王威麗，宋滄桑，張 陽，宋文彬，毛盼盼

(1.昆明市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，云南 昆明 650000; 2.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000)

華法林是香豆素類抗凝血藥的主要代表藥品[1]。因具有充足的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)、確切的治療效果以及低廉的價格，華法林已被廣泛應(yīng)用于臨床抗凝治療中。前期的研究結(jié)果表明，華法林不但能有效地降低心房顫動患者腦卒中發(fā)生率，而且使心肌梗死所導(dǎo)致的死亡風(fēng)險降低約24%[2]。然而，由于華法林狹窄的治療范圍、較高的出血風(fēng)險以及藥物反應(yīng)的個體差異，至今該藥的使用仍然困擾著許多臨床醫(yī)師。近年來，隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步以及藥物基因組學(xué)的日益完善，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)對于藥物代謝的探索一步步走向精準(zhǔn)化，越來越多的藥物代謝機制可通過基因組學(xué)進(jìn)行解釋。臨床研究結(jié)果已證實，華法林相關(guān)蛋白多態(tài)性與其個體間維持劑量的差異、療效以及不良反應(yīng)關(guān)系密切。采用藥物基因組學(xué)來解釋華法林抗凝作用的有效性及安全性是目前臨床研究的新興領(lǐng)域[3]。因此，本文詳細(xì)地綜述了華法林相關(guān)基因多態(tài)性以及臨床應(yīng)用等方面，為今后華法林的個體化抗凝治療提供理論基礎(chǔ)。

1 華法林的作用機制與藥動學(xué)

血栓的形成是一種漸進(jìn)的過程，需多種凝血因子的共同參與。體內(nèi)含谷氨酸殘基的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C、S、Z均需通過γ-谷氨?；然?gamma glutamyl carboxylase，GGCX)進(jìn)行γ-羧化，使得無活性的凝血因子被激活[4]。氫醌型維生素K(reduced vitamine K,VitKH2)是GGCX必不可少的輔助因子。在羧化的過程中，VitKH2可被氧化成環(huán)氧型維生素K(oxidized vitamine K，VitKO)，但在維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物(vitamin K epoxide reductase complex，VKORC)以及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的催化作用下，VitKO又可被還原為VitKH2[5]?？鼓幦A法林可競爭性地與VKORC結(jié)合，阻礙VitKO的還原，使得凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C、S、Z只能在沒有活性的前體階段停留，從而發(fā)揮其較強的抗凝活性，見圖1[6]。但是，這一過程并不能影響已經(jīng)活化的凝血因子，所以華法林并不具有體外抗凝作用[7]。

圖1 華法林的作用機制Fig 1 Mechanism of Warfarin

華法林是一種消旋體混合物，由R-華法林和S-華法林2種光學(xué)同分異構(gòu)體構(gòu)成，S-華法林的藥理活性強于R-華法林(約3～5倍)，其中85%以上的S-華法林主要經(jīng)CYP2C9代謝[8]。據(jù)報道，華法林的生物利用度較高，口服給藥后24 h可在血漿中被檢測出來，72～96 h達(dá)到血藥濃度的峰值。其在血液循環(huán)的過程中與血漿蛋白結(jié)合率高達(dá)98%～99%[9]。該藥的消除半衰期(t1/2β)為44～60 h，因此，口服3 d后其抗凝療效才能發(fā)揮至最佳[10]。但值得注意的是，患者服用華法林后，凝血因子Ⅶ由于半衰期較短在體內(nèi)消除很快，因此，早期(24～48 h)測定的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)并不能真實地反應(yīng)患者的抗栓情況，而是反應(yīng)體內(nèi)凝血因子Ⅶ含量的主要表達(dá)[11]。另外，Schindler等[12]經(jīng)研究也發(fā)現(xiàn)，華法林可通過胎盤屏障，胎兒血漿中的華法林濃度與母體較為接近，但從母乳中并沒有發(fā)現(xiàn)活性華法林的存在。因此，妊娠期婦女禁止服用華法林，但哺乳期婦女服用該藥則相對安全。

2 華法林的基因多態(tài)性

2.1 CYP2C9基因多態(tài)性

CYP2C9是華法林在肝代謝中最重要的酶之一，編碼該酶的CYP2C9基因具有高度的多態(tài)性，其多態(tài)性主要取決于編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)[13]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了58種可改變代謝酶結(jié)構(gòu)、影響代謝酶活性，最終導(dǎo)致華法林代謝能力發(fā)生改變的SNP，分別以CYP2C9*1—CYP2C9*58進(jìn)行命名，其中研究最廣泛的2種等位基因是CYP2C9*2和CYP2C9*3[14]。據(jù)報道，若上述2種等位基因發(fā)生突變，則會增加整個治療過程中的出血風(fēng)險，特別是剛開始使用華法林治療時的前3～6個月，其出血風(fēng)險約為野生型的1.18倍，若長期使用華法林治療，患者的出血風(fēng)險還會持續(xù)增加[15]。越來越多的證明強調(diào)，CYP2C9*1是最常見的野生型等位基因，酶代謝活性正常；攜帶突變型CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因患者的酶活性明顯低于攜帶CYP2C9*1的個體，即與正常代謝者相比，攜帶突變型等位基因的人群對華法林更加敏感，過度抗凝和出血的風(fēng)險更高，達(dá)到同等抗凝水平時所需華法林的劑量更低[16-17]。CYP2C9*2等位基因在亞洲人群中幾乎很少出現(xiàn)，但在高加索人群中，其突變的頻率較高，可達(dá)12%；亞洲人群主要發(fā)現(xiàn)的是CYP2C9*3突變體，突變頻率約為1%～4%[18]。

2.2 VKORC1基因多態(tài)性

1974年首次發(fā)現(xiàn)的維生素K環(huán)氧化物還原酶(vitamin K epoxide reductase，VKOR)，是維生素K代謝循環(huán)中的限速酶，也是華法林發(fā)揮抗凝作用的靶點酶，該酶的活性將直接影響華法林的抗栓水平[19]。2004年，VKOR編碼的基因VKORC1被進(jìn)一步證實，該基因上存在多個SNP位點，包括VKORCl-1639(G>A)、VKORCl-1173(C>T)和VKORCl-3730(G>A)等，其中VKORCl-1639(G>A)是影響華法林劑量的核心位點[20]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶GG、GA基因型的患者所需華法林的維持劑量分別是攜帶AA基因型患者的1.7、2.4倍[21]。也就是說，與攜帶突變純合基因型(AA)的患者相比，VKORC1-1639 GA和GG型攜帶者INR達(dá)標(biāo)時間相對要長，且INR達(dá)到目標(biāo)范圍時所需華法林的總量也較高。由此說明，患者所需華法林的維持劑量與其攜帶G等位基因成正相關(guān)[22]。且該等位基因在不同種族間分布頻率有所不同，亞洲人群的突變頻率比較高，VKORCl-1639 AA、GA和GG基因型頻率分別為80.4%、18.3%和1.3%，而VKORCl-1639 AA(16.3%)、GA(48.9%)、GG(36.7%)基因型在高加索人群中也很常見[23]。

2.3 CYP4F2基因多態(tài)性

CYP4F2是一種維生素K環(huán)氧化物酶，參與維生素K的肝臟代謝，是影響華法林藥效學(xué)的另一種重要遺傳因素[24]。有研究報道，CYP4F2通過羥基化維生素K的苯基基團，使還原型維生素K生成減少，從而抑制凝血因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ)的合成，發(fā)揮抗凝作用[25]。若CYP4F2基因位點19p13.12發(fā)生突變，將會削弱體內(nèi)維生素K氧化酶活性，導(dǎo)致還原型維生素K濃度相對增加，進(jìn)而影響患者對華法林劑量的需求[26]。一項回顧性研究結(jié)果表明，攜帶CC基因型的患者每日處方中華法林劑量顯著低于攜帶CT/TT基因型的患者(TT型>CT型>CC型)[27]。也就是說，攜帶CYP4F2突變基因的人群需增加華法林的使用劑量才能達(dá)到相同的抗凝效果。隨后，熊筱偉等[28]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在初始采用華法林治療的7 d內(nèi)，與攜帶CT/TT基因型的患者相比，CYP4F2 CC基因型攜帶者所需華法林的維持劑量更低，進(jìn)入INR目標(biāo)范圍所需時間更短，且受到其他因素的影響更小?？偠灾瑪y帶CC基因型的患者對華法林的抗栓治療具有較高的敏感性。

2.4 GGCX基因多態(tài)性

GGCX為維生素K依賴性羧化酶，常表達(dá)在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體上，通過羧化維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ上的γ-谷氨酸殘基，促進(jìn)功能性凝血因子的激活，從而產(chǎn)生凝血作用。臨床研究結(jié)果表明，華法林可直接抑制還原型維生素K的再生，阻止凝血因子的生物合成，進(jìn)而發(fā)揮抗凝療效[29]。迄今為止，已知的SNP位點中，GGCX rs12714145(3261G>A)、rs11676382(12970C>G)和rs69964(974G>A)可能與華法林的穩(wěn)定劑量相關(guān)[30]。黃盛文等[31]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶GGCX(rs12714145)GG基因型的群體所需華法林劑量顯著低于AA基因型的攜帶者。但在另一項研究中，其結(jié)果卻與之相反[32]。此外，仍有報道表明，與攜帶CC基因型的患者相比，具有GGCX(rs11676382)G等位基因(GG/GC)的患者所需華法林的日處方量更低；同時，GGCX基因rs12714145和rs69964 2個多態(tài)性位點可能并不是影響華法林維持劑量的重要性決定因素[33]。總而言之，目前GGCX基因多態(tài)性的作用對我國人群的影響尚缺乏統(tǒng)一的觀點。這可能是由于缺乏重視度，研究較少所造成的，需精心設(shè)計大規(guī)模的前瞻性臨床試驗，進(jìn)一步證實其中的關(guān)聯(lián)。

2.5 載脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)基因多態(tài)性

APOE是血漿脂蛋白的重要組成部分，可將在小腸內(nèi)吸收的維生素K轉(zhuǎn)運至肝臟中再經(jīng)受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用進(jìn)行清除。位于19號染色體上的APOE存在著E2、E3、E4 3種常見的等位基因，分別由E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4和E4/E4 6種表型構(gòu)成。其中，亞洲人群的APOE基因型多為E3/E3(野生型)[34]。研究結(jié)果表明，攜帶E4等位基因患者的脂蛋白在肝臟中的吸收速度相對較快，繼而促進(jìn)了維生素K對凝血因子的羧化反應(yīng)，需適當(dāng)提高華法林的維持劑量才能更好發(fā)揮其抗栓水平。但與VKORC1和CYP2C9基因相比，APOE基因多態(tài)性對華法林劑量的影響相對較小[35]。李佳佳等[36]也在后續(xù)的研究中進(jìn)一步證實了這一觀點。由此可見，該基因多態(tài)性并非影響華法林藥效學(xué)的主要原因。

2.6 其他基因多態(tài)性

近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白基因(calumenin gene，CALU)以及環(huán)氧化物水解酶1基因(epoxide hydrolase 1，EPHXl)對華法林藥效學(xué)的影響同樣受到了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。藥物遺傳學(xué)研究結(jié)果表明，CALU在維生素K循環(huán)途徑中對VKOR1和GGCX具有抑制作用，進(jìn)而影響了華法林的抗栓效果。在眾多的SNP位點中，CALU rs339097(C>T)、CALU rs2307040(G>A)和CALU rs2290228(C>T)與華法林的治療劑量間存在顯著的相關(guān)性。若CALU基因發(fā)生突變，將會降低抑制GGCX活性的能力，導(dǎo)致患者對華法林劑量的需求發(fā)生改變[37]。但另一項研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPHXl可能是VKORC1的亞單位，在VitKO向VitKH2的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[38]。綜上所述，CALU與EPHXl基因多態(tài)性在華法林的臨床實踐中存在一定的指導(dǎo)意義。

3 華法林基因多態(tài)性的臨床應(yīng)用

過去的20年，藥物基因組學(xué)在遺傳領(lǐng)域取得了飛躍的進(jìn)步。大量研究結(jié)果已經(jīng)證實，華法林相關(guān)基因多態(tài)性是影響其治療劑量的主要因素之一。2007年8月，美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)修改了華法林的藥品說明書，添加了藥物遺傳學(xué)信息，以反映CYP2C9/VKORC1基因多態(tài)性對劑量要求的潛在影響，推薦攜帶CYP2C9*2/*3或VKORC1-1639 G>A等位基因的患者可采用較低的起始劑量。然而，上述更新并沒有提供任何具體的遺傳學(xué)相關(guān)的推薦劑量，引起了許多醫(yī)師的熱議與爭論。因此，2010年1月FDA進(jìn)一步修訂了標(biāo)簽，添加了根據(jù)基因分型選擇華法林初始劑量的簡明劑量推薦表(見表1)，也再次強調(diào)了基因多態(tài)性對于華法林劑量影響的重要性[39]。

表1 FDA建議的基因多態(tài)性與華法林初始劑量對照表(mg/d)Tab 1 Comparison of FDA-recommended gene polymorphism with initial dose of Warfarin(mg/d)

目前，國內(nèi)外對于華法林穩(wěn)定劑量預(yù)測模型的研究較多，比較經(jīng)典的有國際華法林遺傳藥理學(xué)協(xié)會(international warfarin pharmacogenetics consortium，IWPC)構(gòu)建的適用于美國人群和歐洲人群的模型[40]以及Huang等[41]構(gòu)建的適用于我國人群的模型。IWPC提出的華法林預(yù)測模型研究，共納入了來自四大洲多個種族的4 043例患者，是迄今為止有關(guān)華法林預(yù)測模型樣本量最大的研究。但由于國內(nèi)外人種、體質(zhì)、地區(qū)等均存在較大差異，故能否適合于我國人群尚不可知。為此，國內(nèi)許多學(xué)者進(jìn)行了探索。劉俊等[42]對比分析了IWPC預(yù)測模型，認(rèn)為IWPC對我國漢族人群華法林穩(wěn)定劑量的預(yù)測效果有限。隨后，Huang等[41]提出了適合我國人群的預(yù)測模型，表明該模型可準(zhǔn)確預(yù)測出>60%的漢族患者華法林穩(wěn)定劑量。近期，又有學(xué)者對比了IWPC[40]和Huang等[41]幾種預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)IWPC預(yù)測模型對我國患者人群有較好的預(yù)測作用，對提高華法林抗凝治療的安全性和有效性具有潛在的臨床意義[43]。總之，到目前為止，我國對于華法林穩(wěn)定劑量的預(yù)測模型尚缺乏統(tǒng)一觀點，因此，期待未來國內(nèi)學(xué)者可以提出最適合我國人群的華法林預(yù)測模型，為患者帶來福音。

4 展望

使用藥物基因組學(xué)來優(yōu)化抗凝治療的有效性及安全性越來越引起人們的關(guān)注。將臨床信息與藥物遺傳學(xué)結(jié)合到抗凝治療過程中成為了目前研究的新方向。華法林相關(guān)基因檢測可縮短達(dá)到穩(wěn)定INR范圍所需的時間，避免出血或腦卒中復(fù)發(fā)等不良事件的發(fā)生，為臨床實踐提供進(jìn)一步合理化用藥參考。盡管目前是否推行華法林基因檢測以指導(dǎo)給藥還存在爭議，但隨著抗栓治療不斷朝著個體化醫(yī)學(xué)的方向發(fā)展，華法林基因檢測必然會成為未來臨床上的治療趨勢。相信不久的將來，真正量身定制式抗凝治療方案會得以實現(xiàn)，在臨床實踐中更安全、有效地發(fā)揮其療效。