安亞文 劉漢清綜述 袁 波 王建春 李煒昕 王 誠(chéng)審校

生物鐘可調(diào)控人類生活的各個(gè)方面，包括睡眠、警覺、運(yùn)動(dòng)、維持體溫、激素分泌、免疫調(diào)節(jié)等[1]。生物鐘基因可控制生物節(jié)律，使細(xì)胞分裂、增殖等活動(dòng)呈現(xiàn)有序性、協(xié)同性和周期性。晝夜節(jié)律紊亂是某些癌癥的已知風(fēng)險(xiǎn)因素，可影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，夜班工作或其他夜晚暴露在光線下的工作所引起的生物鐘紊亂，與激素依賴的癌癥相關(guān)[3]。臨床證據(jù)表明生物鐘基因啟動(dòng)子的甲基化或單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌[4]、前列腺癌[5]、肺癌[6]、結(jié)腸癌[7]等腫瘤相關(guān)。膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病機(jī)制尚不明確[8]，目前治療手段有手術(shù)[9]和放化療等[10]。由于腦膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以完全切除且極易復(fù)發(fā)。同時(shí)，膠質(zhì)瘤極易產(chǎn)生放療抵抗和化療耐藥，使放化療效果大打折扣。臨床研究發(fā)現(xiàn)替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤的有效治療率不足45%[11]。近期研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的自我更新能力依賴于生物鐘基因，而靶向沉默生物鐘基因腦和肌肉芳烴受體核轉(zhuǎn)錄因子樣蛋白-1基因（brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-likeprotein 1,BMAL1）、晝夜運(yùn)動(dòng)輸出周期基因（circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK）表達(dá)，可有效抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞增殖，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期[12]。這一發(fā)現(xiàn)提示生物鐘基因在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。本文就生物鐘基因表達(dá)及功能在膠質(zhì)瘤中的作用研究進(jìn)展綜述如下。

1 生物鐘基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

目前，已發(fā)現(xiàn)的生物鐘基因已有十余種，如BMAL1、CLOCK、Period基因家族（Per1、Per2、Per3）、隱花色素抑制因子基因（cryptochrome，Cry）1、Cry2、Timeless基因、酪蛋白激酶Ⅰ基因（casein kinase 1，CK1）、神經(jīng)PAS域蛋白基因（neuronal PASdomain protein 2，NPAS2）等。生物鐘基因具有正負(fù)反饋循環(huán)回路，構(gòu)成內(nèi)源性的生物節(jié)律表現(xiàn)為近日的24 h周期，并通過神經(jīng)體液調(diào)節(jié)生理和行為來適應(yīng)環(huán)境，維持生物的新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育[13]。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，Per1、Cry1、BMAL1、CLOCK等多個(gè)生物鐘基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和正常腦組織的表達(dá)存在差異，部分生物鐘基因與療效不佳顯著相關(guān)。

1.1 膠質(zhì)瘤Perl、Per2基因表達(dá) 1971年，Konopka和Benzer在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)生物鐘基因，并將之命名為Period（Per），有三個(gè)成員，即Per1/2/3。它們是晝夜節(jié)律的重要組成部分，與運(yùn)動(dòng)、新陳代謝和行為有關(guān)。Per多態(tài)性可能與某些癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，例如Per1突變與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[14]。Per2是p53信號(hào)通路的重要上游分子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和生物周期等方面有重要作用。

Per1、Per2在膠質(zhì)瘤和瘤旁組織的表達(dá)存在顯著差異。夏鶴春等[15]發(fā)現(xiàn)Per1、Per2在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)水平低于瘤旁組織，認(rèn)為其低表達(dá)可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。牛占峰等[16]進(jìn)一步證實(shí)Perl低表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道Per2在小鼠體內(nèi)發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用，對(duì)DNA損傷也具有一定修復(fù)作用[17]。另外，膠質(zhì)瘤病人預(yù)后不佳與Per的低表達(dá)有關(guān)[18]。因此，Per

基因?qū)δz質(zhì)瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估均有一定的價(jià)值。

1.2 膠質(zhì)瘤Cry基因表達(dá) Cry基因編碼黃酮類腺嘌呤二核苷酸結(jié)合蛋白，是調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的關(guān)鍵分子。Cry1和Cry2低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致對(duì)正常晝夜節(jié)律控制的中斷，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生。有研究顯示，Cry1和Cry2在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平與瘤旁組織有顯著差異，高級(jí)別膠質(zhì)瘤Cry表達(dá)水平較低級(jí)別膠質(zhì)瘤降低[19]，因此，Cry低表達(dá)膠質(zhì)瘤病人可能預(yù)后差。

CRY蛋白穩(wěn)定劑可能是一種新的膠質(zhì)瘤的治療藥物[20]。KL001是一種咔唑類小分子化合物，可特異性地與CRY相互作用來穩(wěn)定CRY1和CRY2蛋白，其機(jī)制是通過結(jié)合到輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸口袋，減少CRY蛋白結(jié)合到F-框亮氨酸豐富重復(fù)蛋白3泛素連接酶，從而阻止泛素依賴的CRY蛋白降解過程[21]。研究發(fā)現(xiàn)，KL001及其衍生物具有抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的功能，CRY的小分子穩(wěn)定劑可以減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)氟哌啶醇可使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Cry1表達(dá)升高，具有治療膠質(zhì)瘤的潛力[22]。因此，Cry不僅可以作為膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后的一項(xiàng)標(biāo)志物，還可以作為藥物開發(fā)的靶點(diǎn)，為其治療提供新的選擇。

1.3 膠質(zhì)瘤CLOCK基因表達(dá) CLOCK基因編碼的蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律中起中心作用。CLOCK蛋白是堿性-螺旋-環(huán)-螺旋家族的轉(zhuǎn)錄因子，具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。CLOCK突變可增加少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，在細(xì)胞凋亡、DNA損傷等過程具有重要作用。高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織CLOCK的表達(dá)高于瘤旁組織[23]，也顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤[24]。沉默U-87 MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞CLOCK的表達(dá)，上調(diào)p53表達(dá)，下調(diào)c-Myc、Cyclin B1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[25]，抑制細(xì)胞的增殖、存活和遷移[26]。因此，CLOCK基因的表達(dá)水平可作為膠質(zhì)瘤診斷及預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)，并且降低CLOCK表達(dá)有望成為膠質(zhì)瘤的治療選擇。

1.4 膠質(zhì)瘤BMAL1表達(dá) BMAL1是哺乳動(dòng)物生物鐘反饋抑制回路成員。CLOCK與BMAL1以異二聚體形式結(jié)合在E-box元件，激活Per1、Per2、Cry1和Cyr2等，CRY、PER蛋白在細(xì)胞質(zhì)被翻譯，然后磷酸化并形成異質(zhì)二聚體后返回細(xì)胞核，抑制核內(nèi)CLOCKBMALl異二聚體的活性，這種負(fù)反饋回路使得CRY和PER蛋白可以調(diào)節(jié)自身的轉(zhuǎn)錄[27]。

干預(yù)生物鐘基因可有效抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)展。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞對(duì)BMAL1具有顯著的依賴性，下調(diào)BMAL1表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[12]。但也有研究顯示BMAL1表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)腫瘤侵襲[28]。因此，BMAL1在膠質(zhì)瘤中的作用及機(jī)制還需要更多的研究來闡明。

2 靶向調(diào)控生物鐘基因?yàn)槟z質(zhì)瘤治療提供新的方案

2.1 靶向調(diào)控生物鐘基因治療膠質(zhì)瘤的前景與展望隨著基因測(cè)序技術(shù)的成熟以及膠質(zhì)瘤臨床試驗(yàn)的開展，以分子分型為基礎(chǔ)的靶向個(gè)體化治療逐漸得到認(rèn)可[29]。靶向療法已經(jīng)成為膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前，靶向生物鐘基因的精準(zhǔn)治療研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展。2012年以來，多個(gè)生物鐘蛋白的晶體結(jié)構(gòu)如CRY1、PER1/2/3、FBXL3及BMAL1：CLOCK復(fù)合物、PER2：CRY1復(fù)合物等均被成功解析，為從原子水平更精確地了解生物鐘調(diào)控機(jī)制打開了新的視角。微觀結(jié)構(gòu)的解謎使得在原子水平探究生物鐘蛋白多組分復(fù)合物相互作用靶點(diǎn)成為可能，并為指導(dǎo)靶向治療的配體選擇提供方案，對(duì)膠質(zhì)瘤生物鐘基因表達(dá)的研究，為其治療提供了新的手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 時(shí)間療法 時(shí)間療法是基于生物鐘基因而提出的一種腫瘤新療法。根據(jù)生物鐘基因表達(dá)規(guī)律給藥可增強(qiáng)化療藥物的療效。根據(jù)機(jī)體、腫瘤、藥物代謝三者的生物節(jié)律，選擇合理用藥時(shí)間，保持標(biāo)準(zhǔn)劑量治療基礎(chǔ)上，在毒性最低時(shí)間提高藥物使用劑量，可提高療效，進(jìn)而改善病人生存質(zhì)量和生存率。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)多種抗癌藥物的致死劑量耐受性或療效隨晝夜節(jié)律的改變而不同[30，31]。替莫唑胺是膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物，但耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用效果。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤BMAL1依賴的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)替莫唑胺敏感性，替莫唑胺誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)、凋亡激活和生長(zhǎng)抑制在BMAL1表達(dá)的日峰值附近出現(xiàn)。

綜上所述，生物鐘基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與瘤旁組織存在顯著差異，并且在膠質(zhì)瘤的診療和預(yù)后方面有一定的應(yīng)用價(jià)值。膠質(zhì)瘤組織Cry、Per低表達(dá)與其惡性程度正相關(guān)，并且提示病人的預(yù)后不佳。CLOCK、BMAL1基因在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，與其惡性程度成正比。Cry還可以作為膠質(zhì)瘤治療藥物開發(fā)的新靶點(diǎn)，為其治療提供新的選擇。