趙海紅 ，郭泰，王志新，鄭偉，李燦東，徐杰飛，張振宇，趙星棋，王士強(qiáng)

（1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，黑龍江佳木斯 154007；2黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

0 引言

大豆是目前全世界種植面積相對(duì)比較大的作物之一，大豆作為重要的食品、飼料和工業(yè)原料，在人類(lèi)的生產(chǎn)和生活中發(fā)揮著重要的作用。2017 年中國(guó)大豆播種面積為819.4萬(wàn)hm2，較上年增加13.8%，全國(guó)大豆平均單產(chǎn)為1817 kg/hm2，較上年增加1.2%[1]，這些大豆主要用于國(guó)民食用。然而，據(jù)估計(jì)，中國(guó)國(guó)內(nèi)飼料用糧需求在3.8億～4.0億t，而目前飼料用糧僅為2.7億t，飼料糧缺口較大[2]，可見(jiàn)，中國(guó)對(duì)大豆的需求急需解決。2017 年中國(guó)大豆進(jìn)口量就約為9553 萬(wàn)t[3]，而且多年來(lái)，中國(guó)大豆市場(chǎng)供給高度依賴(lài)進(jìn)口，且進(jìn)口渠道較為集中，美國(guó)作為中國(guó)大豆第二大進(jìn)口國(guó)，2018年以來(lái)，卻與中國(guó)的貿(mào)易摩擦不斷升級(jí)[4]。振興中國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)勢(shì)在必行。因此，必須通過(guò)大豆品種改良、機(jī)械化生產(chǎn)、規(guī)?；N植等多種途徑，持續(xù)提高中國(guó)大豆單產(chǎn)及品質(zhì)，為改善中國(guó)大豆種植提供技術(shù)保障。那么，研究大豆在特定條件下的基因表達(dá)模式，對(duì)于開(kāi)發(fā)和利用大豆種質(zhì)資源也就十分必要，全基因組重測(cè)序工作對(duì)大豆育種及相關(guān)分子生物學(xué)研究意義重大。

2010年，大豆基因序列的揭示[5]，對(duì)于開(kāi)展大豆靶向性分子育種、聚合育種，高效精準(zhǔn)地培育大豆新品種及創(chuàng)制新種質(zhì)具有極大的促進(jìn)作用，基因測(cè)序?yàn)榱私獯蠖够蚪M的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化提供了寶貴資源[6]，有利于大豆的農(nóng)藝性狀的分析，利用基因測(cè)序研究成果可選育出高抗病、抗多種病害、抗除草劑、高品質(zhì)、高產(chǎn)量的新品種[7-8]，極大豐富大豆品種類(lèi)型，大大縮短育種周期的同時(shí)，為基于測(cè)序技術(shù)的大豆分子育種打好堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，使農(nóng)民增產(chǎn)增收增效的同時(shí)，增強(qiáng)中國(guó)大豆生產(chǎn)在國(guó)際市場(chǎng)上的地位。

1 基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展

基因測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，已經(jīng)從第一代發(fā)展到第四代[9]。

1.1 第一代測(cè)序技術(shù)

1977年Maxam和Gibert[10]報(bào)道了通過(guò)化學(xué)降解測(cè)定DNA序列的方法，由于該方法程序復(fù)雜、操作繁瑣，后來(lái)逐漸被Sanger 法取代。隨后，在Sanger技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展起來(lái)的熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)是應(yīng)用最為廣泛的第一代測(cè)序技術(shù)[9]。該測(cè)序技術(shù)測(cè)序精確，但通量較低，成本高，后來(lái)逐漸被二代測(cè)序技術(shù)取代。

1.2 第二代測(cè)序技術(shù)

2004 年，隨著Roche 公司首次推出以高通量低成本為主要特點(diǎn)的測(cè)序平臺(tái)，生物學(xué)研究正式進(jìn)入了以二代測(cè)序?yàn)楹诵臏y(cè)序手段的時(shí)代[11]。第二代測(cè)序技術(shù)采用的策略是邊合成邊測(cè)序，依照Sanger 測(cè)序原理，捕捉末端熒光標(biāo)記來(lái)確定DNA 序列[12]。其最顯著的特征是高通量、低成本、自動(dòng)化程度高，能在很短的時(shí)間內(nèi)完成上百億個(gè)堿基對(duì)的測(cè)序，一次能對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)序，滿(mǎn)足極短時(shí)間內(nèi)對(duì)基因組進(jìn)行高分辨率檢測(cè)的要求[13]。

1.3 第三代測(cè)序技術(shù)

鑒于一代和二代測(cè)序存在依賴(lài)于模板擴(kuò)增以及產(chǎn)生的序列較短等缺點(diǎn)，在需要進(jìn)行組裝，比對(duì)以及注釋等生物信息學(xué)分析時(shí)存在著很大的困難[14]，為了補(bǔ)充和進(jìn)一步完善測(cè)序技術(shù)，近幾年研發(fā)出第三代的測(cè)序方法—單分子測(cè)序技術(shù)(Single-molecule Sequencing)，主要包括生物科學(xué)公司的Heli Scope單分子測(cè)序儀[15]、太平洋生物科學(xué)公司的單分子實(shí)時(shí)DNA 測(cè)序技術(shù)(Single-molecule Real-time，SMRT) 和 Oxford Nanopore 公司的單分子納米孔測(cè)序技術(shù)(The Singlemolecule Nanopore DNA Sequencing)[16]等?，F(xiàn)階段大多數(shù)的研究還采用第二代和第三代測(cè)序數(shù)據(jù)的結(jié)合使用，這能夠有效的解決由二代測(cè)序本身局限所導(dǎo)致的研究難題。

1.4 第四代測(cè)序技術(shù)

英國(guó)牛津納米公司研發(fā)的MinION測(cè)序儀是基于納米孔單分子測(cè)序技術(shù)的第四代測(cè)序技術(shù)，其體積比普通U盤(pán)稍大，攜帶十分方便，MinION默認(rèn)運(yùn)行時(shí)間為48 h，其標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別速度為一秒鐘識(shí)別250 個(gè)堿基(250 bps)[17]，運(yùn)行2 min產(chǎn)生的數(shù)據(jù)就可以用于相關(guān)分析，平均讀長(zhǎng)可以達(dá)到13～20 kb[18]，通過(guò)提高測(cè)序深度，MinION測(cè)序可以達(dá)到98%的準(zhǔn)確率[19]。但是生物納米孔使用的脂基質(zhì)，其機(jī)械穩(wěn)定性較弱，反復(fù)洗滌會(huì)降低測(cè)序芯片的使用壽命[20]。

2 全基因組重測(cè)序在大豆育種中的應(yīng)用

近年來(lái)基因組重測(cè)序也越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于物種進(jìn)化研究和育種研究領(lǐng)域[21,26-31]。2002 年水稻全基因組計(jì)劃率先宣布完成[22]。在隨后幾年里，科學(xué)家們先后完成了包括黃瓜[23]、玉米[24]、高粱[25]、大豆[5]等物種的全基因組測(cè)序，而后，通過(guò)基因組重測(cè)序從更多的角度來(lái)研究作物育種學(xué)，比如發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)[26-27]，揭示進(jìn)化關(guān)系[28]、挖掘功能基因[29-30]、分子輔助選擇育種[31]等，這加快了優(yōu)質(zhì)新品種的培育進(jìn)程。全基因組重測(cè)序技術(shù)逐漸成為重要的育種手段。

在大豆育種研究中，開(kāi)發(fā)誘變?nèi)后w、獲得有感興趣的變異表型的突變株之后，傳統(tǒng)的正向遺傳學(xué)方法往往是通過(guò)構(gòu)建F2分離群體、重組自交系等方法定位與表型相關(guān)的基因，要連續(xù)選育多代，工作量大而且周期較長(zhǎng)。通過(guò)全基因組重測(cè)序等反向遺傳學(xué)手段，可以快速發(fā)現(xiàn)與表型相關(guān)的基因位點(diǎn)，加快育種進(jìn)程。

大豆基因序列的揭示[5]后，2010 年Lam 等[32]對(duì)31份大豆包括野生種和栽培種進(jìn)行全基因組重測(cè)序，共獲得205614個(gè)SNP位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)在野生大豆中等位基因多態(tài)性水平要明顯高于栽培大豆。

2012 年李澤鋒[33]利用二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)來(lái)自中國(guó)江南的一個(gè)野生大豆基因組（‘蘭溪1 號(hào)’，Lanxi1）進(jìn)行了深度測(cè)序(＞50X)，發(fā)現(xiàn)‘蘭溪1號(hào)’相對(duì)其他北方野生大豆來(lái)說(shuō)，與栽培大豆親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，這有可能暗示出大豆是從中國(guó)北方開(kāi)始馴化的。

2015 年Zhou 等[34]人通過(guò)對(duì)302株野生大豆、地方品種和馴化品種大豆進(jìn)行大于11X 深度的高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)979萬(wàn)個(gè)SNPs，87.68萬(wàn)個(gè)Indels，還有1614個(gè)CNVs和6388個(gè)大片段缺失。發(fā)現(xiàn)230個(gè)受選擇區(qū)域和162個(gè)拷貝數(shù)變異。全基因組關(guān)聯(lián)分析表明10個(gè)受選擇區(qū)域和9個(gè)馴化性狀相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)13個(gè)被注釋為與油脂、株高等農(nóng)藝性狀相關(guān)的位點(diǎn)。與之前QTL定位結(jié)果比較分析發(fā)現(xiàn)，230 個(gè)受選擇區(qū)域中96 個(gè)與調(diào)控油脂的QTL相關(guān)，21個(gè)區(qū)間內(nèi)包含脂肪合成關(guān)鍵基因。

2016年張彥威[6]等對(duì)大豆品種‘齊黃34’進(jìn)行全基因組重測(cè)序，共檢測(cè)到1519494個(gè)SNP位點(diǎn)，357549個(gè)小片段InDel位點(diǎn)，4506個(gè)結(jié)構(gòu)變異，為分子標(biāo)記輔助選擇提供了重要的標(biāo)記資源。同年，33份栽培品種和68 份野生大豆品種這兩個(gè)基因的序列被分析[35]，顯示野生型大豆中大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)抗性等位基因缺失，大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)抗性基因可能是在大豆馴化過(guò)程中人工選育出來(lái)的。

2017年周航[36]對(duì)細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有反向調(diào)節(jié)作用的GmAP1.2基因在大豆中的功能進(jìn)行了研究，探討了其與GmARR10 的差別，為大豆抗逆和開(kāi)花基因的發(fā)掘應(yīng)用以及大豆分子育種提供了理論依據(jù)。

2018年葛逢勇[37]通過(guò)表型鑒定在大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)表現(xiàn)廣譜抗性的PI437654突變?nèi)后w中，獲得對(duì)大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)4 號(hào)生理小種侵染表型發(fā)生變化的序列初步分析，以期后續(xù)研究最終鑒定出大豆抗大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)4號(hào)生理小種基因。同年，張峰閣[38]研究表明，突變體ZK1917 和‘黑農(nóng)35’在Dt2 和GmSOC1CDS 區(qū)未發(fā)生變異，通過(guò)對(duì)Dt1/Dt2/GmSOC1表達(dá)量的監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)目的基因可能在V2 期生長(zhǎng)點(diǎn)通過(guò)影響GmSOC1 與Dt1的結(jié)合作用，從而釋放Dt1 的表達(dá)，進(jìn)而影響結(jié)莢習(xí)性。

此外，通過(guò)全基因組重測(cè)序技術(shù)，對(duì)大豆矮桿基因[39]、大豆根中磷酸鹽缺乏的響應(yīng)基因[40]、對(duì)黑豆抗胞囊線(xiàn)蟲(chóng)基因[41]等進(jìn)行了相關(guān)研究，為大豆分子育種提供了理論依據(jù)。

3 展望

隨著第三代、第四代測(cè)序技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，將來(lái)測(cè)序成本會(huì)大幅度降低，測(cè)序的通量和準(zhǔn)確性也會(huì)不斷提高，高通量測(cè)序技術(shù)將成為一項(xiàng)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)這一方法，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在應(yīng)用中遇到的一些問(wèn)題將迎刃而解，比如大豆的許多經(jīng)濟(jì)性狀是數(shù)量性狀，受微效多基因控制，而且基因數(shù)量龐大，分離目的基因困難；外源DNA 直接導(dǎo)入，一般導(dǎo)入的是總DNA，缺乏標(biāo)記基因，鑒定難度大；轉(zhuǎn)化后表達(dá)基因的調(diào)控、標(biāo)記基因的去除等，這些目前研究熱點(diǎn)問(wèn)題將會(huì)得到有效地解決。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，全基因組重測(cè)序技術(shù)必將會(huì)在大豆育種中大顯身手。最終人類(lèi)將會(huì)突破了自然資源的限制，按照需要選擇基因，更進(jìn)一步的改造大豆的遺傳物質(zhì)，賦予其新的性狀，大幅度提高了大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，使大豆可能同時(shí)具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲(chóng)、抗寒、抗旱、抗除草劑等多重優(yōu)點(diǎn)。大豆育種已進(jìn)入了新的時(shí)期。