田甜 吳凌 徐麗

高血壓是心腦血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、心腦疾病、腎臟疾病、眼底視網(wǎng)膜病變等多種并發(fā)癥，并可導(dǎo)致患者猝死[1-2]。眼底血管病變是高血壓主要并發(fā)癥之一，也是成人致盲的主要原因之一，70%高血壓患者有不同程度的視網(wǎng)膜病變，眼底視網(wǎng)膜病變可反映機(jī)體動(dòng)脈情況，對(duì)判斷高血壓嚴(yán)重程度及預(yù)后有較高的臨床價(jià)值[3-4]。嘌呤能2X7受體(purinergic 2X7 receptor，P2X7R)/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體蛋白3(nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)通路參與機(jī)體組織細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而減輕病理因素對(duì)組織細(xì)胞損傷的作用[5-6]。曲安奈德(triamci-nolone acetonide，TA)是一種人工合成的皮質(zhì)類固醇類化學(xué)藥物，主要藥理作用是抗炎和免疫抑制[7-8]。有研究表明，TA可用來改善視網(wǎng)膜黃斑變性及眼底病變[9-10]。但TA對(duì)高血壓視網(wǎng)膜病變過程中P2X7R/NLRP3通路的調(diào)控作用及對(duì)眼底血管病變影響未見報(bào)道，本文對(duì)此進(jìn)行探討，為臨床合理用藥提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)10周齡自發(fā)性高血壓(spontaneously hypertensive，SHR)京都維斯特(Wistar-kyoto，WKY)雄性大鼠40只和同源、同性別、同周齡且血壓正常的WKY大鼠10只，均由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本研究經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.1.2 主要試劑及儀器TA(北京凱瑞基生物有限公司，每瓶100 mg)；HE染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶均購自美國(guó)Pierce公司；P2X7R抗體(上海煊翎生物科技有限公司)；NLRP3抗體(武漢菲恩生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)抗體(武漢益普生物科技有限公司)；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)1659001、Trans-Blot SD，美國(guó)Bio-Rad公司)；BIOPAC多導(dǎo)(16道)生理記錄儀(北京普升達(dá)科貿(mào)有限公司)；生命信息處理系統(tǒng)(Powerlab 系統(tǒng))[德儀器國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]；大鼠用無創(chuàng)傷血壓測(cè)量?jī)x(we1548，北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司)；S360裂隙燈顯微鏡、邁瑞Mindray彩色多普勒超聲儀(上海涵飛醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥用裂隙燈顯微鏡檢測(cè)并挑選出雙眼均有視網(wǎng)膜病變的SHR大鼠40只，隨機(jī)分為模型組(SHR組)、TA低劑量組(20 g·L-1)、TA中劑量組(40 g·L-1)和TA高劑量組(80 g·L-1)，每組10只，同時(shí)將10只健康無高血壓的WKY大鼠作為空白組(Control組)。各組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，TA低、中、高劑量組均在角膜外3點(diǎn)鐘位、6點(diǎn)鐘位、9點(diǎn)鐘位和12點(diǎn)鐘位四個(gè)方向的角膜緣后1.0 mm處球結(jié)膜下分別注射10 μL相應(yīng)劑量的TA[11]，Control組和SHR組在相同部位注射等體積生理鹽水，各組每隔7 d注射一次，共給藥2周。

1.2.2 各組大鼠血壓及眼壓檢測(cè)各組大鼠給藥2周后用無創(chuàng)傷血壓測(cè)量?jī)x聯(lián)合16道生理記錄儀和生命信息處理系統(tǒng)經(jīng)鼠尾測(cè)定血壓。用眼壓計(jì)檢測(cè)大鼠左眼眼壓，讀取3次眼壓值，取平均值。

1.2.3 各組大鼠眼底視網(wǎng)膜組織形態(tài)觀察各組大鼠給藥2周后，將鼠眼散瞳后在黑暗中適應(yīng)30 min，用裂隙燈顯微鏡觀察各組大鼠眼底病變情況及視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈形態(tài)。

1.2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)各組大鼠在完成眼底檢查后，用彩色多普勒超聲儀檢測(cè)左眼血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈(central retinal artery，CRA)血流速度和視網(wǎng)膜中央靜脈(central retinal vein，CRV)血流速度。

1.2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管密度及毛細(xì)血管形態(tài)檢測(cè)各組大鼠在完成血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)后，麻醉處死大鼠，摘除雙眼眼球，左眼進(jìn)行視網(wǎng)膜分離，用組織勻漿器均漿，離心分離后提取蛋白，于-20 ℃冰箱中保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。右眼眼球置于40 g·L-1多聚甲醛中4 ℃固定24 h后鈍性分離視網(wǎng)膜組織，加入1 mL的0.1 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液(Tris-HCL)及30 g·L-1胰蛋白酶消化液，室溫孵育3 h后置于玻片上進(jìn)行常規(guī)HE染色。消化鋪片干燥后，置于顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化，每只大鼠隨機(jī)取5張圖像，用Image proplus 6.0 軟件測(cè)定視網(wǎng)膜毛細(xì)血管密度。毛細(xì)血管密度(%)=毛細(xì)血管總面積/視網(wǎng)膜總面積×100%。

1.2.6 Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜組織P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)取保存的視網(wǎng)膜蛋白提取液，4 ℃下解凍后按BCA試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度，取200 μg蛋白進(jìn)行十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，接著將全部蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并置于50 g·L-1脫脂奶粉溶液中，于搖床上37 ℃封閉2 h，將目的蛋白條帶置于孵育盒中，分別加入各種因子抗體(P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6、β-actin，稀釋度分別為11000、1100、11000、11000、12000)于 4 ℃冰箱中孵育過夜，經(jīng)TBST漂洗3次，加入稀釋度11000的羊抗兔二抗溶液，于搖床上室溫孵育2 h，經(jīng)TBST再次漂洗3次，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并利用Image J軟件分析各組視網(wǎng)膜中不同因子蛋白的相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓及眼壓比較與Control組相比，SHR組大鼠收縮壓、舒張壓、平均血壓、眼壓均升高(均為P<0.05)；與SHR組相比，TA低、中、高劑量組收縮壓、舒張壓、平均血壓、眼壓均無明顯變化(均為P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血壓、眼壓比較

2.2 各組大鼠眼底病變情況Control組大鼠眼底結(jié)構(gòu)正常。與Control組相比，SHR組大鼠視網(wǎng)膜動(dòng)脈變細(xì)，管徑不規(guī)則，靜脈擴(kuò)張迂曲，視網(wǎng)膜水腫，且有血液滲出及黃斑部滲出性病灶。TA低、中、高劑量組視網(wǎng)膜水腫減輕，棉絨狀斑塊、硬性滲出、出血及廣泛微血管改變減弱，血管壁收縮變窄情況好轉(zhuǎn)，同時(shí)血液滲出及黃斑部的黃灰色滲出性病灶減少。各組大鼠眼底檢查結(jié)果見圖1。

2.3 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較與Control組相比，SHR組大鼠CRA、CRV血流速度均降低(均為P<0.05)；與SHR組相比，TA低、中、高劑量組CRA、CRV血流速度均升高(均為P<0.05)，且各劑量組CRA、CRV血流速度呈劑量依賴性升高(見表2)。

圖1 各組大鼠眼底檢查結(jié)果 A：Control組；B：SHR組；C：TA低劑量組；D：TA中劑量組；E：TA高劑量組

表2 各組大鼠CRA、CRV血流速度比較

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)及毛細(xì)血管密度比較Control組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管管徑粗細(xì)一致，內(nèi)皮細(xì)胞正常。與Control組[毛細(xì)血管密度(0.53±0.05)%]相比，SHR組大鼠視網(wǎng)膜可見毛細(xì)血管閉塞呈細(xì)線狀,毛細(xì)血管周細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞減少、閉鎖，且毛細(xì)血管密度(0.28±0.04)%明顯降低(P<0.05)。與SHR組相比，TA低、中、高劑量組毛細(xì)血管閉塞、周細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞減少、閉鎖現(xiàn)象均有不同程度改善，毛細(xì)血管密度明顯升高(P<0.05)，TA低、中、高劑量組毛細(xì)血管密度分別為(0.33±0.04)%、(0.41±0.06)%、(0.46±0.04)%，呈劑量依賴性(見圖2)。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)檢測(cè)結(jié)果(HE染色，×400) A：Control組；B：SHR組；C：TA低劑量組；D：TA中劑量組；E：TA高劑量組

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)水平與Control組相比，SHR組大鼠視網(wǎng)膜組織P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平均明顯升高(均為P<0.05)；與SHR組相比，TA低、中、高劑量組P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平均明顯降低(均為P<0.05)，且TA各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性降低(見表3和圖3)。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá) A：Control組；B：SHR組；C：TA低劑量組；D：TA中劑量組；E：TA高劑量組

3 討論

高血壓性視網(wǎng)膜病變是由高血壓引起的常見微血管病變并發(fā)癥，因血壓持續(xù)升高而造成視網(wǎng)膜靜脈阻塞、血-視網(wǎng)膜屏障破壞、血漿及血管內(nèi)成分滲出，導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫、出血、缺血或眼底出現(xiàn)棉絮狀斑、硬性滲出等病變，嚴(yán)重者可出現(xiàn)視網(wǎng)膜脫離，最終導(dǎo)致患者失明[12]。

TA是一種長(zhǎng)效糖皮質(zhì)激素，被廣泛應(yīng)用于玻璃體視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜黃斑水腫、視網(wǎng)膜毒性反應(yīng)、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜出血等多種眼科疾病的治療[13]。劉明月[14]發(fā)現(xiàn)，TA可減輕血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，促進(jìn)滲出吸收，治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞引起的眼底黃斑水腫等病變；周琰倢等[15]發(fā)現(xiàn)，TA可減少黃斑前膜或黃斑裂孔玻璃體切割手術(shù)中的出血量。我們推測(cè)，TA也可改善高血壓性視網(wǎng)膜血管病變癥狀，并建立SHR大鼠模型對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，SHR組大鼠收縮壓、舒張壓、平均血壓、眼壓均升高，裂隙燈眼底檢查可見眼底動(dòng)靜脈血管變細(xì)，部分出現(xiàn)黃斑水腫、滲血等現(xiàn)象，彩色多普勒成像顯示視網(wǎng)膜血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)CRA、CRV的血流速度均明顯較少，HE染色顯示部分毛細(xì)血管閉塞、消失及密度減少，提示SHR大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)動(dòng)靜脈變細(xì)、血流減少及毛細(xì)血管閉塞等病變。而眼底局部給予TA低、中、高劑量治療后發(fā)現(xiàn)，與SHR組相比，TA各劑量組大鼠眼底黃斑水腫、出血明顯減少，視網(wǎng)膜血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)CRA、CRV血流速度增高，毛細(xì)血管閉塞減少，毛細(xì)管密度增多，且TA各劑量組呈劑量依賴性，而TA各劑量組收縮壓、舒張壓、平均血壓、眼壓略有升高，但升高不明顯，表明TA可增加SHR大鼠CRA、CRV血流速度和毛細(xì)血管密度，改善視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈血管變細(xì)、毛細(xì)血管閉塞痙攣等病變，減少視網(wǎng)膜黃斑水腫、出血等癥狀，而TA外用短期內(nèi)對(duì)大鼠血壓和眼壓升高不明顯。

延緩和逆轉(zhuǎn)高血壓性視網(wǎng)膜病變是高血壓患者治療過程中的重要策略，近年來大量研究表明，炎癥因子參與高血壓性視網(wǎng)膜病變過程[16-17]。陶麗妃等[18]發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可抑制促炎因子和血管生長(zhǎng)因子釋放，進(jìn)而干預(yù)高血壓性視網(wǎng)膜血管病變；Kiang等[19]發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-6 可誘導(dǎo)眼底VEGF釋放來促進(jìn)視網(wǎng)膜病變的程度，TNF-α可破壞血-視網(wǎng)膜屏障，促進(jìn)視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。而P2X7/NLRP3通路參與機(jī)體炎癥反應(yīng)[5-6]，石蕊等[20]發(fā)現(xiàn),非諾貝特可通過下調(diào)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變組織中P2X7/NLRP3通路蛋白表達(dá)，發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用；李婷等[16]發(fā)現(xiàn),非諾貝特可抑制炎癥因子IL-6、TNF-α釋放，改善高血壓性視網(wǎng)膜病變。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，SHR組大鼠視網(wǎng)膜組織P2X7、NLRP3、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)均增高，提示高血壓性視網(wǎng)膜病變組織P2X7/NLRP3通路蛋白表達(dá)增高，炎癥因子釋放增多。而與SHR組相比，TA高、中、低劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織P2X7、NLRP3、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)均降低，且呈劑量依賴性，表明TA對(duì)高血壓性視網(wǎng)膜血管病變的改善作用可能是通過抑制P2X7/NLRP3通路蛋白表達(dá)和炎癥因子釋放實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，TA可抑制P2X7/NLRP3通路蛋白表達(dá)和炎癥因子釋放，增加CRA、CRV的血流速度和毛細(xì)血管密度，改善高血壓所致視網(wǎng)膜眼底病變,為臨床治療高血壓性視網(wǎng)膜眼底病變提供了一定的參考。但本研究也存在一定的不足，高血壓性視網(wǎng)膜眼底病變機(jī)制復(fù)雜，TA雖可緩解視網(wǎng)膜病變癥狀，但對(duì)血壓和眼壓作用變化不大，TA外用并佐以降壓藥物內(nèi)服治療高血壓性視網(wǎng)膜病變效果將會(huì)更好，本研究未對(duì)TA+降壓藥物聯(lián)合治療高血壓性視網(wǎng)膜病變進(jìn)行研究，這有待后續(xù)繼續(xù)研究。