王永鋒 王雪剛 邢金春

前列腺癌是70歲以上老年男性最常見的惡性腫瘤。我國近10年來前列腺癌發(fā)病率呈顯著上升趨勢，前列腺癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，其最常見的遠處轉(zhuǎn)移是骨轉(zhuǎn)移，晚期可出現(xiàn)腦、肺等遠處器官轉(zhuǎn)移。大量研究表明，腫瘤的復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移與循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTC)有關(guān)。CTC是指從原發(fā)腫瘤脫落后侵襲進入血液循環(huán)系統(tǒng)中的原發(fā)腫瘤細胞，CTC可以通過血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，并且在其他組織發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶，部分前列腺癌患者早期診斷時已有遠處轉(zhuǎn)移，而常規(guī)的影像學(xué)、組織學(xué)或細胞學(xué)檢查難以發(fā)現(xiàn)[1]。臨床研究顯示血液中CTC的數(shù)量與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。同時，由于CTC攜帶有原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的信息，因此深入分析CTC攜帶的信息可以指導(dǎo)腫瘤患者用藥、檢測腫瘤抗藥性、及時調(diào)整治療方案等。CTC在前列腺癌的臨床分期、療效監(jiān)測、預(yù)后評估及內(nèi)分泌治療中有重要的臨床意義。

一、CTC概述

CTC通常指因自發(fā)或診療操作引起的從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶侵入人體血液循環(huán)的腫瘤細胞。1869年Ashworth首次在癌癥死亡患者的血液中發(fā)現(xiàn)類似腫瘤的細胞而提出此概念。外周血中的CTCs數(shù)量很少，每106～107個血細胞中可能只有1個CTC[2]。外周血中的CTC主要以單個細胞形式獨立存在，大部分在短期就會凋亡或被吞噬，極少數(shù)的腫瘤細胞會聚集成團形成循環(huán)腫瘤微栓子(circulating tumor microemboli, CTM)，跟隨血液系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到遠處器官。部分原發(fā)腫瘤細胞經(jīng)歷上皮間轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions, EMT)等過程獲得高侵襲性，從原發(fā)組織脫落，侵入周圍基質(zhì)并進入血液循環(huán)。

EMT是指在某些特殊的生理或病理條件下，上皮細胞失去極性，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸菩心芰Φ拈g質(zhì)細胞并獲得侵襲和遷移能力的過程。 EMT發(fā)生后，腫瘤細胞上皮標志如E-鈣黏素(E-cadherin)和細胞角蛋白(cytokeratin, CK)等表達下調(diào)，使細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增加，導(dǎo)致部分腫瘤細胞從原發(fā)組織脫落，侵入周圍基質(zhì)，進入血管或淋巴管，形成CTC，隨循環(huán)系統(tǒng)播散至遠隔部位，穿出脈管后在新的組織環(huán)境中生存和繁殖，最終形成轉(zhuǎn)移灶[3]。目前最為常用的CTC分離和富集技術(shù)為免疫磁性分離法，此技術(shù)是基于上皮細胞標志物如上皮細胞粘附分子(EpCAM)和CK的存在來檢測CTC，但是這一檢測方法常存在假陰性可能。Kasimir-Bauer等[4]檢測502例乳腺癌患者的外周血CTC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有18%的間質(zhì)性乳腺癌CTC未被檢測到。針對EpCAM的抗體可能無法檢測循環(huán)腫瘤EMT細胞，最新的CTC檢測系統(tǒng)已經(jīng)可以檢測具有EMT形態(tài)的CTC，使其檢測和分析更加便利[5]。

二、CTC的檢測技術(shù)

血液中的CTC相對于其他血細胞而言含量較少，在外周血中，約每106～107個血細胞中僅有1個CTC。不同腫瘤類型之間腫瘤細胞的特征和標志物也不盡相同，這就給CTC的檢測和標記帶來很大的困難。目前各種CTC檢測體系主要包括CTC的分離和富集系統(tǒng)以及CTC的檢測和鑒定系統(tǒng)。

1.CTC的分離和富集—免疫磁性分離法：通過將帶有羧基、氨基及生物素等修飾的Anti-EpCAM抗體與相對應(yīng)帶有羧基、氨基及親和素等修飾的磁球進行耦合反應(yīng)，形成對CTC具有特異性捕獲能力的免疫磁珠[5]。目前基于免疫磁性原理富集或同時檢測CTC的技術(shù)主要有CellSearch系統(tǒng)、免疫磁性細胞分選儀及AdnaTest癌細胞檢測系統(tǒng)。其中CellSearch系統(tǒng)是目前唯一被美國FDA批準的用于前列腺癌、直腸癌及轉(zhuǎn)移性乳腺癌的CTC的檢測技術(shù)[6-7]。該系統(tǒng)是通過免疫磁珠捕獲細胞后在外磁場存在，可以對CTC進行免疫熒光鑒定并計數(shù)[8]。利用該技術(shù)，研究人員能夠收集前列腺癌患者血液中的CTC，該技術(shù)的缺點是采用上皮細胞標志物篩選，會遺漏EMT的腫瘤細胞。

2.基于生物物理原理的富集法：生物物理的富集法是指利用CTC與血細胞在大小、密度和極性等差異，采用過濾、離心等方法實現(xiàn)分離。前列腺癌CTC的直徑比血細胞大，前列腺癌細胞的直徑約為11 μm，采用微過濾技術(shù)，通過精確設(shè)定濾膜的孔徑，能夠濾過血細胞(直徑約6.0～9.5 μm)將CTC捕獲。為了捕獲成簇出現(xiàn)的特異性CTC，Karabacak等[9]近期發(fā)明了一種基于微流控技術(shù)的三維微過濾芯片，能將成團的CTC截留。總體來說，基于生物物理方法分離的CTC操作較簡單，成本也更低，分離后的CTC往往還保留有生物活性。但這種方法也存在一些和血細胞大小相當?shù)腃TC難以分離而出現(xiàn)假陽性的情況。

3.CTC的檢測和鑒定：常見的檢測和鑒定技術(shù)主要包括免疫熒光技術(shù)、RCR技術(shù)、流式細胞分析及光纖陣列掃描技術(shù)(fiber-optic array scanning technology, FAST)等。RT-PCR技術(shù)以腫瘤細胞的mRNA為標志檢測CTC，具有靈敏度高、可重復(fù)性好及價格便宜等優(yōu)勢，是目前檢測CTC最有效的方法。但是由于檢測的是mRNA，在檢測過程中需要破壞CTC，導(dǎo)致無法計數(shù)，也不能對CTC進行形態(tài)學(xué)觀察[10]。

三、CTC檢測在前列腺癌中的應(yīng)用價值

1.非轉(zhuǎn)移性前列腺癌：Thalgott等[11]研究顯示局限性高危前列腺癌患者外周血CTC的陽性率為20%，健康對照組CTC的假陽性率為6.7%；Davis等[12]對97例局限性高危前列腺癌患者行前列腺切除術(shù)前的檢測發(fā)現(xiàn)，21%的患者外周血可以檢測到CTC，但同時健康無癌組也有20%的CTC假陽性率，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.946)。前列腺切除術(shù)后6周，基線CTC陽性率為16%，陰性率為11%，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.51)。綜合以上研究可以發(fā)現(xiàn)，在局限性高危前列腺癌患者外周血中CTC的檢測陽性率低，無法將外周血CTC檢測作為非轉(zhuǎn)移性前列腺癌的診斷依據(jù)，這可能與目前CTC檢測技術(shù)不夠靈敏有關(guān)。

2.局限性高危前列腺癌：針對這一類患者行根治術(shù)前，CTC的檢測是否具有預(yù)測生化復(fù)發(fā)的作用，有一些文獻進行了相關(guān)報道。Meyer等[13]檢測了152例擬接受前列腺癌根治術(shù)的患者術(shù)前外周血CTC，只有17例(11%)發(fā)現(xiàn)CTC陽性。經(jīng)過平均44.3(36～60)個月的隨訪后，CTC陰性患者和CTC陽性患者的生化復(fù)發(fā)率分別為68%和72%(P=0.66)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。據(jù)此可以發(fā)現(xiàn)在局限性高危前列腺癌患者術(shù)前CTC檢測陽性率低，術(shù)后根據(jù)術(shù)前的CTC檢測結(jié)果也不能很好的預(yù)測根治術(shù)后是否會發(fā)生生化復(fù)發(fā)，因此術(shù)前的CTC檢測不是預(yù)測根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)最佳的指標。

3.轉(zhuǎn)移性前列腺癌：①CTC的檢測對轉(zhuǎn)移性激素敏感型前列腺癌進展到去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant pristate cancer, CRPC)有明顯的預(yù)測價值。Goodman等[14]對33例轉(zhuǎn)移性激素敏感型前列腺癌患者接受雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy, ADT)進行研究，發(fā)現(xiàn)基線CTC計數(shù)是轉(zhuǎn)移性激素敏感型前列腺癌患者進展到CRPC的獨立預(yù)測因素。并且多因素分析顯示基線CTC數(shù)量是唯一的獨立預(yù)測因子。通過對每一個切點CRPC狀態(tài)對CTC的敏感性和特異性的閾值分析表明，當激素敏感型前列腺癌患者每7.5 ml血中發(fā)現(xiàn)超過3個CTC時，進展到CRPC的危險性明顯升高。②CTC的檢測對CRPC患者的應(yīng)用價值：轉(zhuǎn)移性前列腺癌給予ADT可使80%的患者病情穩(wěn)定或緩解，但在經(jīng)歷中位時間為18～30個月的去勢治療后，幾乎所有患者最終會進入去勢不敏感甚至抵抗階段，預(yù)后普遍較差[15]。Olmos等[16]對119例CRPC患者治療前CTC計數(shù)與總生存期之間的關(guān)系進行了研究，研究結(jié)果表明CTC≥5的患者的總生存時間為19.5個月，而CTC<5的患者的總生存時間為30個月，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外CRPC的患者經(jīng)治療后CTC計數(shù)下降>30%的患者具有較好的總生存期(overall survival, OS)。de Bono等[17]也報道了類似的研究結(jié)果，對231例進展性CRPC患者進行研究，在化療前1個月和化療1個月后檢測CTC，發(fā)現(xiàn)其中治療前CTC<5的患者中位OS為21.7個月，而≥5的中位OS為11.5個月，P<0.0 001。經(jīng)2～5周的治療后，CTC計數(shù)<5的患者中位OS為20.7個月，而經(jīng)治療后CTC≥5的患者的中位OS為9.5個月(P<0.0 001)。并且在治療期間，CTC計數(shù)的變化比前列腺特異抗原(prostate specific antigen, PSA)的變化更有預(yù)測價值，而且在療效評估方面可能比PSA更加敏感。一項國際多中心臨床試驗COU-AA-301[18]中，有研究者發(fā)現(xiàn)，在被批準用于進展性前列腺癌的新藥阿比特龍的使用中，對711例患者治療在12周后CTC計數(shù)變化+血清乳酸脫氫酶變化與生存的相關(guān)性優(yōu)于PSA的變化。高危組(CTC≥5個細胞/7.5 ml；LDH>250 U/L)、中危組(CTC≥5個細胞/7.5 ml；LDH≤250 U/L)及低危組(CTC<5個細胞/7.5 ml)的中位OS為(8.71 vs. 12.02 vs. 22.18)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這些發(fā)現(xiàn)進一步說明了CTC 計數(shù)可能成為一個潛在的替代性生物標記來反映患者的治療效果和生存率。

四、展望

CTC作為一項新興的前沿技術(shù)，在腫瘤的診斷、治療評估及監(jiān)測方面有巨大的潛力。盡管CTC的檢測還存在陽性率過低等問題，但目前已經(jīng)有了很大的發(fā)展空間。盡管目前的研究結(jié)果表明在局限性前列腺癌患者中其作用有限，但對于轉(zhuǎn)移性前列腺癌尤其是CRPC的患者，有大量的研究表明CTC計數(shù)是判斷前列腺癌預(yù)后的敏感因子，為前列腺癌的研究提供了重要依據(jù)。尤其是在CRPC患者的新藥臨床試驗中可以看到很好的應(yīng)用前景。大量以生存時間為主要終點的臨床試驗，運行的時間更長、成本更大和失敗的風險更高。迫切需要可重復(fù)和可靠的治療后檢測指標，為這些臨床研究提供支撐。前列腺癌經(jīng)過治療后，CTC計數(shù)數(shù)目的變化，可以很好的對抗腫瘤藥物進行療效評估和預(yù)后的評估，實現(xiàn)精準治療、避免醫(yī)療資源的浪費。盡管CTC的檢測目前仍受限于檢測技術(shù)，并且在我國前列腺癌中更深入廣泛的研究仍然欠缺，需要更多樣本、前瞻性的研究來證明其檢測的價值，但隨著相關(guān)研究的不斷深入和成熟，CTC將會被以更有效的方式應(yīng)用于臨床，并最終造福于患者。