蘇 保 彭曉華 羅小輯 唐 可

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1 骨科 2 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，重慶市 400016

絕經(jīng)是女性走向衰老的一個(gè)重要特征，其潛在機(jī)制為雌激素水平急劇降低進(jìn)而導(dǎo)致全身各系統(tǒng)發(fā)生病理改變[1],其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis, PMO)是老年女性常見的一種全身性骨代謝疾病[2]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，約40%的50歲以上女性會(huì)罹患PMO，而骨折是PMO最為嚴(yán)重的并發(fā)癥，因其高發(fā)病率、高致殘率以及由此帶來的高額醫(yī)療花費(fèi)，逐漸成為一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問題[2]。

近年來，越來越多的證據(jù)表明PMO不僅僅與雌激素水平下降有關(guān)，基因的作用同樣至關(guān)重要[3]。一項(xiàng)基于家系及孿生同胞的研究表明，50%～80%的骨密度受到基因調(diào)控[4]。其中胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)作為一個(gè)重要的骨代謝調(diào)控因子，逐漸成為骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)IGF-1主要通過結(jié)合IGF-1受體(IGF-1R)發(fā)揮調(diào)解骨代謝的作用，其受體rs2229765位點(diǎn)已被證實(shí)與PMO發(fā)生密切相關(guān)，但其具體機(jī)制尚不清楚[5]。本研究將探討rs2229765位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率在PMO患者中的分布特點(diǎn)，并探討該基因位點(diǎn)多樣性與骨代謝標(biāo)志的相關(guān)性，有助于我們從基因水平揭示PMO的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性納入2016年1月—2019年1月間來我院骨科、老年科、婦科門診就診的骨質(zhì)疏松患者180例，列為骨質(zhì)疏松組；按年齡匹配在體檢中心門診中納入骨量正常的健康絕經(jīng)后婦女180例，列為對(duì)照組。診斷標(biāo)準(zhǔn)為行雙能X線骨密度儀進(jìn)行腰椎和雙髖關(guān)節(jié)的骨密度測(cè)定，其中T值≤-2.5診斷為骨質(zhì)疏松；T值≥-1.0則表示為骨量正常。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①女性年齡≥55歲，且絕經(jīng)時(shí)間≥1年；②無合并其他器官系統(tǒng)疾病；③患者自愿加入本項(xiàng)研究，簽署知情同意。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①絕經(jīng)年齡過早≤40歲；②繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，或合并其他影響骨代謝相關(guān)疾病，如甲狀旁腺功能亢進(jìn)、庫(kù)欣綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎等；③長(zhǎng)期服用影響骨代謝的藥物如鈣、激素、精神類藥物等；④臨床資料不完整等。

1.2 方法

1.2.1 骨代謝標(biāo)志物測(cè)定：采取空腹靜脈血5ml，離心后吸取上清液立即上機(jī)檢測(cè)。采用羅氏全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及相關(guān)試劑盒分別檢測(cè)血清I型前膠原羧基端前肽(Procollagen I N-terminal propeptide,PINP)、I型膠原羧基端β特殊序列(β-crosslaps of collagen cross-linked C-telopeptide,β-CTX)、骨鈣素(Osteocalcin,OC)、甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)及25-羥維生素D[25-hydroxyvitamin D，25(OH)D]。

1.2.2 基因多態(tài)性分析：空腹抽取靜脈血5ml，加入紅細(xì)胞裂解液離心后棄去上清，留取白細(xì)胞沉淀。采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA后(Sna)分析基因型。參考既往文獻(xiàn)，IGF-1R基因rs2229765位點(diǎn)引物：上游5’-CAGGGGTCGTTTGGGATGGTC-3’,下游 5’-CCTGTGCTGCATTTTGGCTTTTC-3’。PCR反應(yīng)體系如下：2×PCR Master Mix 12.5μl，ddH2O 9.5μl，DNA1μl，引物各1μl。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共行30個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃；再接著行30個(gè)循環(huán)：94℃變性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸7min。取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，加酶Mnl 1μl，10×NEB緩沖液5μl，ddH2O 29μl，置于37℃水浴過夜。將反應(yīng)產(chǎn)物用Gold View染色的瓊脂糖(40g/L)中電泳，凝膠成像儀中拍照觀察。其中GG純合子顯示3條條帶(103bp、84bp、20bp)，AA純合子顯示2條帶(123bp、84bp)，GA雜合子顯示4條帶(123bp、103bp、84bp、20bp)。

2 結(jié)果

2.1 患者基線資料 最終有330名受試者納入本項(xiàng)研究，其中PMO組170例，對(duì)照組160例。兩組人群在年齡、絕經(jīng)時(shí)間、體重指數(shù)方面無顯著差異(P>0.05)。但PMO組受試者骨密度明顯降低，且PINP和β-CTX的血清水平影響高于對(duì)照組(P<0.05)，而IGF-1水平則明顯下降(P<0.05)，提示IGF-1與骨代謝水平密切相關(guān)。但其他骨代謝相關(guān)指標(biāo)OC、25(OH)D和PTH兩組間比較沒有差異性，見表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2 基因型及等位基因分布 結(jié)果顯示兩組rs2229765基因分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，具有群體代表性。但兩組基因型和等位基因分布均存在顯著差異，其中PMO組中基因型AA及等位基因A分布明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；而與GG型相比，基因型GA在兩組間的分布沒有顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 兩組基因型及等位基因比較(n)

2.3 骨代謝標(biāo)志物在不同基因型間比較 血清骨代謝標(biāo)志物在三種基因型間的比較結(jié)果顯示，血清OC、25(OH)D及PTH濃度在AA、GG和GA三種基因型間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；但血清PINP和β-CTX濃度在GA、AA基因型中均高于GG基因型，且在AA基因型中其濃度最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 基因型與骨代謝標(biāo)志物組間比較

2.4 不同基因型與骨密度和骨代謝標(biāo)志物相關(guān)性 進(jìn)一步運(yùn)用多因素Logistics回歸分析評(píng)估rs2229765位點(diǎn)基因型與骨密度和骨代謝標(biāo)志物的相關(guān)性，在調(diào)整年齡、絕經(jīng)時(shí)間、體重指數(shù)后，結(jié)果顯示與GG基因型相比，AA基因型婦女股骨頸骨密度降低的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加(OR=2.13，95%CI:1.65～3.56，P<0.001)；而AA基因型腰椎骨密度雖然也有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.25，95%CI:0.72～1.97，P=0.071)；而在兩個(gè)重要骨代謝標(biāo)志物的分析中發(fā)現(xiàn)，AA基因型與β-CTX升高顯著相關(guān)(OR=2.46，95%CI: 1.65～3.56，P=0.007)，但與PINP升高無顯著相關(guān)性(OR=1.14，95%CI:0.93～1.22，P=0.169)。這一結(jié)果表明在絕經(jīng)后婦女中，rs2229765與股骨頸骨密度降低和β-CTX升高有著密切聯(lián)系。

3 討論

除了年齡相關(guān)的骨量流失和雌激素缺乏外，PMO的發(fā)病機(jī)制亦由基因和環(huán)境因素共同決定。胰島素樣生長(zhǎng)因子是骨基質(zhì)中最豐富的生長(zhǎng)因子，是一類既能促細(xì)胞分化、增殖，又具有胰島素樣作用的多肽物質(zhì)[6]。在骨組織中，IGF-1主要由成骨細(xì)胞分泌，其在生理劑量范圍內(nèi)，可與成骨細(xì)胞表面的特異性受體IGF-1R相結(jié)合，增加膠原蛋白合成，酸化骨基質(zhì)有利于成骨；同時(shí)可以通過穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白減少成骨細(xì)胞的凋亡[7]。本項(xiàng)研究同樣發(fā)現(xiàn)IGF-1血清濃度在PMO組中較對(duì)照組顯著降低，初步揭示了IGF-1對(duì)于骨代謝的重要影響。

IGF-1主要通過其受體發(fā)揮對(duì)骨代謝的調(diào)控作用，近年研究已證實(shí)IGF-1R是一種跨膜四聚體糖蛋白，其已發(fā)現(xiàn)多種多態(tài)性，其中位于第16號(hào)外顯子的基因位點(diǎn)rs2229765被認(rèn)為與PMO密切相關(guān)[8]。本研究結(jié)果同樣表明在年齡匹配的PMO和骨量正常受試者中，rs2229765的基因型及等位基因分布評(píng)論存在明顯差異。進(jìn)一步相關(guān)性分析表明在AA基因型髖關(guān)節(jié)骨密度顯著降低，但腰椎骨密度雖較其他兩者有所降低，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析原因隨著年齡增長(zhǎng)，脊柱退變往往更為明顯，容易出現(xiàn)小關(guān)節(jié)聚集增生，韌帶鈣化，椎體形態(tài)改變、邊緣骨質(zhì)增生等，因此在老年群體中髖關(guān)節(jié)骨密度更能反映真實(shí)的骨質(zhì)疏松狀態(tài)[9]。但rs2229765多樣性對(duì)骨代謝影響的潛在機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

骨代謝標(biāo)志物可實(shí)時(shí)反映骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于抗骨質(zhì)疏松療效評(píng)價(jià)、骨折風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)等[10]。機(jī)體90%的骨基質(zhì)由Ⅰ型膠原質(zhì)組成，PINP是Ⅰ型前膠原氨基端的延伸段，其血清含量主要反映Ⅰ型膠原的合成率，是骨形成的主要指標(biāo)[11]；β-CTX是Ⅰ型膠原分解的產(chǎn)物，是骨吸收的特異性指標(biāo)[12]。本研究初步結(jié)果表明PMO組受試者PINP和β-CTX的血清水平高于對(duì)照組，與PMO“高轉(zhuǎn)化”骨代謝特征相符。而對(duì)骨代謝物濃度在不同基因型間分析發(fā)現(xiàn)，AA基因型中的β-CTX血清濃度顯著高于其他基因型。β-CTX在血清中的含量升高反映骨吸收活性增強(qiáng)，提示骨量丟失越嚴(yán)重。最新的薈萃分析結(jié)果表明對(duì)于PMO婦女，β-CTX較PINP能更好地預(yù)測(cè)發(fā)生骨質(zhì)疏松骨折的風(fēng)險(xiǎn)。而AA基因型中的β-CTX血清濃度升高也與本項(xiàng)研究中AA基因型髖關(guān)節(jié)骨密度降低相吻合。

本項(xiàng)研究亦存在一些不足之處，首先該課題是一項(xiàng)橫斷面研究，單中心且樣本量較小，尤其在進(jìn)行多因素回歸分析時(shí)容易造成分析偏倚，導(dǎo)致其臨床循證學(xué)意義較弱；其次由于既往臨床資料的局限，所納入的分析骨生化標(biāo)志物有限，并不能充分反映出患者的骨代謝狀態(tài)。

綜上所述，本研究初步證明了IGF-1R基因rs2229765多態(tài)性與PMO發(fā)生密切相關(guān)，其潛在機(jī)制是升高破骨活性，導(dǎo)致骨流失，從而降低骨密度，為揭示PMO發(fā)病機(jī)制，在基因水平對(duì)PMO進(jìn)行診療提供了新的思考方向。