鐘春蕾，黃國濤，張志強

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

膿毒癥是以感染為誘因的全身炎癥反應，其病死率可達30%～50%[1]。在膿毒癥并發(fā)的器官損傷中，急性肺損傷發(fā)病率最高且出現(xiàn)最早，也是造成膿毒癥患者死亡的主要原因[2]。因此，如何有效防治膿毒癥肺損傷是臨床亟待解決的棘手問題。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，也是革蘭氏陰性細菌感染的主要致病因素，而革蘭氏陰性細菌感染是膿毒癥主要誘因，所以LPS常用作誘導構建膿毒癥急性肺損傷模型[3]。五味子乙素是中藥北五味子中含量最高的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素，其具有抗哮喘[4]、抗腫瘤[5]、抗感染[6]、保肝[7]和保護心臟[8]等多種生理作用，Cai等[9]報道，五味子乙素能夠減輕LPS誘導的急性肺損傷的炎癥反應。核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是機體一種關鍵性調控因子，通過調控多種基因的表達，參與免疫反應、炎癥反應和細胞凋亡等多種生命活動[10]。已有文獻報道，NF-κB在LPS誘導的肺損傷發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[11]。本研究主要觀察五味子乙素對脂多糖誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織病理損傷、炎癥反應和NF-κB表達的調節(jié)作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質量為180～200 g，健康狀況良好，購自四川成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2019-0028。大鼠在25 ℃，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的飼養(yǎng)室，自由獲取水和食物。在實驗前1周開始適應性喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑 五味子乙素(純度≥98%，批號 20181156-2)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；地塞米松(純度≥98%，批號 D1756-181013)購自北京賽因百奧生物技術有限公司；LPS購自美國Sigma公司；BCA試劑盒購自上海酶聯(lián)；牛鮑氏計數(shù)板購自上海愛寶醫(yī)療器械公司；ELISA試劑盒購自美國 Invitrogen公司；NF-κB p65、磷酸核因子 κB 抑制蛋白(phosphorylation inhibitor of nuclear factor kappa-B，pIκBα)和Toll樣受體4(toll-like receptors 4，TLR4)兔單抗及山羊抗兔多克隆二抗購自美國Abcam公司。

1.3 儀器 ME103E-02電子天平：梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；MR-96A酶標分析儀：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份公司；GL-21M高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；XSP-8CA顯微鏡：上海光學儀器廠。

2 方法

2.1 模型復制和分組給藥 將SD大鼠隨機分為對照組、模型組、五味子乙素組、地塞米松組，每組10只。模型組、五味子乙素組和地塞米松組大鼠采用氣管滴注8 mg/kg LPS制備急性肺損傷大鼠模型[12]，對照組氣管滴注等量生理鹽水。五味子乙素組大鼠在模型復制前1 h腹腔注射80 mg/kg五味子乙素[9，13]；地塞米松組大鼠在模型復制前1 h腹腔注射20 mg/kg地塞米松；對照組和模型組分別注射等量生理鹽水。模型復制12 h后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用PBS沖洗氣道，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalceolar lavage fluid，BALF)和肺組織。

2.2 觀察指標及方法

2.2.1 肺濕/干質量比測定 用電子天平稱新鮮肺組織的質量為肺的濕質量，然后將其置于80 ℃烤箱中烘烤2 d后稱干質量，計算肺組織的濕/干質量比。

2.2.2 BALF中總蛋白測定 于冰上用RIPA蛋白裂解液提取BALF中總蛋白，按照BCA試劑盒操作說明測定BALF中總蛋白。

2.2.3 BALF中白細胞計數(shù) 利用牛鮑氏計數(shù)板，并采用雙人雙盲法計算BALF中白細胞數(shù)。

2.2.4 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察肺組織損傷情況 取右肺組織，用4%甲醛固定，并經(jīng)乙醇梯度脫水后，石蠟包埋并切片，脫蠟復水后，HE染色，顯微鏡下觀察肺組織損傷情況。

2.2.5 ELISA法檢測肺組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量 按照ELISA試劑盒說明書測定TNF-α、IL-1β、IL-6水平。于已包被好的反應孔中加入0.1 mL的樣品，37 ℃孵育1 h；洗滌后，加入0.1 mL稀釋的酶標抗體，37 ℃ 孵育1 h；加底物液顯色，孵育30 min，加入終止液，測定吸光度值。

2.2.6 試劑盒檢測肺組織中丙二醛(malondialdyhyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量 按照MDA和SOD試劑盒說明書檢測MDA、SOD含量。

2.2.7 蛋白質印跡檢測肺組織中NF-κB p65、pIκBα和TLR4的表達水平 于冰上用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每組取30 μL蛋白質用SDS-PAGE分離后，轉移蛋白質到PVDF膜；室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，以1∶1 000的濃度加入相對應的一抗，4 ℃孵育過夜；棄去一抗，清洗PVDF膜后，加入二抗，室溫下封閉1 h；滴加ECL于暗室曝光顯影。

3 結果

3.1 各組大鼠肺濕/干質量比比較 與對照組相比，模型組大鼠肺濕/干質量比顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，五味子乙素組和地塞米松組大鼠肺濕/干質量比顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注：A.對照組；B.模型組；C.五味子乙素組；D.地塞米松組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組大鼠BALF中總蛋白含量及白細胞數(shù)比較 與對照組相比，模型組大鼠BALF中總蛋白含量及白細胞數(shù)均顯著增多(P<0.05)；與模型組相比，五味子乙素組和地塞米松組大鼠BALF中總蛋白含量及白細胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)。見圖2。

注：A.對照組；B.模型組；C.五味子乙素組；D.地塞米松組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 各組大鼠肺組織病理損傷情況比較 對照組大鼠肺組織結構清晰完整，肺泡腔內無滲出物，肺間質無水腫，肺泡間隔未出現(xiàn)增厚；模型組大鼠肺泡結構破壞嚴重，肺泡腔廣泛出血并可見炎癥細胞浸潤，肺間質出現(xiàn)水腫，肺泡間隔明顯增厚；五味子乙素組和地塞米松組大鼠肺泡結構破壞程度明顯減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少，肺間質水腫程度明顯降低，肺泡間隔未見明顯增厚。見圖3。

注：A.對照組；B.模型組；C.五味子乙素組；D.地塞米松組

3.4 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 與對照組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著增多(P<0.05)；與模型組相比，五味子乙素組和地塞米松組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著減少(P<0.05)。見圖4。

注：A.對照組；B.模型組；C.五味子乙素組；D.地塞米松組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.5 各組大鼠肺組織中MDA、SOD含量比較 與對照組相比，模型組大鼠MDA含量顯著上升，SOD活性顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，五味子乙素組和地塞米松組大鼠MDA含量顯著下降、SOD含量顯著上升(P<0.05)。見圖5。

注：A.對照組；B.模型組；C.五味子乙素組；D.地塞米松組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.6 各組大鼠肺組織中NF-κB p65、pIκBα和TLR4蛋白表達水平比較 與對照組相比，模型組大鼠NF-κB p65、pIκBα和TLR4表達水平均顯著上調(P<0.05)；與模型組相比，五味子乙素組和地塞米松組大鼠NF-κB p65、pIκBα和TLR4表達水平均顯著下調(P<0.05)。見圖6。

注：A.對照組；B.模型組；C.五味子乙素組；D.地塞米松組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

急性肺損傷是各種直接或間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，進而導致的急性低氧性呼吸功能不全的疾病。有研究[14]報道，LPS誘導急性肺損傷大鼠肺濕/干質量比明顯升高，肺部出現(xiàn)水腫、充血和炎癥細胞浸潤，采用鹽酸戊乙奎醚治療后，大鼠肺濕/干質量比明顯降低，肺部出現(xiàn)的水腫、充血和炎癥細胞浸潤程度顯著減輕，說明鹽酸戊乙奎醚具有治療LPS誘導急性肺損傷的作用。而本次筆者通過研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素也能夠顯著減少LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷模型大鼠的肺濕/干質量比、BALF中總蛋白含量和白細胞數(shù)，并顯著減輕LPS誘導的肺泡結構破壞、肺泡腔出血、炎癥細胞浸潤和肺泡間隔增厚等膿毒癥急性肺損傷程度。結果表明，五味子乙素也能夠治療LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷。

TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子表達水平和炎癥反應水平是呈正相關的，炎癥因子增加是膿毒性急性肺損傷的重要標志。Chi等[15]的研究表明，異鼠李堿通過抑制炎癥反應，保護小鼠免受LPS誘導的急性肺損傷。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素通過抑制炎癥反應預防LPS誘導的急性肺損傷。所以，抑制炎癥反應是有效治療LPS誘導的肺損傷的重要途徑。本研究結果表明，五味子乙素能顯著減少LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6含量，這說明五味子乙素能夠減緩LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷引起的炎癥反應。這與已有報道五味子乙素能夠防止香煙煙霧誘導的肺部炎癥[17]，五味子乙素抑制LPS誘導的人臍靜脈內皮細胞炎癥反應[18]相一致。

LPS可誘導機體產(chǎn)生過多的氧自由基，從而引起氧化應激反應。Du等[19]研究表明，沙棘膏通過降低氧化應激對LPS誘導的急性肺損傷小鼠起保護作用。Fu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定通過抑制大鼠氧化應激、線粒體功能障礙和細胞凋亡，減輕LPS誘導的急性肺損傷。因此，抑制機體氧化應激反應可有效治療LPS誘導的急性肺損傷。本研究結果表明，五味子乙素能顯著降低LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠MDA含量，升高SOD含量，這說明五味子乙素能夠減緩LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷引起的氧化應激，與Ying等[21]發(fā)現(xiàn)五味子乙素通過調節(jié)抗氧化通路緩解急性氧化應激，Xin等[22]報道五味子乙素減輕創(chuàng)傷性脊髓損傷誘導的氧化應激反應相一致。

LPS誘導肺損傷的發(fā)病機制與NF-κB通路密切相關。Niu等[23]報道，卡維丁通過NF-κB信號通路改善LPS誘導的急性肺損傷。Peng等[24]發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內酯磺酸鹽通過MAPK和NF-κB通路改善LPS誘導的急性肺損傷。因此，五味子乙素減緩LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷可能與NF-κB通路有關。本研究結果表明，五味子乙素能夠顯著下調LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠的NF-κB p65、pIκBα和TLR4表達量，這說明五味子乙素能夠抑制LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷引起的NF-κB通路激活。

地塞米松是一種糖皮質激素，具有良好的抗炎作用，可以在短期之內減輕紅、腫、熱、痛等癥狀。因此，本研究選用地塞米松作為陽性對照藥物。長期使用地塞米松會造成過敏性休克、呼吸困難、低鉀血癥、肌無力、精神恍惚、消化不良等癥狀，而五味子乙素治療膿毒癥急性肺損傷的效果和作用與地塞米松相似，但其毒性和不良反應小。

本研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能夠減輕LPS誘導膿毒癥急性肺損傷大鼠的肺組織病理損傷，抑制炎癥反應和氧化應激反應，抑制NF-κB通路激活，從而來減緩LPS誘導的大鼠膿毒癥急性肺損傷。這為五味子乙素的開發(fā)利用提供參考依據(jù)，為膿毒癥急性肺損傷的治療奠定基礎。