韓麗麗,李明嫻,尹鳳先,丁艷艷

1 首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院,北京102600;2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院

據(jù)統(tǒng)計(jì)，慢性阻塞性肺疾病(COPD)在全球死亡原因中居第四位，隨著人口老齡化加劇和環(huán)境污染加重，其發(fā)病率仍在逐年上升[1-2]。目前，治療COPD的藥物以吸入性糖皮質(zhì)激素為基礎(chǔ)，地塞米松是其常用藥物，但長期使用易產(chǎn)生耐藥性[3]。迄今為止，COPD患者地塞米松耐藥的機(jī)制尚不完全清楚[4]。黏蛋白1(MUC1)是一種Ⅰ型跨膜蛋白，能夠介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞的抗炎癥反應(yīng)。有研究報(bào)道，MUC1缺失能夠加重COPD患者支氣管上皮屏障破壞[5-6]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，對皮質(zhì)類固醇激素耐藥的慢性鼻竇炎患者M(jìn)UC1表達(dá)下調(diào)[7]。由此推測，MUC1有可能成為預(yù)測激素耐藥的潛在生物標(biāo)志物。但目前尚無直接證據(jù)表明COPD患者地塞米松耐藥與MUC1表達(dá)缺失有關(guān)。2019年5月—2020年5月，本研究探討了人支氣管上皮細(xì)胞地塞米松耐藥與MUC1表達(dá)的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常支氣管上皮細(xì)胞NHBE(以下稱NHBE細(xì)胞)，購自美國ATCC細(xì)胞庫。所有引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。地塞米松，購自美國Sigma公司。Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司。IL-8、粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) ELISA檢測試劑盒，購自武漢默沙克生物科技有限公司。

1.2 香煙煙霧提取物(CSE)制備 設(shè)計(jì)CSE裝置，該裝置由一大一小兩個(gè)玻璃瓶經(jīng)橡膠管連接而成。大玻璃瓶有兩個(gè)開口，一個(gè)開口直通空氣，另一個(gè)開口通過橡膠管連接于裝有20 mL新鮮PBS的小玻璃瓶。小玻璃瓶通過橡膠管連接吸引器。在大玻璃瓶內(nèi)點(diǎn)燃1支未去過濾嘴的香煙(紅梅牌84 mm烤煙型香煙)，通過吸引器持續(xù)吸引，一共抽吸2支，抽吸時(shí)間5 min。將吸入的香煙煙霧通過橡膠管溶于20 mL PBS制成懸液，調(diào)整懸液pH為7.4，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即為100% CSE原液，其余濃度的CSE用PBS稀釋制成10%、25%、50% CSE溶液，分裝后凍存于-80 ℃冰箱。

1.3 細(xì)胞活力檢測 采用MTT法。將NHBE細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于96孔板，用200 μL含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，分別向96孔板中加入10%、25%、50%、100% CSE溶液20 μL，使CSE終濃度分別為1%、2.5%、5%、10%，另設(shè)陰性對照孔(不加入CSE)和空白對照孔(不加入NHBE細(xì)胞)。然后將96孔板置于恒溫箱孵育48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，恒溫孵育4 h，棄上清，加入DMSO溶液150 μL，輕輕振蕩混勻。酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.4 炎癥因子IL-8、GM-CSF檢測 將NHBE細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，用4 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，分別加入10%、25%、50%、100% CSE溶液400 μL，使CSE終濃度分別為1%、2.5%、5%、10%。干預(yù)48 h，收集各濃度CSE干預(yù)后的培養(yǎng)上清液，置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清液炎癥因子IL-8、GM-CSF。檢測儀器為Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，所有操作嚴(yán)格按IL-8、GM-CSF ELISA試劑盒說明進(jìn)行。從1%、2.5%、5%、10% CSE中，選擇引起NHBE細(xì)胞炎癥因子分泌增加的最小濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 地塞米松耐藥NHBE細(xì)胞構(gòu)建 取NHBE細(xì)胞4×105個(gè)，接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的BEGM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，加入1×10-7mol/L地塞米松200 μL，使地塞米松終濃度為1×10-8mol/L，每2～3天更換一次新鮮培養(yǎng)液。持續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月，收集細(xì)胞，設(shè)為耐藥細(xì)胞組，加入適量CSE溶液和地塞米松，使CSE終濃度達(dá)到上述篩選的最小濃度、地塞米松終濃度達(dá)到1×10-8mol/L。另取NHBE細(xì)胞，隨機(jī)分為非耐藥細(xì)胞1組和非耐藥細(xì)胞2組，非耐藥細(xì)胞1組加入適量CSE溶液，使CSE終濃度達(dá)到上述篩選的最小濃度；非耐藥細(xì)胞2組加入適量地塞米松，使地塞米松終濃度達(dá)到1×10-8mol/L。各組干預(yù)48 h，收集培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清液炎癥因子IL-8、GM-CSF。檢測儀器為Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，所有操作嚴(yán)格按IL-8、GM-CSF ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 MUC1 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-qPCR法。取耐藥細(xì)胞組、非耐藥細(xì)胞1組和非耐藥細(xì)胞2組干預(yù)48 h細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS中和消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫落。將細(xì)胞懸液收集于離心管中，1 500 r/min離心5 min、離心半徑8 cm，收集細(xì)胞沉淀。采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按cDNA合成試劑盒說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。將所得cDNA加入100 μL DEPC水稀釋，按TB Green Premix Ex Taq Ⅱ說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：MUC1上游引物5′-AATGAATGGCTCAAAACTTGG-3′，下游引物5′-CAGTAGGTTCTCACTCGCTCAG-3′；U6上游引物5′-TCGTCCTCATACTGCTCA-3′，下游引物5′-GAAACTACCTTCAACTCC-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL；反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min循環(huán)3次，94 ℃ 5 s、55 ℃ 5 s、70 ℃ 5 s循環(huán)40次。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CSE干預(yù)后NHBE細(xì)胞活力比較 0、1%、2.5%、5%、10% CSE干預(yù)后，NHBE細(xì)胞存活率分別為(100.0±3.4)%、(98.5±3.0)%、(97.4±3.6)%、(95.2±3.1)%、(85.6±2.5)%。隨著CSE濃度升高，NHBE細(xì)胞存活率逐漸降低，呈劑量依賴性(F=8.520，P<0.01)。5%、10% CSE干預(yù)后NHBE細(xì)胞存活率明顯低于0、1%、2.5% CSE干預(yù)后，并且10% CSE干預(yù)后NHBE細(xì)胞存活率低于5% CSE干預(yù)后(P均<0.05)。而0、1%、2.5% CSE干預(yù)后NHBE細(xì)胞存活率兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 不同濃度CSE干預(yù)后NHBE細(xì)胞分泌炎癥因子IL-8、GM-CSF水平比較 見表1。結(jié)果提示，引起炎癥因子IL-8、GM-CSF水平增加的CSE最小濃度為5%，故選擇5% CSE進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度CSE干預(yù)后NHBE細(xì)胞分泌IL-8、GM-CS水平比較

2.3 地塞米松耐藥NHBE細(xì)胞鑒定 各組炎癥因子IL-8、GM-CSF水平比較見表2。結(jié)果提示，耐藥細(xì)胞組地塞米松抑制NHBE細(xì)胞炎癥因子IL-8、GM-CSF分泌的作用消失，表明地塞米松耐藥NHBE細(xì)胞構(gòu)建成功。

表2 各組炎癥因子IL-8、GM-CSF水平比較

2.4 各組MUC1 mRNA表達(dá)比較 非耐藥細(xì)胞1組、非耐藥細(xì)胞2組、耐藥細(xì)胞組干預(yù)48 h MUC1 mRNA相對表達(dá)量分別為40.5±5.7、39.2±4.7、15.6±3.1。耐藥細(xì)胞組MUC1 mRNA相對表達(dá)量均低于非耐藥細(xì)胞1組和非耐藥細(xì)胞2組(t分別為15.201、14.305，P均<0.01)，而非耐藥細(xì)胞1組與非耐藥細(xì)胞2組MUC1 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.302，P>0.05)。

3 討論

目前，治療COPD的藥物以吸入性糖皮質(zhì)激素為基礎(chǔ)，地塞米松是其常用藥物。大部分COPD患者低劑量吸入地塞米松就能很好地控制癥狀，但部分患者需要更高劑量甚至口服才能達(dá)到最佳控制效果，表明這部分COPD患者對地塞米松的抗炎作用出現(xiàn)了抵抗。地塞米松耐藥是COPD治療過程中的常見問題，但目前對其耐藥機(jī)制尚不完全清楚，可能與糖皮質(zhì)激素受體磷酸化修飾改變、組蛋白脫氧酶2活性喪失等有關(guān)[4]。因此，深入探索地塞米松的耐藥機(jī)制，對尋找其潛在的生物標(biāo)志物或研發(fā)新的靶向藥物具有重要意義[8]。

MUC1是一種Ⅰ型跨膜蛋白，廣泛存在于呼吸道、胃腸道等上皮細(xì)胞以及各種免疫相關(guān)細(xì)胞表面[9]。以往MUC1通常作為一種腫瘤相關(guān)分子被研究，其在多數(shù)惡性腫瘤組織中過表達(dá)或異常糖基化[10]。有研究認(rèn)為，MUC1、E-cadherin和PINCH三者相互作用共同影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞間的黏附性并促進(jìn)其惡性進(jìn)展[11]。MUC1基因沉默可抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1、c-Myc和MMP-9表達(dá)有關(guān)[12]。MUC1與卵巢癌組織病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。在皮質(zhì)類固醇激素療效喪失的分子機(jī)制中，被分析最多的是磷脂酰肌醇3-激酶活化、組蛋白去乙?；?活性喪失以及糖皮質(zhì)激素受體對NF-κB的抑制作用等[4]，尚無證據(jù)表明其與MUC1表達(dá)變化有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，MUC1是一種重要的內(nèi)源性抗炎分子，在急性肺部感染中能夠促進(jìn)炎癥消退[14]。但其具體作用機(jī)制尚不明確。

COPD的主要特征是肺部異常炎癥反應(yīng)，這種炎癥持續(xù)存在通常與吸入有害氣體或顆粒有關(guān)，而最常接觸到的有害氣體是香煙煙霧。香煙煙霧能夠激活上皮細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6、GM-CSF和IL-8。本研究選擇GM-CSF、IL-8這兩種炎癥因子。在研究過程中，首先制備CSE并刺激支氣管上皮細(xì)胞，從而模擬COPD的炎癥反應(yīng)，根據(jù)CSE對NHBE細(xì)胞活力和對炎癥因子GM-CSF、IL-8分泌的影響，確定以5% CSE進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示，1×10-8mol/L地塞米松與5% CSE共同干預(yù)能夠明顯抑制NHBE細(xì)胞炎癥因子GM-CSF、IL-8分泌，提示1×10-8mol/L地塞米松對炎癥反應(yīng)具有明顯抑制作用。而1×10-8mol/L地塞米松持續(xù)干預(yù)NHBE細(xì)胞1個(gè)月，其抑制NHBE細(xì)胞炎癥因子分泌的作用明顯減弱，表明NHBE細(xì)胞對地塞米松已產(chǎn)生耐藥性。進(jìn)一步觀察了NHBE細(xì)胞地塞米松耐藥與MUC1表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地塞米松耐藥的NHBE細(xì)胞MUC1 mRNA相對表達(dá)量明顯降低，由此推測NHBE細(xì)胞地塞米松耐藥可能與MUC1表達(dá)降低有關(guān)。

綜上所述，人支氣管上皮細(xì)胞地塞米松耐藥可能與MUC1表達(dá)降低有關(guān)。