劉彬果 葉盛英

【摘?要】?目的：建立測(cè)定排石顆粒中槲皮素和山奈素含量HPLC法。方法：用ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱;以甲醇-0.4%磷酸（55∶45）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。結(jié)果：槲皮素在0.025～0.495 μg（r=0.999 9）的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率為97.1%，RSD值2.5%（n=6）;山奈素在0.015～0.304 μg（r=0.999 9）的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率為100.2%，RSD值1.2%（n=6）。結(jié)論：該法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，結(jié)果可靠，可用于排石顆粒中槲皮素和山奈素的含量測(cè)定，為全面控制排石顆粒的質(zhì)量提供可靠方法。

【關(guān)鍵詞】?高效液相色譜法;槲皮素;山奈素;排石顆粒

【中圖分類號(hào)】R284.1?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）19-0052-04

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the content determination of?quercetin and kaempferide in Paishi granules.Methods The content of Quercetin and Kaempferide was determined by HPLC with ZORBAX SB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）.The mobile phrase was composed of methanl-0.4% phosphoric acid solution（55∶45）and detected at 360 nm when the column temperature was 25 ℃.Results The linear range of quercetin was 0.025～0.495 μg.The average recovery was 97.1%， RSD 2.5%.The linear range of kaempferide was 0.015～0.304 μg;The average recovery was 100.2%， RSD 1.2%.Conclusion This methods is simple and reliable.It is suitable for the content control of Quercetin and Kaempferide in Paishi granules.

Key?words：HPLC; Quercetin; Kaempferide; Paishi Granules

排石顆粒為第九八三醫(yī)院多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由金錢(qián)草、海金砂、車前草等9味藥材組成的復(fù)方制劑，方中金錢(qián)草甘咸微寒，清熱解毒，祛濕熱，退黃疸，利膽排石，為君藥。石韋、海金沙利水通淋，排石;車前草利水并能清下焦?jié)駸?均為治療淋病的常用藥，為臣藥，其有效成分為槲皮素和山奈素。白茅根涼血止血，清熱利尿;川楝子苦寒性降，行氣止痛;厚樸味辛行散，行氣燥濕;枳殼行氣寬中，化痰除痞，以上四味共為佐藥[1-2]。甘草調(diào)和諸藥，以為佐使。其現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)只有中藥定性鑒別的方法，沒(méi)有主要藥味的含量測(cè)定方法，為了更好的控制排石顆粒的質(zhì)量，采用高效液相色譜（HPLC）法以槲皮素和山奈素作為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，經(jīng)方法學(xué)考察，認(rèn)為本法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，無(wú)干擾，可用于排石顆粒制劑的質(zhì)量控制。

1?儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，OpenLAB CDS色譜工作站，ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱;槲皮素對(duì)照品（含量：99.6%，批號(hào)：120821-201212）;山奈素對(duì)照品（含量： 99.8%，批號(hào)：120821-201212）購(gòu)自中國(guó)食品藥品生物制品檢定所;水為超純水（自制），甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。排石顆粒（14430137，15260137，15040115，第九八三醫(yī)院制劑室）。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件?色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;甲醇-0.4%磷酸（55∶45）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2?對(duì)照品溶液的制備?對(duì)照品溶液的制備?取槲皮素對(duì)照品、山奈素對(duì)照品各適量，精密稱定，加80%甲醇溶解，定容，搖勻，制成每1 mL含槲皮素50 μg、山奈素30 μg的混溶液，即得。

2.3?供試品溶液的制備?取排石顆粒（15040115）約7 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇，稱定重量，超聲處理60 min（功率250 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。精密量取續(xù)濾液25 mL，置50 mL量瓶中，加入鹽酸（10%）5 mL，置90 ℃水浴中，水解1 h，取出，迅速冷卻，用80%甲醇定容，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4?空白溶液的制備?按處方比例及工藝制備不含金錢(qián)草的陰性對(duì)照樣品，按2.1項(xiàng)下制備方法得空白溶液。

2.5?專屬性試驗(yàn)?依據(jù)2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液及空白溶液各10 μL，測(cè)定。結(jié)果表明，在與對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間處，供試品溶液有槲皮素和山奈素特征吸收峰，而陰性對(duì)照液無(wú)相應(yīng)吸收峰，表明專屬性良好。見(jiàn)圖1。

2.6?線性關(guān)系的考察?分別精密稱取山奈素10.2 mg（純度：93.2%）、槲皮素對(duì)照品15.8 mg（純度：98.0%），置50 mL容量瓶中， 80%甲醇溶解，定容至刻度，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置25 mL容量瓶中，制備對(duì)照品溶液（槲皮素：24.77 μg/mL;山奈素：15.21 μg/mL）。分別精密吸取1 μL、2 μL、4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL、20 μL，依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，

得：槲皮素：Y =4263.5X-5.4208，r=0.999 9（n=8）;

山奈素：Y =5942.8X-2.8272，r=0.999 9（n=8）。

結(jié)果表明，槲皮素在0.025～0.495 μg的范圍內(nèi)，山奈素在0.015～0.304 μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7?精密度試驗(yàn)?精密吸取同一對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下各色譜條件分別測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，槲皮素和山奈素的RSD值分別為1.1% 和0.6%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8?穩(wěn)定性試驗(yàn)?同一供試品溶液（15040115），分別于0、2、4、6、8、9 h和10 h測(cè)定，得槲皮素和山奈素峰面積RSD分別為2.1%和1.5%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9?重復(fù)性試驗(yàn)?同一批樣品（15040115）6份，按2.3項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定。記錄峰面積，計(jì)算槲皮素和山奈素的含量的RSD分別為1.7%和1.8%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.10?加樣回收率試驗(yàn)?取已知含量的樣品（15040115）6份，每份約4.0g，精密稱定，精密加入槲皮素（0.196 mg/mL）和山奈素（0.041 mg/mL）對(duì)照品溶液各2 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果槲皮素的加樣回收率為97.1%，RSD為2.5%（n=6）;山奈素的加樣回收率為100.2%，RSD為1.2%（n=6）。見(jiàn)表1、2。

2.11?樣品測(cè)定?取樣品3批（14430137，15260137，15040115），按2.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，外標(biāo)法定量。計(jì)算三個(gè)批次的樣品中槲皮素和山奈素的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3?討論

3.1?指標(biāo)成分的選擇?排石顆粒中金錢(qián)草為君藥，主要功效成分為黃酮類 [1-3]，可作為中成藥的質(zhì)量控制指標(biāo)，在本研究中，選用黃酮類水解產(chǎn)物槲皮素和山奈素作為指標(biāo)成分測(cè)定，以其含量作為質(zhì)量控制的考察指標(biāo)。

3.2?測(cè)定波長(zhǎng)的選擇?參照中國(guó)藥典中金錢(qián)草的含量測(cè)定方法[4]，經(jīng)光譜掃描，槲皮素和山奈素在360 nm處均有較大吸收，故選取360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3?提取條件的選擇?在供試品的制備過(guò)程中， 采用超聲提取的方法，該方法簡(jiǎn)單，便于操作。同時(shí)對(duì)于提取時(shí)間進(jìn)行考察，考察了超聲處理40 min、60 min、80 min，研究發(fā)現(xiàn)，60 min超聲處理樣品可達(dá)到提取完全的目的，采用超聲提取60 min的方法制備供試溶液。

黃酮類化合物在植物體內(nèi)常與糖結(jié)合成苷類或碳糖基的形式存在，為了準(zhǔn)確測(cè)定其苷元的的含量，需進(jìn)行水解去糖。參考相關(guān)文獻(xiàn)及藥典方法[5-7]，采用酸水解法，考察了糖水解時(shí)的溫度、鹽酸含量、水解時(shí)間等，采用90 ℃水浴中加熱水解1小時(shí)，甲醇與10%鹽酸體積比為5∶1時(shí)，峰面積之和達(dá)到最大。因而，確定采用超聲60 min，90 ℃水浴中加熱水解1 h制備供試品溶液。

3.4?流動(dòng)相的選擇?因黃酮類成分含有酚羥基，呈弱酸性，故選擇酸性緩沖系統(tǒng)，參照藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[8-11]報(bào)道，采用甲醇-0.4%磷酸（55：45）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm;流速：1.0 mL.min-1;柱溫：室溫。可達(dá)到很好分離效果。

經(jīng)方法學(xué)考察，本方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，無(wú)干擾，可用于排石顆粒的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2020-05-09?編輯：劉?斌）