王 秀，張玉佩，吳小可，吳 楠，王衛(wèi)東，梅麗娟，陶燕鐸，楊小兵，于瑞濤*

(1. 中國科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 東莞金美濟(jì)藥業(yè)有限公司，廣東 東莞 523808)

康定鼠尾草(SalviaprattiiHemsl.)屬唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(S. Linn.)植物，產(chǎn)于四川西部和西北部、青海省南部等地區(qū)，早在幾千年前該屬種植物就成為重要的藥用植物[1]。鼠尾草屬植物全世界有1000 種，我國有83 種，青海省有3 種，分別為甘西鼠尾草、黏毛鼠尾草和康定鼠尾草[2-3]。鼠尾草主要含萜類、酚酸類、黃酮類、丹參酮類、揮發(fā)油、多糖等成分[4-7]。具有活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛及清熱安神等功效[1]。據(jù)報(bào)道鼠尾草對大鼠高原缺氧性肺、心、肝、脾、腎組織損傷均有明顯的預(yù)防和保護(hù)作用[8]，鼠尾草酚能下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)黏附淋巴細(xì)胞的能力[9]等。迷迭香酸是一類水溶性多酚類化合物[10]，是鼠尾草屬植物中的主要化學(xué)成分，迷迭香酸及其衍生物具有抗炎癥、抗抑郁、抗氧化、抗腫瘤、抗微生物及減輕過敏性鼻炎、哮喘癥狀，減弱T細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，減緩阿爾茨海默病的發(fā)展等生理作用，在制藥、食品及化妝品領(lǐng)域很有價(jià)值[11]。在改善睡眠、提高記憶力、維持葡萄糖平衡、減緩淀粉糊精樣變、抑制腸道病毒、減輕睪丸損傷、治療不孕不育等方面也有特殊藥理作用[12]。本研究以康定鼠尾草全草為原料，采用超聲波提取方法，以乙醇提取液濃度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)為考察因素，利用單因素結(jié)合L9(34)試驗(yàn)考察康定鼠尾草中迷迭香酸的提取工藝，為迷迭香酸提取物的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀為Agilent Technologies 1260 Ⅱ(安捷倫科技有限公司)；100S型超聲波清洗機(jī)(深圳市潔邁超聲清洗設(shè)備有限公司)；upt-Ⅱ-100L型超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；FA2004型電子天平(常州科源電子儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑

康定鼠尾草2019年8月采自青海省玉樹，迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品購自阿拉丁公司(生產(chǎn)批號(hào)：H1828073)，甲醇、無水乙醇均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

準(zhǔn)確稱量迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品0.001 2 g，用甲醇定容至10 mL。制成濃度為0.012 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱量康定鼠尾草粉末1.014 0 g于具塞錐形瓶中，加入60%乙醇30 mL，室溫下40 kHz超聲提取30 min，0.5 μL濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Reprosil Gold 120 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：5-95%乙腈-0.2%酸水(H3PO4)；紫外檢測波長：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液的HPLC色譜圖見圖1所示。

2.4 單因素試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)選出對康定鼠尾草中迷迭香酸提取具有顯著影響的因素，并確定其試驗(yàn)水平?？疾觳煌掖紳舛?、提取時(shí)間、料液比對康定鼠尾草中迷迭香酸提取的影響。各水平的選取參照遲曉峰[13]的方法并根據(jù)實(shí)際情況做了一定調(diào)整?？疾斓母鱾€(gè)因素水平見表1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard and sample注：A：標(biāo)準(zhǔn)品； B：康定鼠尾草樣品； 1：迷迭香酸

表1 單因素試驗(yàn)各因素水平表

2.4.1 乙醇濃度對提取效果的影響

以料液比為1∶30，40 kHz超聲30 min，室溫，提取次數(shù)為1次的條件下，考察不同乙醇濃度對迷迭香酸提取的影響。

2.4.2 提取時(shí)間對提取效果的影響

以料液比為1∶30，乙醇濃度為80%，40 kHz超聲，室溫，提取次數(shù)為1 次的條件下，考察不同的提取時(shí)間對迷迭香酸提取的影響。

2.4.3 料液比對提取效果的影響

以乙醇濃度為80%，40 kHz超聲20 min，室溫，提取次數(shù)為1次的條件下，考察不同的料液比對迷迭香酸提取的影響。

2.5 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素初篩試驗(yàn)結(jié)果及正交設(shè)計(jì)助手分析結(jié)果，確定對試驗(yàn)影響較大的因素和較好的水平，再加入提取次數(shù)因素，每個(gè)因素三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，采用SPSS Statistics17.0[14]軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 乙醇濃度對迷迭香酸提取的影響

以料液比為1∶30(g∶mL)，40 kHz超聲30 min，室溫，提取次數(shù)為1次的條件下，考察不同乙醇濃度對迷迭香酸提取的影響。

表2 乙醇濃度單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Single factor experimental results of ethanol concentration

由表2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，迷迭香酸的提取量逐漸增加。當(dāng)乙醇濃度到達(dá)80%時(shí)提取量呈現(xiàn)最大值后呈下降趨勢。這可能是由于乙醇濃度超過適宜乙醇濃度會(huì)增加其他物質(zhì)的溶出，降低迷迭香酸的相對含量，而且提高了投料成本，所以乙醇濃度選擇80%。

3.1.2 提取時(shí)間對迷迭香酸提取的影響

以料液比為1∶30(g∶mL)，乙醇濃度為80%，室溫，提取次數(shù)為1次的條件下，考察不同的提取時(shí)間對迷迭香酸提取的影響。

表3 提取時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Single factor experimental results of extraction time

由表3可以看出，隨著提取時(shí)間增長，迷迭香酸提取量呈微弱的波動(dòng)，為了節(jié)約時(shí)間成本，所以提取時(shí)間選擇20 min、30 min、40 min。

3.1.3 料液比對迷迭香酸提取的影響

以乙醇濃度為80%，室溫超聲20 min，提取次數(shù)為1 次的條件下，考察不同的料液比對迷迭香酸提取的影響。

表4 料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Single factor results of material liquid ratio

由表4可以看出，隨著料液比的降低，迷迭香酸提取量呈微弱的波動(dòng)，為了節(jié)約溶劑成本及將來工業(yè)化生產(chǎn)需要，因此選擇料液比1∶8(g∶mL)，1∶11(g∶mL)，1∶14(g∶mL)。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素初篩結(jié)果，分別以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間為因素，再加入提取次數(shù)因素(提取1次、提取2次、提取3次)，每個(gè)因素三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表5。

表5 正交試驗(yàn)因素水平表Table 5 The results of orthogonal test

用正交設(shè)計(jì)助手軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)直觀分析，結(jié)果如表6所示。

表6 正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果Table 6 Visual analysis results of orthogonal test

由表6可以看出，康定鼠尾草中迷迭香酸最優(yōu)工藝為A2B2C3D3，即乙醇濃度為80%、提取時(shí)間為30 min、料液比為1∶14(g∶mL)，提取次數(shù)為3次。提取次數(shù)對迷迭香酸的提取影響最大，乙醇濃度對提取影響最小。

根據(jù)單因素初篩試驗(yàn)結(jié)果及正交設(shè)計(jì)助手分析結(jié)果，分別確定提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)三個(gè)因素，將乙醇濃度項(xiàng)設(shè)為空列，借助SPSS Statistics17.0進(jìn)行方差分析。

表7 方差分析結(jié)果(主體間效應(yīng)的檢驗(yàn))Table 7 Results of analysis of variance (main effect)

由方差分析可知，影響因素中提取次數(shù)對提取迷迭香酸具有顯著性影響，而料液比對其的影響較小(表7)。因素的主次關(guān)系是：提取次數(shù)>提取時(shí)間>料液比。

試驗(yàn)結(jié)果表明，從3 個(gè)因素中選擇最好的水平，得到的最佳組合為B2C3D3，即提取時(shí)間為30 min，提取次數(shù)為3次，料液比為1∶14(g∶mL)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以康定鼠尾草全草為原料，對迷迭香酸進(jìn)行了超聲提取工藝優(yōu)化研究。采用單因素和L9(34)正交分析法對乙醇濃度，提取時(shí)間，料液比，提取次數(shù)四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。利用正交設(shè)計(jì)助手軟件與SPSS Statistics17.0軟件相結(jié)合的分析方法，通過直觀分析可知，四個(gè)因素的主次關(guān)系為提取次數(shù)>提取時(shí)間>料液比>乙醇濃度。乙醇濃度因素在正交分析時(shí)極差值最小，因此在利用方差分析時(shí)將乙醇濃度設(shè)為空白列。但在單因素試驗(yàn)中，乙醇濃度在80%時(shí)迷迭香酸含量最高。在方差分析時(shí)，提取時(shí)間為30 min時(shí)，提取次數(shù)為3 次、料液比為1∶14(g∶mL)時(shí)迷迭香酸含量最高。綜上所述，提取鼠尾草中迷迭香酸最優(yōu)工藝為A2B2C3D3，即乙醇濃度為80%、提取時(shí)間為30 min、料液比為1∶14(g∶mL)，重復(fù)提取次數(shù)為3 次。在此條件下迷迭香酸提取效果最佳，迷迭香酸含量可達(dá)9.85 mg/g。通過康定鼠尾草中迷迭香酸提取工藝的研究，為迷迭香酸提取物的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。