，而3-MCPD 具有腎毒性、生殖毒性和致癌性[2]，對人體健康產(chǎn)生巨大的威脅。

GEs已成為一種潛在的食品污染物，并引起了社會各界的廣泛關(guān)注[3]。2016年，歐盟(EFSA)對GEs和氯丙醇酯類化合物對人類健康進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評估，結(jié)果表明絕大多數(shù)植物油中均含有GEs和氯丙醇酯，并制定了氯丙醇的每日許可限量(TDI)值為0.8 μg/kg[4]。2018年，歐盟實(shí)施了對植物油和嬰幼兒奶粉中GEs的限量管理[5]。目前，我國缺少食品中GEs的相關(guān)檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要分為直接法和間接法兩類。直接法主要應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)，在不破壞GEs結(jié)構(gòu)的條件下，對各類GEs進(jìn)行直接測定[6-7]，但由于GEs種類較多，多種標(biāo)準(zhǔn)品還未商業(yè)化，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品造價(jià)昂貴，且難以購得。間接法多采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)，將GEs轉(zhuǎn)化為其他特異性的物質(zhì)，通過檢測該物質(zhì)的含量間接測定GEs的含量[8-9]?！?018年國家食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作手冊》采用間接法測定GEs的含量，將GEs經(jīng)酯交換反應(yīng)后，與氯離子反應(yīng)生成氯丙醇，通過氯丙醇的差值折算得到GEs的含量。間接法適用于測定GEs的總量，但由于GEs和氯丙醇酯的形成機(jī)理相似，氯丙醇酯通常伴隨GEs一起形成，GEs不是氯丙醇形成的唯一前體，且食品中存在氯丙醇本底值的干擾情況[10]。因此，通過將GEs轉(zhuǎn)化成氯丙醇間接測定GEs含量時(shí)，需先測定樣品中氯丙醇及其酯的本底值，再測定樣品中經(jīng)GEs轉(zhuǎn)化而來的氯丙醇和樣品本身氯丙醇及其酯的總含量，通過計(jì)算氯丙醇含量的差值得到GEs的含量。這加大了實(shí)驗(yàn)工作量和實(shí)驗(yàn)所需樣品量，且本底值測定的準(zhǔn)確性會直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究采用間接法將GEs轉(zhuǎn)化成3-溴-1，2-丙二醇(3-MBPD)酯，再通過水解和衍生化前處理方法，采用GC-MS測定3-MBPD含量，從而實(shí)現(xiàn)對食用植物油中GEs的測定，并通過正交實(shí)驗(yàn)對衍生條件進(jìn)行優(yōu)化。溴丙醇和氯丙醇結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，且樣品中不存在溴丙醇本底值干擾的情況，因此本方法可以通過測定溴丙醇含量直接得到GEs的含量，降低了樣品中基質(zhì)干擾，克服了氯丙醇本底值干擾，提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，且減少了測定工作的樣品需求量，可以更好地滿足食用植物油中GEs含量的測定要求。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

食用植物油樣品均購于廣州市各大超市；棕櫚酸縮水甘油酯(GEs, 98.0%，BePure)，棕櫚酸-D5-3-氯-1,2-丙二醇酯(D5-3-MCPDE，100 μg/mL，F(xiàn)irst Standard)；正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、三氯甲烷均為色譜純；苯硼酸(PBA，97.0%，麥克林)；實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水；其他試劑均為分析純。

GEs標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品0.011 11 g(精確至0.000 01 g)，用三氯甲烷配制成1 089 μg/mL的儲備液，臨用時(shí)用三氯甲烷稀釋成所需質(zhì)量濃度。

內(nèi)標(biāo)棕櫚酸-D5-3-氯-1,2-丙二醇酯溶液：準(zhǔn)確移取適量棕櫚酸- D5-3-氯-1,2-丙二醇酯標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯配制成10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；Sartorius BT125D 電子天平；TD25-WS多管架自動平衡離心機(jī)；KQ-600E超聲波清洗儀；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；0XW-80A旋渦混合器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

稱取植物油樣品0.2 g(精確至0.000 1 g)于10 mL比色管中，準(zhǔn)確加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，再加入2 mL甲基叔丁基醚-乙酸乙酯溶液(體積比2∶1)，渦旋溶解，作為待反應(yīng)液。

向待反應(yīng)液中加入酸化溴化鈉溶液0.1 mL，渦旋混勻，在50℃水浴反應(yīng)15 min；加入3 mL飽和碳酸氫鈉溶液中止反應(yīng)，并加入2 mL正己烷，渦旋，靜置，取上清液于10 mL比色管中，用正己烷重復(fù)提取上清液2次，合并提取液于10 mL比色管中，40℃氮吹至近干，加入1 mL甲基叔丁基醚-乙酸乙酯溶液(體積比2∶1)復(fù)溶，備用。

于上述提取液中加入2 mL 1.8%硫酸-甲醇溶液，混合均勻后，置于40℃恒溫水浴中反應(yīng)16～20 h。加入3 mL飽和碳酸氫鈉溶液中止反應(yīng)后，渦旋，靜置分層，氮吹除去有機(jī)溶劑。再用2 mL正己烷除去反應(yīng)液中的脂溶物，棄上層液，正己烷重復(fù)脫脂2次，得到下層清液備用。

加入1.0 mL乙酸乙酯于上述清液中，渦旋提取1 min，取上層液于裝有1 g無水硫酸鈉的10 mL比色管中，重復(fù)提取2次，合并提取液，于40℃氮吹吹干。

加入適量PBA溶液，振蕩均勻后，于恒溫水浴反應(yīng)一段時(shí)間，冷卻，40℃氮吹至近干，加入1 mL正己烷，渦旋溶解，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，待測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將GEs標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋得到質(zhì)量濃度為1.089 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取GEs標(biāo)準(zhǔn)溶液20、50、100、200、500、1 000、2 000 μL于10 mL比色管中，并分別加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，按1.2.1在酸性條件下與溴離子反應(yīng)后，經(jīng)1.8%硫酸-甲醇水解，乙酸乙酯提取，于40℃氮吹吹干后，按優(yōu)化后的衍生條件衍生化，得到目標(biāo)物3-MBPD-PBA質(zhì)量濃度依次為0.021 8、0.054 4、0.109、0.218、0.544、1.089、2.178 μg/mL，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為0.200 μg/mL，然后進(jìn)行GC-MS分析，以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，3-MBPD-PBA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 GC-MS分析條件

GC條件：色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280℃；升溫程序?yàn)?0℃保持0 min，以6℃/min速率升溫至180℃，再以60℃/min速率升溫至300℃，保持3 min；進(jìn)樣方式為脈沖不分流；進(jìn)樣量1 μL。

MS條件：電子轟擊離子源(EI)；電離能量70 eV；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃；掃描方式為選擇離子掃描(SIM)；溶劑延遲6 min；定量及定性離子見表1。

表1 3-MBPD-PBA、D5-3-MCPD-PBA的監(jiān)測離子

2 結(jié)果與討論

2.1 3-MBPD和D5-3-MCPD衍生物的定性分析

本實(shí)驗(yàn)中，GEs和內(nèi)標(biāo)D5-3-MCPDE在酸性條件下與溴離子反應(yīng)后，經(jīng)硫酸-甲醇水解后生成3-MBPD和D5-3-MCPD。3-MBPD和D5-3-MCPD在PBA用量100 μL、衍生溫度50℃、衍生時(shí)間10 min條件下與PBA衍生后生成3-MBPD-PBA和D5-3-MCPD-PBA。衍生產(chǎn)物在GC-MS分析條件下，經(jīng)全掃描模式分析后，得到相應(yīng)的總離子流圖和質(zhì)譜圖，如圖1所示。

圖1 2.178 μg/mL 3-MBPD、2.000 μg/mL D5-3-

從圖1A可以看出，3-MBPD-PBA和D5-3-MCPD-PBA在該GC-MS分析條件下的出峰時(shí)間分別為19.4 min和17.6 min，兩種物質(zhì)的響應(yīng)較好，且分離度良好。從圖1B、圖1C可以看出：D5-3-MCPD-PBA的特征離子為m/z150.1、201.0、93.0，其中m/z150.1的響應(yīng)最高；3-MBPD-PBA 的特征離子為m/z147.1、240.0、91.0，其中m/z147.1的響應(yīng)最高。因此，可采用選擇離子監(jiān)測模式對D5-3-MCPD-PBA和3-MBPD-PBA進(jìn)行定性分析，以降低噪聲和其他干擾效應(yīng)，提高檢測靈敏度。其中：D5-3-MCPD-PBA定量離子m/z150，定性離子m/z201、93；3-MBPD-PBA定量離子m/z147，定性離子m/z240、91。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

采用正交實(shí)驗(yàn)對3-MBPD與PBA的衍生反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。通過分析實(shí)驗(yàn)條件和前期單因素實(shí)驗(yàn)，在GEs質(zhì)量濃度為21.78 μg/mL條件下，以PBA用量、衍生溫度和衍生時(shí)間為因素，3-MBPD-PBA峰面積為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表3 方差分析

從表2可以看出，各因素對3-MBPD-PBA峰面積影響的主次順序?yàn)锳>C>B，最佳因素水平組合為A1B2C2，即PBA用量為100 μL，衍生溫度為50℃，衍生時(shí)間為10 min。

從表3可以看出，各因素對3-MBPD-PBA峰面積影響的主次順序?yàn)锳>C>B，與極差分析結(jié)果一致。因素A和因素C對響應(yīng)值有顯著性影響(P<0.05)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

GEs在0.021 8～2.178 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為y=4.255x-0.048 9，相關(guān)系數(shù)(R)為0.999 9。在該分析條件下，儀器信噪比為41，以3倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限，可確定檢出限為25 μg/kg。結(jié)果表明，本方法的線性關(guān)系良好，檢出限能滿足食用植物油中GEs的測定要求。

2.4 精密度和回收率

選取葵花籽油作為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。在3個(gè)不同水平上進(jìn)行加標(biāo)，分別進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到GEs的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。

表4 基質(zhì)加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表4可知，3個(gè)不同水平加標(biāo)的平均回收率范圍為91.4%～97.0%，RSD小于10%，準(zhǔn)確度和精密度良好。這說明本實(shí)驗(yàn)所確定的前處理步驟和衍生化條件，適用于植物油中GEs的測定，測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求，可應(yīng)用于植物油中GEs的測定。

2.5 樣品測定

分別選取市售的10種食用植物油產(chǎn)品，按1.2.1、1.2.3方法進(jìn)行GEs含量的測定，每個(gè)樣品平行測定2次，取平均值，結(jié)果見表5。

表5 10種食用植物油樣品中GEs的含量 mg/kg

從表5可以看出，10個(gè)食用植物油樣品中9個(gè)樣品檢出GEs，GEs的檢出率高達(dá)90%，含量為0.073～0.873 mg/kg。歐盟EU 2018/290對植物油中GEs限量標(biāo)準(zhǔn)為1.0 mg/kg，參照歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)可知，食用植物油中GEs的污染水平相對較高，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，這可能與食用植物油的生產(chǎn)過程和工藝有關(guān)，其中油脂精煉過程中的脫臭工藝是GEs產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)[11]。因此，建立準(zhǔn)確可靠的測定方法用于監(jiān)測食用植物油中GEs含量，控制GEs的污染風(fēng)險(xiǎn)，確保食用植物油的安全，是十分必要和緊迫的。

3 結(jié) 論

本文建立了同位素內(nèi)標(biāo)-氣相色譜-質(zhì)譜法用于食用植物油中GEs含量的測定。采用正交實(shí)驗(yàn)對衍生條件進(jìn)行優(yōu)化，確定3-MBPD與PBA的最佳衍生條件為GEs質(zhì)量濃度為21.78 μg/mL時(shí)，PBA用量100 μL，衍生溫度50℃，衍生時(shí)間10 min。本方法的檢出限為25 μg/kg，平均加標(biāo)回收率為91.4%～97.0%，RSD為4.4%～8.6%。方法可操作性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均能滿足實(shí)際工作中食用植物油中GEs的定性定量檢測，可為食用植物油中GEs含量的檢測標(biāo)準(zhǔn)制定和GEs風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供重要依據(jù)。