劉燕妮 劉濤

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factorVEGF)又稱為血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF)，其主要生物功能為增加血管通透性和誘導(dǎo)血管生成。胎盤生長因子(placental growth factor,PlGF)是VEGF家族中的一員，PlGF在胚胎早期血管形成和病理條件下的血管生成尤為重要，而在正常生理過程中作用微乎其微[1]。研究表明PlGF協(xié)同VEGF在眼部發(fā)育和視網(wǎng)膜血管形成以及病理條件下新生血管的生成具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。

一、PlGF概述

1.PlGF基因定位、結(jié)構(gòu)及亞型 1991年Maglione[3]在胎盤滋養(yǎng)層細胞發(fā)現(xiàn)PlGF表達，隨后人PlGF基因定位于14q24上，由跨度13.7 kb的7個外顯子構(gòu)成，不包括上下游調(diào)控序列。被選擇性mRNA剪接產(chǎn)生四種亞型：按分子大小排序分別為PlGF-1(PlGF 131)、PlGF-2(PlGF 152)、PlGF-3(PlGF 203)和PlGF-4(PlGF 224)，不同亞型在分泌特性和結(jié)合親和力方面不盡相同。PlGF-1和PlGF-3是非肝素結(jié)合，而PlGF-2和PlGF-4具有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[4]。

PlGF是一種糖基化同二聚體，結(jié)構(gòu)特征為每個單體由六個半胱氨酸殘基結(jié)合形成三個鏈內(nèi)二硫鍵，生成一個胱氨酸結(jié)基序的三維結(jié)構(gòu)[5]。PlGF-1是分子量為46kDa的二聚蛋白，每個單體有131個氨基酸殘基，由兩個α螺旋和七個β折疊股組成，它們以反平行方式由兩個鏈間二硫鍵共價連接[5]，結(jié)構(gòu)和突變分析表明位于β3-β4環(huán)(Asp72和Glu73)中的兩個帶負電荷的殘基對受體結(jié)合至關(guān)重要[6]。VEGF與PlGF-1三維蛋白結(jié)構(gòu)相似，二者間有42%的氨基酸同源序列[7]，然而在氨基端和羧基端殘基上觀察到兩者之間差異，這種結(jié)構(gòu)上的差異也許可以解釋PlGF結(jié)合于與血管內(nèi)皮生長因子受體-1(vascular Endothelial Growth Factor receptor-1，VEGFR-1)而不是VEGFR-2[8]；PlGF-2 有170個氨基酸殘基，在羧基末端區(qū)域插入的高堿性21個氨基酸使其與肝素結(jié)合的親和力增強，并能夠與共受體神經(jīng)纖毛蛋白-1和神經(jīng)纖毛蛋白-2(neuropilin，NP-1和NP-2)結(jié)合(7)；PlGF-3由72個氨基酸序列構(gòu)成，位于外顯子4和5之間；PlGF-4由與PlGF-3相同的序列外加一個肝素結(jié)合區(qū)組成，該結(jié)合區(qū)以前被認為只存在于PlGF-2中[9]。

2.PlGF受體 1991年P(guān)ersico[9]發(fā)現(xiàn)并確定VEGF受體家族中VEGFR-1作為PlGF的受體。VEGF受體家族屬于蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)，包括三種蛋白酪氨酸激酶受體：VEGFR-1(Flt 1)、VEGFR-2(Flk 1/KDR)和VEGFR-3(FLT 4)，除此之外有兩種共受體NP-1和NP-2[10]。人VEGFR-1由1338個氨基酸組成，可分為細胞外結(jié)構(gòu)域(758個氨基酸)、跨膜結(jié)構(gòu)域(22個氨基酸)、酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)結(jié)構(gòu)域和羧基末端區(qū)域(558個氨基酸)[11]。胞外結(jié)構(gòu)域攜帶7個類免疫球蛋白樣(Ig-like)結(jié)構(gòu)域，配體結(jié)合區(qū)域位于第2和第3結(jié)構(gòu)域[12]。胞外免疫球蛋白樣亞結(jié)構(gòu)域具有三種功能：(1)形成配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(2)在配體結(jié)合后或與之伴隨的受體二聚化中起輔助作用；(3)在沒有配體的情況下維持受體的單體狀態(tài)[13]。神經(jīng)纖毛蛋白質(zhì)是跨膜糖蛋白，為信號蛋白/膠原家族成員的共受體，是神經(jīng)引導(dǎo)負性介質(zhì)[8]。VEGFR涉及蛋白酪氨酸激酶的胞內(nèi)信號通路是控制大多數(shù)細胞信號傳遞過程的關(guān)鍵。

3.PlGF/VEGFR1下游信號傳導(dǎo) 大量文獻報道在缺血缺氧的環(huán)境下刺激VEGF高表達，然而VEGF的表達與低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)密切相關(guān)。HIF-1α作為VEGF基因的轉(zhuǎn)錄因子，低氧環(huán)境下通過HIF-1α激活轉(zhuǎn)錄并增強VEGF的穩(wěn)定性，同時上調(diào)sVEGFR-1的表達，PlGF與sVEGFR-1結(jié)合可阻止PlGF與VEGFR-1結(jié)合，對內(nèi)皮細胞增殖或遷移起抑制作用[14]。VEGFR的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化后通過下游信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生細胞效應(yīng)。VEGFRs下游信號效應(yīng)的相互作用主要通過Src同源性2(src homologue 2，SH2)和磷酸化絡(luò)氨酸結(jié)合(phosphotyrosine-binging，PTB)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)[13]。SH2和PTB結(jié)構(gòu)域通過識別靶分子中的磷酸酪氨酸或特定氨基酸序列傳遞信息形成信號通路，從而產(chǎn)生調(diào)節(jié)細胞周期、細胞形狀和運動、細胞增殖、分化和細胞存活等細胞效應(yīng)[15]。

磷酸化VEGFR與含有SH2結(jié)構(gòu)域的下游信號分子結(jié)合，通過信號傳導(dǎo)通路引起細胞效應(yīng)。例如與連接蛋白Grb2結(jié)合，Grb2是由單個SH2域構(gòu)成，SH2域兩側(cè)分別有兩個SH3域。Grb 2的N端SH3結(jié)構(gòu)域是Sos相互作用的主要位點，并與Sos(RAS的鳥嘌呤核苷酸交換因子)中富含脯氨酸的區(qū)域結(jié)合，介導(dǎo)的Grb2- Sos復(fù)合物與酪氨酸磷酸化受體或?qū)拥鞍捉Y(jié)合，誘導(dǎo)Sos接觸并活化Ras，從而導(dǎo)致Ras/MAPK(絲裂原激活蛋白激酶)信號級聯(lián)反應(yīng)，控制細胞增殖和分化以響應(yīng)各種細胞外刺激[16]。Grb2的C端SH3結(jié)構(gòu)域可同時與連接蛋白Gab1中的富含脯氨酸的區(qū)域結(jié)合，因此Grb2也將其引入活化的受體絡(luò)氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)。Gab1酪氨酸磷酸化后，為磷酸肌醇3激酶(phosphoinpsitide 3-kinase,PI3K)的p85調(diào)控亞基的SH2結(jié)構(gòu)域生成額外的結(jié)合位點(在Gab1中)，將P85蛋白導(dǎo)入Gab 1，導(dǎo)致PI3K的激活和抗凋亡PI3K/Akt依賴的細胞存活通路的激活[17]。VEGFR1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Y1169、Y1213、Y1242、Y1327、Y1333)中的一些酪氨酸殘基已被鑒定為自磷酸化位點，其中Y1169的磷酸化允許磷脂酶C(phospholipase C，PLC)γ1通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)途徑結(jié)合和活化調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖[18]。PLCγ1通過SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化T細胞活化連接劑(linker for activation of T cell，LAT)結(jié)合，并通過其SH3結(jié)構(gòu)域與含76 kDa白細胞蛋白的Sh2結(jié)構(gòu)域(SH2-domain cintaining leukocyte protein of 76kDa，SLP76)中的富含脯氨酸區(qū)域相互作用，由LAT酪氨酸磷酸化形成的LAT-PLCγ1-SLP76膜連接復(fù)合物對由T細胞受體(T cell receptor，TCR)介導(dǎo)的PLCγ1活化、細胞內(nèi)Ca+2釋放和MAPK的刺激是必要的[19]。PLCγ1水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5 bosphosphate，PIP2)，生成肌醇1,4,5-三磷酸(inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DAG)，分別激動2個信號傳遞途徑 ，即IP3/Ca2+和DAG/蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途徑 。IP3通過作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上特異的受體使其內(nèi)部、Ca2+釋放 ，引起胞內(nèi)Ca2+水平的增加 ，從而啟動胞 內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng) ，即通過依賴Ca2+、鈣結(jié)合蛋白的酶類活性變化調(diào)節(jié)和控制一系列的生理過程。DAG和Ca2+協(xié)同激活PKC，以磷酸化的形式對許多蛋白質(zhì)和酶類進行修飾 ，從而調(diào)節(jié)和控制另外一系列的生理過程[20]。Ca2+活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase， eNOS) ，導(dǎo)致一過性NO的生成，NO可降低PKC-σ活性誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增生。VEGF家族與其受體通過多種通路之間的相互作用共同產(chǎn)生其生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)控血管的形成及生成。

二、PlGF在血管發(fā)育中的作用

1.PlGF與胚胎發(fā)育 早在1996年Khaliq A等[21，22]研究證實胎盤組織中PlGF mRNA的表達，通過免疫組化顯示胎盤血管合胞膜和胎盤絨毛大血管中膜均有PlGF的存在，提示PlGF可作為在胎盤血管生成過程中作為血管形成的旁分泌介質(zhì)，也可能以自分泌的方式作用于滋養(yǎng)層細胞的生長和分化。Ahmed等發(fā)現(xiàn)Flt-1蛋白表達于滋養(yǎng)層細胞[33]，F(xiàn)ong等也已經(jīng)證明Flt-1在胚胎血管形成過程中至關(guān)重要[34]，提示PlGF與Flt-1對血管生成的作用。

胎盤的正常發(fā)育和功能需要滋養(yǎng)層細胞侵入母體蛻膜，隨后豐富的血管組織化生長[24]，由于滋養(yǎng)層細胞在侵入母體蛻膜過程中取代了母體血管內(nèi)皮細胞，因此認為滋養(yǎng)層細胞具有內(nèi)皮細胞樣特性[21]，同時表明PlGF在滋養(yǎng)細胞侵入母體蛻膜過程中起著重要作用[24]，提示PlGF可能直接或通過調(diào)節(jié)VEGF與Flt-1的相互作用而介導(dǎo)血管發(fā)生[21]。研究表明與卵黃囊和胎盤相關(guān)的滋養(yǎng)層巨細胞是PlGF和VEGF的來源，且PlGF基因高表達，滋養(yǎng)層巨細胞分泌PlGF和VEGF可能是在胚胎發(fā)生早期啟動和協(xié)調(diào)蛻膜與胎盤血管化的信號，為血管形成起誘導(dǎo)作用、引導(dǎo)血管生長，從而在母胎之間建立有效的信號通路[25]。

2.PlGF與視網(wǎng)膜血管發(fā)育 低氧誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生可能是在發(fā)育過程中促進血管生成的動力。視網(wǎng)膜血管的生長以星形膠質(zhì)細胞為支架生成，隨著星形膠質(zhì)細胞與現(xiàn)有血管系統(tǒng)之間的距離增加而需氧量增加，處于相對的缺氧狀態(tài)，進一步誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生VEGF促進血管生成[26]。Susan A等通過實驗觀察小鼠出生后視網(wǎng)膜的發(fā)育情況，使用定量PCR檢測到VEGF和PlGF的表達，觀察到視網(wǎng)膜血管在出生后(postnatal)第1天從視盤向外擴展到視網(wǎng)膜周圍；在P3和P5，大血管繼續(xù)向視網(wǎng)膜周圍延伸，毛細血管生長開始延伸至大血管之間的區(qū)域，而在P7到P9，表層毛細血管叢開始形成；P9時，表層毛細血管網(wǎng)重塑，深層毛細血管密度增加；P11時，表層毛細血管叢形成完整，深層毛細血管網(wǎng)形成良好[27]。在視網(wǎng)膜淺表血管系統(tǒng)發(fā)育過程中，PlGF在動脈內(nèi)皮細胞和生長的毛細血管芽中表達最明顯。通過實驗顯示PlGF和VEGF在血管形成的過程中起著共同作用，曾有報道PlGF和VEGF在血管形成方面有著協(xié)同作用，且在早期階段起著不同的作用，通過體外研究表明VEGF促使內(nèi)皮細胞增殖并形成管狀結(jié)構(gòu)，PlGF的主要是調(diào)節(jié)血管生長和成熟[28，29]。為進一步了解PlGF和VEGF間的作用關(guān)系，Cheung等通過評估PlGF基因缺失對正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育的影響，在P6，PlGF敲除小鼠的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)顯示出較不完全的視網(wǎng)膜覆蓋，表明視網(wǎng)膜血管生長速度降低，但與野生型胎鼠相比視網(wǎng)膜毛細血管密度增加。與此同時進行了氧誘導(dǎo)缺血性視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced ischemic retinopathy，OIR)小鼠模型的血管硬化和新生血管形成的實驗研究，發(fā)現(xiàn)PlGF敲除小鼠在P12血管硬化減少和P17在病理的新血管形成減少[30]。這一實驗表明PlGF與VEGF的協(xié)同作用不僅顯示在正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育中，同時也表明在病理情況。研究表明在新生血管生成的疾病中PlGF對VEGF有協(xié)同作用，在增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患眼的玻璃體和房水中檢測到PlGF與VEGF水平均升高，給予Conbercept治療(抗PlGF)后，二者水平均有下降[31，32，33]。在PlGF基因敲除研究中Hassan Akrami等采用實時PCR和ELISA法檢測siRNA轉(zhuǎn)染后36h VEGF轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白分泌的變化，發(fā)現(xiàn)PlGF下降90%后，VEGF轉(zhuǎn)錄和蛋白量分別減少到73%和33%[32]，表明PlGF在病理性條件下對新生血管的形成有調(diào)節(jié)作用。PlGF與VEGF同時參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制，關(guān)于對抗VEGF治療是否接受的活動期PDR患者的玻璃體PlGF水平的比較研究表明，活動性PDR抗VEGF治療后VEGF水平降低，而PlGF水平抗VEGF治療前后對比無顯著差異，且PlGF和VEGF水平存在顯著的相關(guān)性；非活動性PDR中治療后PlGF水平明顯降低，表明PlGF在活動性PDR中的病理作用，抗PlGF可能更有益于疾病的治療[2]。

抗VEGF治療是抗新生血管性疾病的主要方式，在眼部新生血管性疾病中檢測到VEGF濃度和PlGF濃度均升高，然而在臨床抗VEGF治療存在應(yīng)答不良和無應(yīng)答現(xiàn)象[33]，敲除PlGF基因研究表明了PlGF在對新生血管形成的重要作用，因此PlGF可能也是血管生成治療的新靶點。Huang等通過PlGF敲除小鼠實驗提示PlGF缺失可保護視網(wǎng)膜免受糖尿病帶來的損傷，其保護機制可能與Akt激活與HIF-1α-VEGF通路抑制有關(guān)[34]，表明PlGF在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展中有的重要作用。將PlGF作為血管生成治療的靶點，影響其與受體的結(jié)合，阻斷 VEGFR 下游信號通路，抑制新生血管生成和減少血管滲漏?？筕EGF治療藥物中，近幾年Conbercept(抗PlGF)多靶點抗VEGF機制廣受熱議，其結(jié)構(gòu)為VEGFR-1的免疫球蛋白樣區(qū)域2和VEGFR-2的免疫球蛋白樣區(qū)域3、4 融合到人IgG的 Fc段所組成的融合蛋白，通過抑制VEGFR2、PlGF和PI3K的表達，抑制SRC、AKT和ERK的活化，阻止視網(wǎng)膜內(nèi)屏障被破壞而減少視網(wǎng)膜血管滲漏[35]。通過對PlGF與VEGFR-1結(jié)合經(jīng)信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生的細胞效應(yīng)作為研究重點，了解PlGF/VEGFR-1在眼部血管發(fā)育中及病理條件下新生血管形成的機制，為治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病發(fā)現(xiàn)作用靶點。

三、展望

本文回顧了VEGF家族成員PlGF關(guān)于眼部在正常發(fā)育和疾病中作用的相關(guān)文獻。研究發(fā)現(xiàn)在眼部新生血管性疾病中玻璃體和房水的VEGF和PlGF高表達，且PlGF對VEGF有著協(xié)同作用。在隨后研究中，關(guān)注抗VEGF治療的同時，更需要關(guān)注抗PlGF治療，以治療與異常血管化相關(guān)的眼部疾病。需要深入了解血管生成的分子機制和生理機制對藥物的未來發(fā)展具有重要意義，同時關(guān)于藥物應(yīng)答不良或應(yīng)答無效等問題，還需要更多探索，對眼部病理性血管生成患者會有更好的治療效果。