陳琳 黃燕 何博 林長(zhǎng)幸 曾東強(qiáng) 唐文偉

摘要：【目的】從山橙（Melodinus suaveolens Champ. ex Benth）中分離對(duì)植物病原真菌具有拮抗活性的內(nèi)生真菌，為研發(fā)新型高效生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎媒M織培養(yǎng)法對(duì)山橙進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離與純化，結(jié)合菌種形態(tài)學(xué)和18S rDNA序列比對(duì)對(duì)其內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定;采用平板對(duì)峙法和菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定內(nèi)生真菌對(duì)香蕉枯萎病4號(hào)小種、香蕉炭疽病菌和火龍果潰瘍病菌等13株供試植物病原真菌的抑菌活性?！窘Y(jié)果】從山橙的根、枝和葉中分別分離得到4、5和11株共20株內(nèi)生真菌，平板對(duì)峙測(cè)定結(jié)果顯示其中的菌株M4對(duì)白腐盾殼霉菌、向日葵霜霉病菌、禾谷鐮刀菌、茄子黃萎病菌、水稻稻瘟病菌和火龍果潰瘍病菌等6株植物病原真菌的抑制率均在30.00%以上，表現(xiàn)出較好的抗菌活性。結(jié)合形態(tài)特征與18S rDNA序列分析鑒定，確定菌株M4為Phanerochaete sp.，其菌株發(fā)酵液在20 mg/mL濃度下對(duì)馬鈴薯黃萎病大麗輪枝菌、馬鈴薯黑白輪枝菌、禾谷鐮刀菌、茄子黃萎病菌、西瓜枯萎病菌、馬鈴薯立枯絲核菌和香蕉枯萎病4號(hào)小種等7株病菌均具有一定的抑制作用，其中對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制效果最佳，抑制率為40.92%，顯著高于對(duì)其他病原菌的抑制率（P<0.05）。【結(jié)論】山橙內(nèi)生真菌富含抑菌活性菌株，蘊(yùn)藏著潛在的抑菌活性物質(zhì)，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 山橙;內(nèi)生真菌;植物病原真菌;生物活性

中圖分類號(hào)： S482.292? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）09-2152-08

Antifungal activity of endophytic fungi in Melodinus suaveolens Champ. ex Benth

CHEN Lin1，2， HUANG Yan1， HE Bo1， LIN Zhang-xing1， ZENG Dong-qiang1，

TANG Wen-wei1*

（1College of Agriculture，? Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2Hengyang Academy of Vegetable Research，Hengyang， Hunan? 421000， China）

Abstract：【Objective】Endophytic fungi with antifungi activity were isolated from Melodinus suaveolens Champ. ex Benth to explore its potential active substances， and it provides a reference for? development of new high-efficiency biopesticides. 【Method】Tissue culture method was used to isolate and purify the endophytic fungi from M. suaveolens， and the endophytic fungi were identified by morphological analysis and 18S rDNA gene sequence comparison. The antifungal activities of the fungi against 13 species of plant pathogenic fungi such as Fusarium oxysporum f.sp.cubense special Race 4， Colletotrichum musae Berk. et Curt and Neocystidium dimidiatum（Penz.） Crous & Slippers? were determined by plate confrontation and growth rate method. 【Result】Twenty endophytic fungi were isolated from the roots， branches and leaves of M. suaveolens. Among them， M4 strain had above 30.00% inhibition rate against Coniothyrium diplodiella， Plasmopara halstedii（Farl.） Berl. and Fusarium graminearum Schwabe，Verticillium dahliae，Pyricularia grisea（Cooke） Sacc and N. dimidiatum， showing fine antifungal activities. Combined with morphological characteristics and 18S rDNA sequence analysis， the strain M4 strain was identified as Phanerochaete sp.， which had inhibition effects on Verticillium dahliae Kleb， V. albo-atrum， F. graminearum Schwabe， V. dahliae， F. oxysporum f. sp. nibeum， Rhizoctonia solanikuhn and Fusarium oxysporum f. sp. cubense special Race 4 at the concentration of 20 mg/mL of fermentation broth. The inhibition effects on F. graminearum were the best and the inhibition rate was 40.92%， which was significantly higher than? inhibition rates on other fungi（P<0.05）. 【Conclusion】M. suaveolens endophytic fungi contain antifungal strains， potential antifungal active substances and good promise for application.

Key words： Melodinus suaveolens Champ. ex Benth; endophytic fungi; plant pathogen fungi; bioactivity

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660529）; Key Project of Guangxi Natural Science Foundation（2017GXNSFDA198049）

0 引言

【研究意義】目前，由植物病原菌侵染引起的植物病害主要采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，但由于農(nóng)藥的過(guò)多使用，導(dǎo)致環(huán)境污染和病原菌抗藥性等問(wèn)題日益嚴(yán)重（Niu et al.，2014）。因此，尋找具有抗菌活性的微生物資源顯得尤為重要（Katoch et al.，2017）。植物內(nèi)生菌是一種在整個(gè)或部分生命過(guò)程中生活在健康植物內(nèi)部組織和各器官中，并且不會(huì)對(duì)宿主造成明顯有害影響的微生物群體（Sturz et al.，2000;Bressan and Borges，2004），主要包括放線菌、真菌及細(xì)菌。近年來(lái)，隨著人們對(duì)植物內(nèi)生菌的深入研究，國(guó)內(nèi)外研究人員從植物中分離出內(nèi)生菌并將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域來(lái)防治植物病害，為防治植物病原菌提供了一條新途徑（Koulman et al.，2007;Ting et al.，2010;Zachow et al.，2015）。【前人研究進(jìn)展】目前國(guó)內(nèi)外對(duì)植物內(nèi)生真菌的抑菌活性研究較多。Wiyakrutta等（2004）從泰國(guó)多種藥用植物中分離得到多株具有抗菌、抗癌和抗瘧疾活性的內(nèi)生真菌，使內(nèi)生真菌的研究意義進(jìn)一步得到體現(xiàn)，也為天然藥物篩選提供了一條新思路。王曉鵬等（2006）采用組織培養(yǎng)法從桃兒七中分離得到35株內(nèi)生真菌，生物活性測(cè)定顯示其內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物發(fā)酵液具有良好的抑菌活性及殺蟲活性。蔡永歡（2010）對(duì)喜樹（Camptotheca acuminata Decne.）內(nèi)生真菌進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定，篩選得到1株具有良好活性的菌株。梁子寧等（2014）采用組織勻漿法對(duì)鴉膽子進(jìn)行分離得到85株內(nèi)生細(xì)菌，篩選得到1株抑菌活性顯著的菌株。Li等（2016）從花椒中分離出940株內(nèi)生真菌，篩選出8株內(nèi)生真菌對(duì)宿主病原真菌Fusarium sambucinum和Pseudocercospora zanthoxyli有較強(qiáng)的持久抑制作用。林長(zhǎng)幸（2018）采用組織培養(yǎng)法從狹葉坡壘中分離出8株內(nèi)生真菌，抑菌活性測(cè)定結(jié)果顯示其內(nèi)生真菌具有顯著活性。莊華和岳海梅（2018）對(duì)砂生槐內(nèi)生真菌的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果得到1株具有良好抑菌活性的菌株。Tan等（2018）從八角蓮各組織中分離篩選出多株內(nèi)生真菌，并證明分離獲得的菌株具有良好的抗菌和抗腫瘤活性，這些活性菌株可用于研制開發(fā)新型天然抗菌劑或抗癌劑。顏楨靈等（2019）的研究結(jié)果表明，血散薯莖葉中存在豐富的內(nèi)生真菌資源，且其次生代謝產(chǎn)物具有廣譜抗菌活性。【本研究切入點(diǎn)】山橙（Melodinus suaveolens Champ. ex Benth）為夾竹桃科（Apocynaceae）山橙屬（Melodinus）植物（Aksoy and Unal，2008;Katoch et al.，2017），產(chǎn)于廣西十萬(wàn)大山和大青山，其植物為珍稀林木，具有重要的科研價(jià)值。本課題組前期研究對(duì)山橙進(jìn)行了系統(tǒng)成分分離，得到一系列具有抑菌活性的化合物（許亞楠，2016）。目前，從山橙中分離對(duì)植物病原真菌具有拮抗活性的內(nèi)生真菌研究尚未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用組織培養(yǎng)法對(duì)山橙內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，結(jié)合菌種形態(tài)學(xué)和18S rDNA序列比對(duì)對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定，再通過(guò)平板對(duì)峙法和菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌活性篩選，旨在篩選出對(duì)植物病原真菌具有顯著抑菌活性的山橙內(nèi)生真菌，為研發(fā)新型高效生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試植物 供試山橙為無(wú)明顯病蟲害的多年生植株，于2017年5月采自廣西十萬(wàn)大山，其材料標(biāo)本存放于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所。

1. 1. 2 供試病原真菌 供試植物病原真菌13株，分別為：火龍果潰瘍病菌[Neoscytalidium dimidiatum（Penz.） Crous & Slippers]、香蕉枯萎病4號(hào)小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical Race 4）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae Berk. et Curt）、水稻稻瘟病菌[Pyricularia grisea（Cooke） Sacc]、馬鈴薯立枯絲核菌（Rhizoctonia solanikuhn）、向日葵核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、馬鈴薯黃萎病大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb）、白腐盾殼霉菌（Coniothyrium diplodiella）、馬鈴薯黑白輪枝菌（V. albo-atrum）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum Schwabe）、向日葵霜霉病菌[Plasmopara halstedii（Farl.） Berl. et de Toni]、茄子黃萎病菌（V. dahliae）和西瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. nibeum），均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室提供。

1. 1. 3 供試試劑 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：固體（PDA）和液體（PDB）培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。DNA提取試劑盒（Fungus DNA Isolation Kit，Cat.No.LB1235）、2×Pfu PCR預(yù)混液（2×Pfu PCR Mix，Cat.No.LB2003）、DNA-Marker和Taq PCR StarMax試劑（北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司）;ddH2O（Genstar公司）;PCR所需引物：ITS1：5'-TCC GTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3'）[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 內(nèi)生真菌分離與純化 樣品通過(guò)前處理篩選出健康飽滿的植物組織（Clay et al.，2005），先用75% CH3CH2OH消毒2 min（其中根部組織5 min），無(wú)菌水清洗2～3次，然后用2% NaClO溶液消毒1 min（其中根部組織3 min），再用75% CH3CH2OH浸泡1 min（其中根部組織3 min），無(wú)菌水漂洗2～3遍，用已滅菌的濾紙吸干組織表層水分，陰干備用。在無(wú)菌條件下采用組織塊培養(yǎng)法（針對(duì)根）和組織片培養(yǎng)法（針對(duì)枝和葉片）（張弘弛，2012）將植物材料剪成5 mm×5 mm大小的組織接種至PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，再采用平板劃線法對(duì)其菌株進(jìn)行純化，將其純化的PDA培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，鏡檢觀察培養(yǎng)基上新長(zhǎng)出菌落的外部形態(tài)一致即為純菌落。

1. 2. 2 內(nèi)生真菌鑒定 將已純化的菌株接種至PDB培養(yǎng)液中培養(yǎng)3～5 d后，將菌株發(fā)酵液離心收集其菌絲體，按照CTAB法（Ceren et al.，2015）提取真菌DNA。PCR反應(yīng)體系50.0 ?L：DNA 模板1.0 ?L，10×Buffer（MgCl2）5.0 ?L，dNTP 3.0 ?L，Taq Polymerase 0.5 ?L，上、下游引物各1.0 ?L，ddH2O 38.5 ?L。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;93 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行40次循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行18S rDNA BLAST比對(duì)分析，確定真菌的歸屬。

1. 2. 3 內(nèi)生真菌抑菌活性測(cè)定 采用平板對(duì)峙法（Han et al.，2018）篩選對(duì)植物病原真菌具有良好拮抗效應(yīng)的內(nèi)生真菌：將供試病原真菌和內(nèi)生真菌菌餅接種至同一個(gè)PDA培養(yǎng)基中，以僅接種病原真菌的培養(yǎng)基作對(duì)照，再將含菌培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d，每處理3～5次重復(fù)，根據(jù)病原真菌和內(nèi)生真菌菌落直徑大小結(jié)合空白病原真菌菌落直徑大小篩選拮抗效應(yīng)顯著的內(nèi)生真菌菌株。

采用菌絲生長(zhǎng)速率法（Stinson et al.，2003;黃桂榮等，2005）測(cè)定內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)植物病原真菌的抑菌效果：將內(nèi)生真菌菌株接種至PDB培養(yǎng)液中，置于120 r/min搖床中恒溫（28 ℃）振蕩培養(yǎng)7 d后收集其發(fā)酵液，過(guò)濾離心清除菌絲體后用0.22 ?m微孔濾膜過(guò)濾除菌，得到無(wú)菌發(fā)酵液備用。

培養(yǎng)基制備：融化PDA，在無(wú)菌條件下將2 mL無(wú)菌發(fā)酵液與8 mL冷卻至45 ℃左右的PDA混合均勻，于超凈工作臺(tái)中靜置冷卻，得到濃度為20 mg/mL的含無(wú)菌發(fā)酵液培養(yǎng)基，以含相同濃度PDB發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。將6 mm的病原真菌菌餅接種至PDA中，后倒置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，每處理3～5次重復(fù)。采用十字交叉法測(cè)量培養(yǎng)皿中病原菌的直徑以計(jì)算其抑制率。抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-6）×100。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

菌株測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 6.0進(jìn)行序列拼接，然后通過(guò)BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）程序與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，再利用Sequin 9.20上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得Accession Number。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用鄧肯氏新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 山橙內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

通過(guò)組織印跡檢查（Clay et al.，2005），在培養(yǎng)皿中未見(jiàn)雜菌長(zhǎng)出，證明表面消毒徹底。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)和形態(tài)學(xué)鑒定（魏景超，1979），結(jié)果（圖1）從山橙中共分離純化出20株內(nèi)生真菌，其中從根、枝和葉中分別分離得到4、5和11株內(nèi)生真菌，菌株分別為：Alternaria sp.、Diaporthe sp.、Perenniporia sp.、Phanerochaete sp.、Guignardia sp.、Nigrospora sp.、Arthrinium sp.、Colletotrichum sp.、Stemphylium sp.、Gloeophyllum sp.、Coriolopsis sp.、Microthyriaceae、Cercospora sp.、Diaporthe sp.、Corticiaceae、Aspergillus sp.、Earliella sp.、Sordariomycetes、Helotiales和Dothideomycetes（表1）。

2. 2 山橙內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)特征

結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》（魏景超，1979）對(duì)20株內(nèi)生真菌菌株菌落形態(tài)特征（包括菌落顏色和菌絲形態(tài)等）和DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行菌株鑒定。由圖1和表2可知，20株山橙內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)特性各不相同，菌株的菌絲顏色與菌落形態(tài)也千差萬(wàn)別，其中M1和M2菌落顏色為灰褐色，M3、M4、M6、M11、M14、M15和M17菌落為白色，M5、M13和M20菌落為黑褐色，M7、M8、M12和M18菌落為灰色，M9菌落為黃褐色，M10菌落為橙色，M16菌落為黃綠色，M19菌落為橙黃色。

2. 3 山橙內(nèi)生真菌對(duì)13株植物病原真菌的活性

采用平板對(duì)峙法測(cè)定20株內(nèi)生真菌對(duì)供試13株植物病原真菌的抑菌活性，結(jié)果（表3）顯示，M1、M2、M3、M4、M16和M19對(duì)部分病原真菌的抑菌率在30.00%以上，其中M2和M4對(duì)部分病原真菌的抑菌率高于50.00%。綜合表3結(jié)果，M4菌株的抑菌效果明顯，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

2. 4 菌株M4發(fā)酵液對(duì)13株植物病原真菌的抑菌活性

為進(jìn)一步探究抑菌活性良好菌株M4（Phanerochaete sp.）發(fā)酵液次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性，在20 mg/mL濃度下采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)13株常見(jiàn)植物病原真菌的抑菌活性，結(jié)果（圖2）顯示，M4菌株發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯黃萎病大麗輪枝菌、馬鈴薯黑白輪枝菌、禾谷鐮刀菌、茄子黃萎病菌、西瓜枯萎病菌、馬鈴薯立枯絲核菌和香蕉枯萎病菌4號(hào)小種等7株病菌均具有一定的抑制作用，其抑制率分別為7.48%、15.65%、40.92%、12.69%、28.75%、21.21%和8.79%，其中對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用最大，顯著高于對(duì)其他病原菌的抑制率（P<0.05）。

3 討論

植物內(nèi)生真菌于1898年首次從黑麥草種子中被發(fā)現(xiàn)，從而開啟了內(nèi)生真菌的新紀(jì)元（任燕，2018）;1994年，邱德有等發(fā)表的關(guān)于通過(guò)組織培養(yǎng)法對(duì)云南紅豆杉進(jìn)行內(nèi)生真菌分離的報(bào)道開啟了內(nèi)生真菌分離手段的新起源，且此方法一直沿用至今。蔡永歡（2010）對(duì)喜樹進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離時(shí)將枝條和根韌皮部切去再切成5 mm×5 mm小塊，種子切成5 mm×10 mm組織塊，葉片切成5 mm×5 mm組織片，消毒6～8 min，共分離得到28株內(nèi)生真菌;王麗薇（2011）將天南星（Arisaema heterophyllum Blume）、多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）、銀杏（Ginkgo biloba L.）、無(wú)花果（Ficus carica Linn.）、博落回[Macleaya cordata（Willd.） R. Br.]、馬蘭[Kalimeris indica（Linn.） Sch.]等6種植物組織材料切成10 mm×10 mm大小，消毒處理11 min，共分離得到112株內(nèi)生真菌;張弘弛（2012）對(duì)杜仲（Eucommia ulmoides）和無(wú)花果（Ficus carica Linn.）進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離時(shí)將組織材料切成5 mm×5 mm大小，其根部消毒時(shí)間少于10 min，共分離得到119株內(nèi)生真菌。由此可見(jiàn)，組織培養(yǎng)法分離內(nèi)生真菌時(shí)消毒不徹底會(huì)影響分離結(jié)果的準(zhǔn)確性，而消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則有可能殺死組織內(nèi)部的微生物，不同植物體內(nèi)分離到的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量會(huì)有一定差異（鄒文欣和譚仁祥，2001），造成這種差別還可能與植物種類、植物生境、植物體內(nèi)微環(huán)境及所取組織部位等因素有關(guān)（畢江濤等，2012）。本研究從山橙中共分離得到20株內(nèi)生真菌，其不同組織部位分離得到的內(nèi)生真菌數(shù)量存在一定差異，分布特點(diǎn)為根、枝、葉中內(nèi)生真菌數(shù)量遞增，且分離得到的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量相比其他植物少，可能是試驗(yàn)過(guò)程中為了確保分離菌株的內(nèi)生性，其根部消毒了11 min，枝和葉組織分別消毒了4 min，因消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成部分內(nèi)生真菌被殺死。

內(nèi)生真菌種類多樣，功能也多樣（黃桂榮等，2005;喬云明，2016），即使是同一菌株對(duì)不同病原真菌的抑菌活性也可能存在差異;同時(shí)，內(nèi)生真菌的菌絲體與發(fā)酵液活性會(huì)有差異，平板對(duì)峙法初步篩選活性菌株具有直觀、簡(jiǎn)便、成本低的優(yōu)點(diǎn)，是一種體外有效篩選活性內(nèi)生真菌的方法，但平板對(duì)峙法中內(nèi)生真菌可能與供試指示菌的生長(zhǎng)速度不同，容易造成彼此之間的干擾，選擇發(fā)酵液以菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行活性檢測(cè)，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)抑菌活性高效篩選（畢江濤等，2012）。劉霞等（2010）采用菌絲生長(zhǎng)速率法發(fā)現(xiàn)甘草（Glycyrrhiza uralensis）內(nèi)生菌Z4發(fā)酵液對(duì)蘋果干腐病菌和煙草赤星病菌的抑制效果顯著;王艷紅等（2012）采用平板對(duì)峙法研究藥用植物溫郁金（Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling）中內(nèi)生真菌對(duì)幾種常見(jiàn)植物病原菌的拮抗作用時(shí)，發(fā)現(xiàn) Chaetomium globosum L18對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果不明顯，但對(duì)玉米彎孢葉斑病菌的抑制效果顯著。本研究中平板對(duì)峙法測(cè)定同樣發(fā)現(xiàn)菌株M4對(duì)馬鈴薯黃萎病大麗輪枝菌無(wú)抑菌效果，但對(duì)水稻稻瘟病菌的抑制效果顯著，而進(jìn)一步利用菌絲生長(zhǎng)速率法發(fā)現(xiàn)其菌株發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌也具有較好的抑菌效果，因此，本研究綜合使用平板對(duì)峙法和菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定山橙內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌的抑菌活性，對(duì)內(nèi)生菌的活性評(píng)價(jià)較全面。

4 結(jié)論

從藥用植物山橙中分離純化得到20株內(nèi)生真菌，經(jīng)篩選得到1株抑菌活性較高的菌株M4（Phanerochaete sp.），該菌株對(duì)禾谷鐮刀菌等植物病原真菌具有較好的抑菌效果。表明山橙內(nèi)生真菌富含抑菌活性菌株，蘊(yùn)藏著潛在的抑菌活性物質(zhì)，具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

畢江濤，王小霞，陳衛(wèi)民，王靜，賀達(dá)漢. 2012. 甘草內(nèi)生真菌分離及其抑菌活性初探[J]. 草業(yè)科學(xué)，30（3）： 357-364. [Bi J T，Wang X X，Chen W M，Wang J，He D H. 2012. Isolation of endophytic fungi from medicinal plant Gly-cyrrhiza uralensis and its microbial inhibition activity[J]. Pratacultural Science，30（3）： 357-364.]

蔡永歡. 2010. 喜樹內(nèi)生真菌的分離及其對(duì)植物病原菌的抑菌活性研究[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué). [Cai Y H. 2010. Isolation on endophytic from Camptotheca acuminata decne and inhibition activitie to plant pathogens[D]. Hefei： Anhui Agricultural University.]

黃桂榮，李有志，徐大高，潘汝謙，徐漢虹. 2005. 9種湘西植物甲醇提取物的抗真菌活性[J]. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)，18（4）： 49-52. [Huang G R，Li Y Z，Xu D G，Pan R Q，Xu H H. 2005. Antifungal activity in methanol extracts of nine plant species from west of Hunan[J]. Journal of Zhongkai University of Agriculture and Technology，18（4）： 49-52.]

許亞楠. 2016. 山橙和狹葉坡壘的化學(xué)成分及其農(nóng)藥活性研究[D]. 南寧：廣西大學(xué). [Xu Y N. 2016. Studies on the chemical constituents and pesticide activities of Melodinus suaveolens Champ. ex Benth. and Hopea chinenisis Hand-Mazz.[D]. Nanning： Guangxi University.]

顏楨靈，李國(guó)萍，駱海玉，陸保屹，梁春霞，鄧業(yè)成，鄧志勇. 2019. 血散薯內(nèi)生真菌的分離鑒定及其抗菌活性研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，48（10）： 84-92. [Yan Z L，Li G P，Luo H Y，Lu B Y，Liang C X，Deng Y C，Deng Z Y. 2019. Isolation，identification and antimicrobial activities of endophytic fungi from Stephania dielsiana Y. C. Wu[J]. Jour-nal of Henan Agricultural Sciences，48（10）： 84-92.]

張弘弛. 2012. 兩種藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究[D]. 西安：陜西科技大學(xué). [Zhang H C. 2012. Secondary metabolites of endophytic fungi from two medicinal plants and their bioactivities[D]. Xian： Shaanxi University of Science and Technology.]

莊華，岳海梅. 2018. 一株砂生槐內(nèi)生真菌的鑒定及抑菌活性測(cè)定[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，38（10）：13-18. [Zhuang H，Yue H M. 2018. Identification of a strain of endophytic fungus from Sophora moorcroftiana and its antimicrobial activity[J]. China Plant Protection，38（10）： 13-18.]

鄒文欣，譚仁祥. 2001. 植物內(nèi)生菌研究新進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào)，43（9）： 881-892. [Zou W X，Tan R X. 2001. Recent advances on endophyte research[J]. Acta Botanica Sinica，43（9）： 881-892.]

Aksoy D Y，Unal S. 2008. New antimicrobial agents for the treatment of Gram-positive bacterial infections[J]. Clinical Microbiology and Infection，14（5）： 411-420.

Bressan W，Borges M T. 2004. Delivery methods for introdu-cing endophytic bacteria into maize[J]. BioControl，49（3）：315-322.

Ceren T，Irene M N，Agostino B. 2015. New rapid DNA extraction method with chelex fromVenturia inaequalis spores[J]. Journal of Microbiological Methods，115： 139-143.

Clay K，Holah J，Rudgers J A. 2005. Herbivores cause a rapid increase in hereditary symbiosisand alter plant community composition[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，102（35）： 12465-12470.

Han D D，Wang L Y，Luo Y P. 2018. Isolation，identification，and the growth promoting effects of two antagonistic actinomycete strains from the rhizosphere of Mikania micrantha Kunth[J]. Microbiological Research，208： 1-11.

Katoch M，Phull S，Vaid S，Singh S. 2017. Diversity，phylogeny，anticancer and antimicrobial potential of fungal endophytes associated with Monarda citriodora L.[J]. BMC Microbiology，17（1）： 44.

Koulman A，Lane G A，Christensen M J，F(xiàn)raser K，Tapper B A. 2007. Peramine and other fungal alkaloids are exuded in the guttation fluid of endophyte-infected grasses[J]. Phytochemistry，68（3）： 355-360.

Li P Q，Wu Z，Liu T，Wang Y N. 2016. Biodiversity，phylogeny and antifungal functions of endophytic fungi associa-ted with Zanthoxylum bungeanum[J]. International Journal of Molecular Sciences，17（9）： 1541.

Niu J Z，Hull-Sanders H，Zhang Y X，Lin J Z，Dou W，Wang J J. 2014. Biological control of arthropod pests in citrus orchards in China[J]. Biological Control，68： 15-22.

Stinson M，Ezra D，Hess W M，Sears J，Strobel G. 2003. An endophytic Gliocladium sp. of Eucryphia cordifolia producing selective volatile antimicrobial compounds[J]. Plant Science，165（4）： 913-922.

Sturz A V，Christie B R，Nowak J. 2000. Bacterial endophytes： Potential role in developing sustainable systems of crop production[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，19（1）： 1-30.

Tan X M，Zhou Y Q，Zhou X L，Xia X H，Wei Y，He L L，Tang H Z，Yu L Y. 2018. Diversity and bioactive potential of culturable fungal endophytes of Dysosma versipe-llis; a rare medicinal plant endemic to China[J]. Scienti-fic Reports，8（1）：5929.

Ting A S Y，Meon S，Kadir J，Radu S，Singh G. 2010. Induction of host defence enzymes by the endophytic bacte-rium Serratia marcescens，in banana plantlets[J]. International Journal of Pest Management，56（2）： 183-188.

Wiyakrutta S，Sriubolmas N，Panphut W. 2004. Endophytic fungi with anti-microbial，anti-cancer and anti-malarial activities isolated from Thai medicinal plants[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，20（3）： 265-272.

Zachow C，Jahanshah G，Bruijn I，Song C，Ianni F，Pataj Z，Gerhardt H，Pianet I，Laemmerhofer M，Berg G，Gross H，Raaijmakers J M. 2015. The novel lipopeptide poaeami-de of the endophyte pseudomonas poae RE star 1-1-14 is involved in pathogen suppression and root colonization[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，28（7）： 800-810.

（責(zé)任編輯 麻小燕）