涂麗琴 吳淑華 高丹娜 吉穎 程兆榜 周益軍 朱月林 劉勇 季英華

摘要：為明確2015年在遼寧省調(diào)查番茄病毒病時(shí)發(fā)現(xiàn)的病毒類型，對田間采集的番茄病樣進(jìn)行了分子檢測。結(jié)果顯示，在用煙草花葉病毒屬通用檢測引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增時(shí)22份樣品中有6份擴(kuò)增到800 bp左右的目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物測序后BLAST分析結(jié)果表明它與已報(bào)道的番茄斑駁花葉病毒（Tomato mottle mosaic virus，ToMMV）（KF477193）同源性最高，為99.2%。為進(jìn)一步確認(rèn)，針對ToMMV編碼的外殼蛋白（CP）設(shè)計(jì)了一對特異性引物，對樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示6份陽性樣品都能擴(kuò)增到目的條帶，對其克隆測序后發(fā)現(xiàn)CP基因序列全長480 bp，編碼1個(gè)相對分子質(zhì)量約1.77×104的蛋白質(zhì)，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明該病毒與ToMMV的同源性最高，共同聚類于一個(gè)分支。這些結(jié)果表明在遼寧省番茄病株上檢測到的病毒為ToMMV的1個(gè)分離物，這是在遼寧省番茄上發(fā)現(xiàn)番茄斑駁花葉病毒的首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞：番茄斑駁花葉病毒;分子鑒定;番茄

中圖分類號：S436.412.1+1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）05-1126-07

Abstract：To clarify the types of viruses found in the process of investigation on tomato virus diseases from Liaoning province in 2015， the infected tomato samples collected in the fields were detected by molecular methods. The results showed that the target fragment of approximately 800 bp long was amplified from six samples of twenty-two samples in the process of RT-PCR amplification， using universal primers for Tobamovirus. The amplified products were sequenced and the results of BLAST analysis showed that， the sequence showed the highest homology with the reported tomato mottle mosaic virus （ToMMV） （KF477193）， with a value of 99.2%. To make further confirmation of the above result， a pair of specific primers based on coat protein （CP） sequence coded by ToMMV were designed and used to do RT-PCR detection of the samples. The results showed that the target band could be amplified from six positive samples. The cloning and sequencing results of the target band revealed that the full length of CP gene was 480 bp， encoding a protein with a relative molecular weight of approximately 1.77×104. The results of the phylogenetic tree indicated that the virus sequence showed the highest homology with ToMMV and they all clustered into one branch. The above results indicate that the virus detected in infected tomatoes from Liaoning is an isolate of ToMMV， and this is the first report of ToMMV found in tomatoes from Liaoning province.

Key words：tomato mottle mosaic virus;molecular identification;tomato

番茄（Solanum lycopersicum）為主要的茄科蔬菜作物之一，廣泛種植于世界上多個(gè)國家與地區(qū)。目前已發(fā)現(xiàn)可感染為害番茄的病毒種類大概為146種[1]，常見的有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、番茄黃化曲葉病毒（Tomato Yellow leaf curl virus，TYLCV）和番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）等[1-4]。2013年Li等[5]在墨西哥番茄上發(fā)現(xiàn)一種新病毒——番茄斑駁花葉病毒（Tomato mottle mosaic virus，ToMMV），該病毒侵染番茄會導(dǎo)致植株出現(xiàn)發(fā)育遲緩、頂端壞死等癥狀，病葉出現(xiàn)斑駁、皺縮和壞死等癥狀，其果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì)顯著下降，對番茄產(chǎn)量構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6]，隨后美國[7-8]、以色列[9]、西班牙[5]、巴西[10]等地陸續(xù)出現(xiàn)該病毒的危害報(bào)道。2014年中國西藏地區(qū)出現(xiàn)該病毒[11]，之后云南、海南等地陸續(xù)出現(xiàn)該病毒[12-13]，給各地的茄果類蔬菜作物生產(chǎn)造成了極大的影響。

ToMMV隸屬于帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），為正義單鏈RNA（+ ssRNA）病毒，其基因組全長約為6 400 bp，含4個(gè)開放閱讀框（Open reading frame，ORF）并編碼4個(gè)大小各異的蛋白質(zhì)，分別為1.83×105的RNA依賴的RNA聚合酶蛋白（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）、1.26×105的甲基轉(zhuǎn)移酶/解旋酶蛋白（Methyltransferase/helicase）、2.98×104的運(yùn)動蛋白（Movement protein，MP）以及1.77×104的外殼蛋白（Coat protein，CP）[13]。其中甲基轉(zhuǎn)移酶/解旋酶蛋白由琥珀（UAG）終止密碼子終止，RNA依賴的RNA聚合酶蛋白通過通讀此終止密碼子產(chǎn)生，這2個(gè)較大的蛋白質(zhì)能組成RNA復(fù)制蛋白復(fù)合體，參與病毒的復(fù)制[14]。

2015年我們在開展遼寧省番茄病害的調(diào)查研究時(shí)觀察到田間出現(xiàn)類似病毒感染癥狀的植株，病樣采集后通過RT-PCR、基因克隆和測序等對其進(jìn)行分子檢測與鑒定。

1材料與方法

1.1供試病樣

供試番茄病樣于2015年7月采自遼寧省沈陽市（累計(jì)22份），以溫室內(nèi)培育的健康番茄為對照，病樣采集后分別取100 mg至不同的磨樣管中并做好標(biāo)記，將磨樣管置于液氮中進(jìn)行速凍后快速將其置于-80 ℃冰箱。

1.2主要試劑與儀器

RNA提取液（RNAiso Plus）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScriptTM RT Master Mix （Perfect Real Time）、Ex Taq酶和基因克隆T載體pMD 18-T購自大連TaKaRa公司，2×Taq Master Mix購自南京Vazyme公司，大腸桿菌菌株Top10購自南京Warbio公司，質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自美國Axygen公司，限制性內(nèi)切酶BamH I購自美國New England Biolabs公司，引物送至上海Invitrogen公司合成，其余有機(jī)和無機(jī)試劑為國產(chǎn)分析純。

全自動樣品磨樣儀（Tissue lyser-64）購自上海凈信科技公司。

1.3病樣總RNA提取

取-80 ℃冰箱中放置的番茄病樣磨樣管，經(jīng)液氮冷凍后用全自動樣品磨樣儀將管中病樣磨成粉末，按照Trizol法[15]利用RNAiso Plus提取番茄樣品的總RNA，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4病毒RT-PCR檢測

利用番茄病樣總RNA作模板，用PrimerScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系（10 μl）：2 μl 5×Primer ScriptTM RT Master Mix，病樣RNA 500 ng，最后用RNase Free ddH2O補(bǔ)足至總體積為10 μl，輕輕混勻;反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃結(jié)束，得到cDNA。隨后對其進(jìn)行PCR檢測，PCR體系（20 μl）：10 μl 2×Taq Master Mix，1 μl 10 μmol/L Tob-Uni1（表1），1 μl 10 μmol/L Tob-Uni2，1 μl cDNA，7 μl ddH2O，輕輕混勻;反應(yīng)程序：94 ℃高溫變性5 min;94 ℃ 45 s，49 ℃ 45 s，72 ℃ 55 s，33個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min，4 ℃ 結(jié)束。取5 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物于0.5×TAE電泳緩沖液中，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，根據(jù)電泳結(jié)果將其產(chǎn)物送至測序公司測序。

1.5ToMMV CP基因克隆

根據(jù)番茄斑駁花葉病毒外殼蛋白序列設(shè)計(jì)特異引物ToMM CP_F和ToMM CP_R（表1），對上述檢測結(jié)果為陽性的病樣cDNA再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系（25 μl）：0.5 μl 5 U/μl Ex Taq，2.5 μl 10×Ex Taq Buffer（Mg2+ plus），1.0 μl 10 μmol/L ToMM CP_F，1.0 μl 10 μmol/L ToMM CP_R，0.5 μl 10 mmol/L dNTP mix，1.0 μl cDNA模板，18.5 μl ddH2O，輕輕混勻;反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 35 s，33個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min，4 ℃ 保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用凝膠回收試劑盒回收凝膠中的擴(kuò)增帶。按照pMD 18-T載體連接試劑盒說明書將回收產(chǎn)物連接至T載體，其產(chǎn)物經(jīng)42 ℃熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top 10后涂于含200 mg/L氨芐青霉素（Ampicillin）的LB固體平板上，隨后將其倒置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h左右，挑取LB板上的單克隆進(jìn)行菌落PCR和單酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證后送至測序公司進(jìn)行序列測定。

1.6序列測定與分析

委托安徽通用生物有限公司對擴(kuò)增序列進(jìn)行測定。使用ClustalX、BioEdit和DNAstar分析軟件以及NCBI上的BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）對序列進(jìn)行比對等分析。使用MEGA6軟件對其系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果進(jìn)行分析，進(jìn)化樹的置信度用1 000次Bootstrap評價(jià)。

2結(jié)果與分析

2.1疑似病毒病的番茄病害田間癥狀

2015年7月，筆者在遼寧省進(jìn)行番茄病害調(diào)查研究時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)胤阎仓瓿霈F(xiàn)類似病毒病感染的癥狀，其果實(shí)呈現(xiàn)無規(guī)則壞死斑，早期呈灰白色，后期深褐色，有些病株會伴有葉片變小、皺縮和黃化等癥狀（圖1）。病株果實(shí)的壞死斑硬化，壞死斑塊上未發(fā)現(xiàn)霉層或菌核，初步懷疑是病毒病侵染危害。

2.2番茄病樣中病毒的分子檢測

對番茄病樣RNA進(jìn)行RT-PCR檢測以確定其感染的病毒種類。結(jié)果表明在利用煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）通用引物Tob-Uni1與Tob-Uni2進(jìn)行檢測時(shí)，采集的22份番茄樣品中有6份樣品擴(kuò)增到約800 bp的目的條帶，且健康番茄植株無該條帶（圖2），說明番茄病樣中可能有煙草花葉病毒屬病毒的感染。為進(jìn)一步明確其病毒類型，我們抽選6份樣品中的部分樣品進(jìn)行序列測定，序列BLAST分析結(jié)果顯示其與ToMMV（KF477193，99.2%）的同源性最高，說明檢測到的病毒可能是ToMMV的1個(gè)分離物。

2.3番茄病樣中ToMMV的分子檢測

為明確上述病毒是否為ToMMV的1個(gè)分離物，我們針對ToMMV CP基因設(shè)計(jì)出特異性擴(kuò)增引物ToMM CP_F與ToMM CP_R。RT-PCR結(jié)果顯示6份陽性樣品都能擴(kuò)增到和預(yù)期目的片段大?。?80 bp）接近的特異性條帶（圖3），表明該條帶為特異性的CP基因擴(kuò)增條帶。這進(jìn)一步說明遼寧省番茄病樣中檢測到的病毒可能是ToMMV。

2.4番茄病樣ToMMV CP基因序列分析

對所有陽性樣品擴(kuò)增到的ToMMV CP基因片段進(jìn)行克隆，并隨機(jī)選取3個(gè)樣品（樣品4、12、18）進(jìn)行Bam H I單酶切驗(yàn)證（圖3）。對6個(gè)陽性樣品的ToMMV CP基因克隆進(jìn)行序列測定，分析結(jié)果表明其序列全長480 bp，編碼1個(gè)大小約1.77×104的蛋白質(zhì)。序列比對分析結(jié)果顯示6個(gè)分離物之間的同源性在99.4%至100.0%之間，BLAST分析結(jié)果表明它們與ToMMV的同源性最高，表明該病毒屬ToMMV分離物。

為進(jìn)一步解析其分類地位，利用MEGA6將本試驗(yàn)測定序列與目前已公布的ToMMV CP序列（表2）比對后進(jìn)行聚類分析，以同屬的ToMV（NC_002692）、番茄褐色皺紋果病毒（Tomato brown rugose fruit virus，TBRV）（NC_028478）、地黃花葉病毒（Rehmannia mosaic virus，RheMV）（NC_009041）、TMV（NC_001367）作為外群，使用Kimura 2- parameter模型和臨近法（Neighbor-Joining，NJ）重建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果表明本研究測定的6個(gè)分離物（4、11、12、14、18、21）的CP序列全部聚類到ToMMV分支中，與其他ToMMV分離物的同源性在98.5%至99.8%之間。這些結(jié)果進(jìn)一步說明遼寧省番茄上檢測到的病毒為ToMMV。

3討論

番茄斑駁花葉病毒是近年來新發(fā)生的一種植物病毒，對多個(gè)國家包括番茄在內(nèi)的多種作物造成了嚴(yán)重?fù)p失。中國自2014年首次報(bào)道該病毒發(fā)生危害以來，目前至少已有7個(gè)省（市）出現(xiàn)該病毒發(fā)生危害[11-13]，其中番茄上僅海南有發(fā)生危害的報(bào)道[17]。本研究2015年在對遼寧省番茄上病毒病進(jìn)行調(diào)查時(shí)，在當(dāng)?shù)胤焉蠙z測到ToMMV，為遼寧省番茄上發(fā)現(xiàn)該病毒的首次報(bào)道。

除番茄[12]外，也有報(bào)道顯示ToMMV自然條件下還可以侵染危害辣椒[11]、茄子[13]等茄果類蔬菜作物，而室內(nèi)接種試驗(yàn)結(jié)果顯示ToMMV除侵染危害上述作物外，還可以侵染假酸漿、酸漿、矮牽牛、本氏煙、黃花煙草、大白菜、青菜、蘿卜、青花菜、花椰菜、油菜、擬南芥、野生昆諾黎等多種植物[5，11]。ToMMV作為煙草花葉病毒屬成員之一，它亦可以通過汁液摩擦等方式傳播擴(kuò)散，而且有些作物上已有報(bào)道種子亦可攜帶病毒[18]，因而其寄主種類與范圍可能比較廣泛[11]。在對不同品種之間的抗病性進(jìn)行評估時(shí)發(fā)現(xiàn)ToMMV比ToMV更容易侵染一些番茄品種，并產(chǎn)生更嚴(yán)重的癥狀[19]。因此在生產(chǎn)上要密切關(guān)注ToMMV的發(fā)生動態(tài)，加強(qiáng)種苗檢疫，早發(fā)現(xiàn)，早防控，減少損失。

番茄是公認(rèn)的世界范圍廣泛種植的重要蔬菜作物之一，生產(chǎn)中已發(fā)現(xiàn)的能侵染并危害番茄的病毒種類多達(dá)146種[1，20-22]，這些病毒通過單獨(dú)侵染或復(fù)合侵染的方式危害番茄，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，降低其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，從而限制番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此本研究在對遼寧省番茄上病毒病進(jìn)行調(diào)查時(shí)，除ToMMV外，也對采集的病樣中的其他病毒如煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜花葉病毒等進(jìn)行了檢測，在有些病樣中也檢測到番茄花葉病毒等病毒。這些結(jié)果一方面說明當(dāng)?shù)胤焉喜《痉N類可能比較復(fù)雜，要明確當(dāng)?shù)胤焉喜《痉N類需要更廣泛的樣本采集及更系統(tǒng)的病毒種類調(diào)查;另一方面本研究從田間采集的病樣中檢測到ToMMV，但ToMMV是否為導(dǎo)致番茄出現(xiàn)田間癥狀的主要原因還有待于進(jìn)一步的病毒分離及回接試驗(yàn)驗(yàn)證。

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（責(zé)任編輯：張震林）