劉曉蕾 張艷 禮海 王懿 周雪 陳菲

[摘要] 目的 分析參草通脈顆粒對慢性心力衰竭（CHF）大鼠抗心室重構的作用機制。 方法 選取SPF級大鼠60只，隨機抽取10只大鼠作為正常組，其余50只大鼠制備CHF大鼠模型，造模死亡9只，將剩余41只，隨機分為模型組13只、參草通脈顆粒組14只、賴諾普利組14只。正常組和模型組大鼠不用藥，賴諾普利組和參草通脈顆粒組大鼠連續(xù)給藥42 d。采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白質印跡（WB）法測定基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）和金屬蛋白酶組織抑制物-1（TIMP-1）的mRNA和蛋白表達。 結果 與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組MMP-1 mRNA和蛋白均降低，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）;與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組MMP-1 mRNA表達降低（P < 0.05），而MMP-1蛋白表達升高（P < 0.05）。與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組TIMP-1 mRNA和蛋白均增加，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）;與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組TIMP-1 mRNA和蛋白表達增加（P < 0.05）。 結論 參草通脈顆粒治療CHF大鼠效果顯著，具有抗心室重構的作用。

[關鍵詞] 慢性心力衰竭;參草通脈顆粒;基質金屬蛋白酶-1;金屬蛋白酶組織抑制物-1

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（c）-0008-04

Effects of Shencao Tongmai Granules on the mechanism of anti-ventricular remodeling in rats with chronic heart failure

LIU Xiaolei1? ?ZHANG Yan2? ?LI Hai1? ?WANG Yi1? ?ZHOU Xue1? ?CHEN Fei1

1.Department of Medical， Shenyang Second Hospital of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Province， Shenyang? ?110015， China; 2.Expert Consultation， Affiliated Hospital， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Province， Shenyang? ?110015， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of Shencao Tongmai Granules on anti-ventricular remodeling in rats with chronic heart failure （CHF）. Methods A total of 60 SPF rats were selected and ten rats were randomly taken as normal group. The other 50 rats were used to prepare the CHF rat model. In the process of modeling， nine rats failed to survive and the remaining 41 rats were divided into the model group （13 rats）， the Shencao Tongmai Granules group （14 rats） and the Lisinopril group （14 rats） randomly. Rats in normal group and the model group were fed normally without drugs and rats in Lisinopril group? and Shencao Tongmai Granules group were given drugs consecutively for 42 d. Reverse transcription PCR （RT-PCR） and Western blot （WB） were adopted to determine the mRNA and protein expression of matrix metalloproteinase-1 （MMP-1） and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 （TIMP-1）. Results Compared with the model group， the mRNA and protein expressions of MMP-1 in the Shencao Tongmai Granules group and Lisinopril group were reduced， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. Compared with the Lisinopril group， the MMP-1 mRNA expression of the Shencao Tongmai Granules group was decreased （P < 0.05）， while MMP-1 protein expression was increased （P < 0.05）. Compared with the model group， the mRNA and protein expressions of TIMP-1 in the Shencao Tongmai Granules group and Lisinopril group both increased， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. Compared with the Lisinopril group， the mRNA and protein expressions of TIMP-1 in the Shencao Tongmai Granules group were increased （P < 0.05）. Conclusion Shencao Tongmai Granules have a significant therapeutic effect on treating rats with CHF and can promote the mechanism of anti-ventricular remodeling.

[Key words] Chronic Heart Failure; Shencao Tongmai Granules; Matrix metalloproteinase-1; Tissue inhibitor of metalloproteinase-1

慢性心力衰竭（CHF）是以舒縮功能障礙為主的嚴重的臨床綜合征[1]。長期應用常規(guī)西藥治療可出現(xiàn)諸多不良反應[2]。參草通脈顆粒是臨床應用30余年治療CHF的經(jīng)驗方，通過多年的臨床觀察和試驗，參草通脈顆粒對CHF患者療效確切[3]。本實驗從基因和蛋白表達兩方面，分析參草通脈顆粒對CHF的療效機制和作用靶點，為臨床治療CHF提供可靠依據(jù)，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取體重為300～350 g，15周齡，SPF級SD雄性大鼠60只[由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，合格證號：201703120]，本研究經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物制備

賴諾普利片（規(guī)格：10 mg/片，批號：H20131015），由上海信誼萬象藥業(yè)生產(chǎn)。參草通脈顆粒組成：丹參、人參、黃芪、紅花、三七粉、益母草、茯苓、葶藶子（由本溪三藥有限公司生產(chǎn)，批號：遼藥制Z0901013），處方中的全部藥材均符合參照《中國藥典》[4]2010版有關規(guī)定。

1.3 實驗試劑和儀器

基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）、金屬蛋白酶組織抑制物-1（TIMP-1）聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒（XG-E1088，大連TaKaRa公司）;實時熒光定量PCR儀（A-2060-1，Bioneer公司）;PCR擴增儀（96G，Biometra公司）;全自動蛋白印跡（WB）分析儀（SW1022-ProfiBlot 48型，Bioneer公司）。

1.4 CHF大鼠動物模型制備

大鼠正常條件下適應喂養(yǎng)7 d后，為全部動物編號后隨機抽取10只大鼠作為正常組，大鼠正常飼養(yǎng)。其余大鼠禁食不禁水12 h后，麻醉，氣管插管，連接呼吸機，消毒后在左側第3、4肋間橫向切開長1～2 cm，用縫合線結扎距離左冠脈前降支起始點2～3 mm處，心電圖提示胸導ST段和T波出現(xiàn)明顯異常，將心臟送回胸腔，用注射用青霉素鈉（哈藥集團制藥總廠，批號：H23021439，規(guī)格：800 000 U/支）在手術切口處敷用，大鼠生命體征平穩(wěn)后，撤掉呼吸機。術后連續(xù)3 d應用注射青霉素鈉300 000 IU，1次/d。正常飼養(yǎng)1周后，喂養(yǎng)飼料減少1/2;同時大鼠每天進行1次力竭式游泳，連續(xù)4周。當大鼠出現(xiàn)毛色無光澤、精神萎靡、一般狀態(tài)較差，經(jīng)超聲檢測左室射血分數(shù)（LVEF）≤60%，判定為大鼠CHF造模成功[5]。

1.5 實驗分組與給藥

大鼠造模死亡9只，將剩余41只大鼠，按照體重大小依次排序編號，采用隨機數(shù)字表求余數(shù)法將其分為3組，分別是模型組13只、參草通脈顆粒組14只、賴諾普利組14只。正常組10只為正常喂養(yǎng)未手術造模的大鼠。正常組和模型組大鼠不用藥，灌胃生理鹽水10 mL/kg，1次/d。其余組大鼠用藥劑量，按人鼠劑量換算公式，藥品劑量（g/kg）=人口服劑量（g）×0.018/動物體重（kg）[6]，計算出賴諾普利組：1.5 mg生藥/（kg·d），參草通脈顆粒組：9.2 g生藥/（kg·d），兩組藥溶于3 mL蒸餾水中，進行灌胃1次/d，各組連續(xù)給藥42 d。

1.6 實驗取材

大鼠麻醉、處死，取其心肌組織，每只大鼠心肌組織按照標準處理分成兩份，每份100 mg，放入液氮 -80℃條件下保存，用于逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和WB技術檢測MMP-1和TIMP-1含量。

1.7 RT-PCR試驗

①TRIzol法抽提總RNA;②測定RNA濃度和純度;③逆轉錄合成cDNA;④進行PCR擴增;⑤PCR擴增應用ABI 7500擴增儀，PCR反應條件為預變性95℃，0.5 min，1個循環(huán);變性95℃，0.05 s，退火60℃，34 s，延伸95℃，0.15 s，共40個循環(huán)，終延伸60℃，1 min;⑥利用Prime 5.0軟件設計引物序列、擴增產(chǎn)物長度。引物序列一覽表見表1。

1.8 WB試驗

取出心肌組織100 mg，塊剪碎后，以12 000 r/min，離心半徑為8 cm下，離心5 min，吸取上清提取蛋白;測定蛋白濃度;蛋白變性;灌制濃縮膠和分離膠;電泳;轉印120 min，TTBS洗膜1次，封閉;一抗孵育：加入1∶400的一抗，置于20～25℃，2 h;二抗孵育：加入堿性磷酸酶標記的1∶2000二抗，20～25℃，2 h;清洗;顯色;采用FlourChem V 2.0凝膠成像分析軟件（America）分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，分析定量。

1.9 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間樣本比較應用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織MMP-1 mRNA和蛋白的表達

與正常組比較，模型組MMP-1 mRNA和蛋白表達升高（P < 0.01）;與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組MMP-1 mRNA和蛋白均降低（P < 0.01）;與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組MMP-1 mRNA表達量降低（P < 0.05），而MMP-1蛋白表達升高（P < 0.05）。見表2。

2.2 各組大鼠心肌組織TIMP-1 mRNA和蛋白的表達

與正常組比較，模型組TIMP-1mRNA和蛋白表達下降（P < 0.01）;與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組TIMP-1 mRNA和蛋白均增加（P < 0.01）;與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組TIMP-1 mRNA和蛋白表達增加（P < 0.05）。見表3。

3 討論

CHF發(fā)生的基本機制是心室重構，而細胞外基質（ECM）的結構和成分的改變、合成和降解的失衡，是導致心室重構的重要原因[7]。基質金屬蛋白酶（MMPs）對ECM有很高親和力，能特異地降解ECM[8]。金屬蛋白酶組織抑制物（TIMPs）可以抑制MMPs的活性，在正常心肌組織中，MMPs與TIMPs保持著動態(tài)平衡，共同維持著ECM合成與降解的平衡[9]。在衰竭的心肌組織中，MMPs活性升高導致纖維膠原降解、ECM重構[10]。MMP-1是MMPs的一種，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原[11]。TIMP-1與MMP-1有高度親和力，研究發(fā)現(xiàn)敲除TIMP-1的小鼠，心肌膠原含量下降，左室?guī)缀涡螤畎l(fā)生改變[12]。MMP-1與TIMP-1在正常組織中保持動態(tài)平衡，共同協(xié)調(diào)ECM的合成與降解，維持心肌組織結構的完整性[13]。心衰的心臟中，MMP-1活性持續(xù)增高，TIMP活性降低，致使ECM合成與降解比例失調(diào)，心肌膠原纖維代謝紊亂，最終導致心室重構的發(fā)生[14]。因此調(diào)節(jié)心肌MMP1與TIMP-1的表達和活性，成為控制心衰進展中心臟基質的組織修復和再生的重要治療手段[15]。

參草通脈顆粒是多年臨床治療CHF的經(jīng)驗方，試驗結果證明參草通脈顆?？擅黠@改善患者心功能分級，提高LVEF[3]。藥理學研究表明[16]，黃芪可改善心肌舒縮功能、抑制纖維化。人參可降低心肌膠原含量，減少心肌纖維化程度，延緩心室重構[17-18]。紅花具有興奮心臟的作用，能增加冠狀動脈血流量、改善心肌缺血[19]。丹參可抑制Ca2+內(nèi)流，阻止心肌肥厚信號傳導[20]。益母草對心肌肥厚具有一定的抑制作用[21]。三七可提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性、改善離子轉運、抑制心肌膠原增生[22]。葶藶子和茯苓均具利尿消腫的作用[23-24]。

本研究結果顯示，與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組MMP-1的基因和蛋白表達均降低，TIMP-1的mRNA和蛋白表達升高。與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組MMP-1的mRNA表達下降和TIMP-1 mRNA和蛋白表達升高，MMP-1蛋白表達升高。

綜上所述，參草通脈顆粒能夠抑制MMP-1表達，上調(diào)TIMP-1表達，增強TIMP-1對MMP-1的抑制作用，調(diào)節(jié)ECM合成與降解比例，維持心肌膠原蛋白的形態(tài)和結構，阻止室壁變薄和心室擴張，具有抗心室重構的作用。

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（收稿日期：2020-04-16）

[基金項目] 國家自然科學基金資助項目（81774157）。

[作者簡介] 劉曉蕾（1983.6-），女，碩士;研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管疾病。

[通訊作者] 張艷（1960.10-），女，博士，主任醫(yī)師，博士生導師;研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管疾病。