黃元亮 滕利

【提要】 顱面骨畸形是顱面外科基因?qū)W研究的重點(diǎn)。顱面骨畸形的致病突變基因及相關(guān)致病因素現(xiàn)已逐漸明確，針對(duì)突變基因的分子治療亦取得一定的進(jìn)展，為顱面骨畸形的早診斷、早治療奠定了基礎(chǔ)。本文針對(duì)顱面骨畸形的基因?qū)W研究、基因突變的分子治療進(jìn)展進(jìn)行綜述。

顱頜面外科基因研究主要針對(duì)顱面骨畸形，所涉及的顱面骨畸形主要包括顱縫早閉和顱面裂。顱縫早閉分為綜合征型和非綜合征型。綜合征型患者不但患有顱縫早閉，同時(shí)還會(huì)合并其他癥狀。顱面裂畸形是一種較為罕見的先天性畸形，以胚胎時(shí)期面部骨各突起間未融合而產(chǎn)生的面骨裂為主要癥狀。

1 顱縫早閉基因研究

綜合征型顱縫早閉遺傳機(jī)制相對(duì)較為明確。大多綜合征型顱縫早閉源于FGFR1-3(成纖維細(xì)胞生長因子受體1-3)及TWIST基因突變。1993年，Jabs等[1]首次描述了MSX2基因突變導(dǎo)致了一個(gè)家族的三代人都患有波士頓型顱縫早閉癥。自此，綜合征型顱縫早閉的基因研究得以廣泛開展，許多綜合征及其突變基因相繼被報(bào)道：Pfeiffer綜合征與FGFR1相關(guān)[2]，Apert、Crouzon、Pfeiffer、Jackson Weiss和Beare Stevenson綜合征與FGFR2相關(guān)[3-8]，Muenke綜合征、Crouzon綜合征伴黑棘皮癥與FGFR3相關(guān)[9-10]，Saethre-Chotzen綜合征與TWIST1相關(guān)[11]，波士頓型顱縫早閉綜合征與MSX2相關(guān)[1]，Carpenter綜合征與RAB23相關(guān)[12]，顱額鼻綜合征與EFNB1相關(guān)[13]等。截至2015年，共發(fā)現(xiàn)57個(gè)與顱縫早閉相關(guān)的基因突變。這些基因可分為兩類：第一類，引起該基因編碼蛋白的改變，直接導(dǎo)致顱縫早閉，此類為形成顱縫早閉的核心基因；第二類，使人體成骨功能紊亂，僅在部分病例中引起顱縫早閉[14]，如低磷血癥中的磷鈣失衡(ALPL基因突變)[15]和X連鎖低磷性佝僂病(PHEX基因突變)[16]。2017年，Goos等[17]補(bǔ)充描述了新增的可能與顱縫早閉相關(guān)的22個(gè)基因。這些基因通過作用于胚胎發(fā)育相關(guān)的通路(如：Sonic hedgehog通路、WNT通路、NOTCH/EPH通路、RAS/MAPK通路、Indian hedgehog通路、視黃酸通路、STAT通路等)影響胚胎早期發(fā)育，造成顱縫早閉。除基因突變外，環(huán)境因素也是顱縫早閉的重要因素，非綜合征型顱縫早閉及某些綜合征型顱縫早閉可能是多基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[18]。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，非綜合征型顱縫早閉的基因?qū)W研究也取得了一定進(jìn)展，通過非綜合征型矢狀縫早閉的全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS)[19]確定了兩個(gè)與非綜合征型矢狀縫早閉顯著相關(guān)的位點(diǎn)，一個(gè)位于BMP2的下游，另一個(gè)位于BBS9的內(nèi)含子內(nèi)。該結(jié)果為從基因?qū)用娼忉尫蔷C合征型顱縫早閉的病因提供了基礎(chǔ)，但具體的機(jī)制目前仍不明確，有待于進(jìn)一步研究。

2 顱面裂基因研究

顱面裂的病因復(fù)雜，Saadi等[20]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架蛋白SPECC1L可以調(diào)控顱面各突起在發(fā)育過程中細(xì)胞的遷移和黏附，其缺失可導(dǎo)致面斜裂的發(fā)生。Gfrerer等[21]通過敲除斑馬魚的SPECC1L基因，制作了面裂的動(dòng)物模型，這是第一個(gè)通過基因修飾成功制作的顱面裂動(dòng)物模型。Jugessu等[22]的基因分析結(jié)果顯示，IRF6、ADH1C、FGF12、ALX3、MKX、PDGFC、ETV5七種基因與面裂相關(guān)，其中IRF6基因突變最為常見。Thompson等[23]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)敲除小鼠IRF6基因，觀察到了新生小鼠的顱面裂畸形。隨著基因研究的不斷深入，在顱面裂領(lǐng)域有了新的發(fā)現(xiàn)。Shull等[24]報(bào)道甲基化等組蛋白修飾的缺失，可能對(duì)顱面裂的產(chǎn)生有重要影響。該研究通過敲除Prdm3和Prdm16基因，成功觀察到了斑馬魚及小鼠動(dòng)物模型的顱面裂的發(fā)生。

顱面裂具有遺傳異質(zhì)性及基因多效性。Takahashi等[25]觀察到一對(duì)日本同卵雙胞胎患有單側(cè)唇腭裂，但受累區(qū)在不同側(cè)。全基因組測(cè)序未發(fā)現(xiàn)DNA有不一致的變異。該研究表明，表觀遺傳可能是顱面畸形性狀的決定性因素。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)的發(fā)展推動(dòng)了顱面裂畸形的基因?qū)用嫜芯?，Yu等[26]對(duì)中國多種族共7 404例非綜合征型口面裂和16 059例非綜合征型唇腭裂進(jìn)行GWAS，檢驗(yàn)其遺傳異質(zhì)性，共得出41個(gè)非綜合征型唇腭裂的可疑致病性單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，這為進(jìn)一步探究非綜合征型唇腭裂的致病突變基因位點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

3 基因突變的分子治療進(jìn)展

手術(shù)治療是顱面畸形的主要治療方法，其對(duì)癥治療效果顯著，且避免了藥物治療的潛在風(fēng)險(xiǎn)。但手術(shù)為有創(chuàng)治療，且術(shù)后存在畸形復(fù)發(fā)的可能。如何針對(duì)已知的突變基因進(jìn)行對(duì)因治療，是亟待解決的問題。

綜合征型顱縫早閉的遺傳機(jī)制研究明確，能夠滿足治療的前提。成纖維生長因子受體(FGFR)及其配體具有調(diào)節(jié)身體發(fā)育及腫瘤形成的功能，其中FGFR1-3參與了骨骼發(fā)育形成。FGFR功能的異常高表達(dá)是綜合征型顱縫早閉發(fā)生的主要原因之一。阻止FGFR的異常表達(dá)，是顱縫早閉基因治療研究的重要切入手段。1992年，Ueno等[27]首次報(bào)道了截?cái)嘈虵GFR-1能抑制FGF配體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。2001年，Greenwald等[28]將截?cái)嘈虵GFR-1注入孕期胎鼠的后額縫，發(fā)現(xiàn)胎鼠出生后，后額縫的正常融合受到抑制。這表明，通過干擾FGFR功能，可以阻止顱縫的融合。2006年，Perlyn等[29]采用酪氨酸激酶抑制劑(可靶向抑制異常的FGFR信號(hào))對(duì)Crouzon綜合征模型鼠顱骨進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其能抑制冠狀縫早閉的發(fā)生。同年，Eswarakumar等[30]通過基因編輯，將突變片段L424 A、L426 A插入Crouzon綜合征模型鼠，以阻止接頭蛋白Frs2a的募集及酪氨酸磷酸化，干擾FGF下游信號(hào)通路的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Crouzon綜合征基因編輯小鼠冠狀縫早閉癥狀明顯改善。2007年，Shukla等[31]嘗試對(duì)孕有Apert綜合征幼鼠的母鼠腹腔注射酪氨酸激酶抑制劑(U0126)，發(fā)現(xiàn)部分小鼠表現(xiàn)出良好的治療效果。2009年，Cooper等[32]采用Noggin對(duì)顱縫切除術(shù)后小鼠進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)Noggin可以明顯抑制術(shù)后顱縫再次融合。2018年，Luo等[33]通過體外實(shí)驗(yàn)篩選了特異性阻止FGFR2-P253R突變的等位基因表達(dá)小干擾RNA(siRNA)，用于處理Apert小鼠(Fgfr2+/P253R)顱骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能有效抑制成骨細(xì)胞分化及骨組織礦化作用。隨后通過腺病毒轉(zhuǎn)染的方法，將具有拮抗突變FGFR2功能的AAV9-Fgfr2-shRNA注射入Apert小鼠顱骨，發(fā)現(xiàn)能夠有效改善小鼠的顱縫早閉癥狀。同年，Shin等[34]通過雜交Fgfr2S252 W/+Apert綜合征小鼠與PIN1+/-小鼠，發(fā)現(xiàn)其后代Apert綜合征癥狀明顯減輕，提示PIN1抑制劑可能是治療FGFR突變顱縫早閉的潛在靶點(diǎn)藥物。

近20年來，圍繞如何抑制突變FGFR的異常功能展開的深入研究，已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得較大突破。但離臨床實(shí)際應(yīng)用尚有差距。在治療方面仍存在不可忽視的問題，如安全劑量、給藥途徑、遠(yuǎn)期效果及潛在并發(fā)癥等均有待于進(jìn)一步的評(píng)估。

4 基因研究展望

隨著基因診斷技術(shù)和基因編輯技術(shù)等的快速發(fā)展，從基因?qū)用娼忉尰纬梢蚝蜋C(jī)制，使畸形的預(yù)防、干預(yù)和治療成為可能?；蚣夹g(shù)的進(jìn)步和應(yīng)用會(huì)進(jìn)一步推動(dòng)顱頜面外科快速發(fā)展，但由于某些畸形(如面裂、非綜合征型顱縫早閉)的發(fā)生是遺傳及環(huán)境共同作用的結(jié)果，基因干預(yù)并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其發(fā)展，此外還存在基因編輯所帶來的倫理問題。如何合理運(yùn)用基因技術(shù)、合理看待基因診斷結(jié)果，以及如何正確使用基因編輯技術(shù)，是當(dāng)前臨床面臨的巨大機(jī)遇和挑戰(zhàn)。