沈吉麗，肖勝華，惠慧，努日曼古麗·艾尼，胡琴，張曉君，楊兆光，聶新輝*，朱龍付*

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子832000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070）

棉花（Gossypium hirsutum）是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，已在世界范圍內(nèi)種植，而病害是其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要限制因素[1]。 黃萎病在中國是棉花生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一[2]。 木質(zhì)素是維管束植物次級細(xì)胞壁（Secondary cell wall,SCW）的重要成分[3]。 木質(zhì)素的生物合成受發(fā)育信號和環(huán)境刺激的控制，例如紫外線照射、傷口和病原侵染[4-5]。 在擬南芥中，SG2 型R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子（V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）MYB15 是防御誘導(dǎo)的木質(zhì)化和先天免疫的調(diào)節(jié)因子[6]。 GhLac15 通過增強(qiáng)防御誘導(dǎo)的木質(zhì)化來提高對黃萎病的抗性[7]。 盡管已經(jīng)報(bào)道了涉及木質(zhì)素生物合成的許多基因，但是目前在棉花中報(bào)道的調(diào)控木質(zhì)素生物合成的MYB 轉(zhuǎn)錄因子還很少。

茉莉酸（Jasmonic acid,JA）是1 種脂源性植物激素， 可調(diào)節(jié)植物免疫和發(fā)育的各個(gè)方面[8-9]。曾報(bào)道GbWRKY1 在JA 介導(dǎo)的防衛(wèi)基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄中具有明顯的負(fù)調(diào)控作用，這表明GbWRKY1可能是通過負(fù)調(diào)控JA 信號通路（轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑）在植物抗病性反應(yīng)中起作用。 GhHB12 參與對大麗輪枝菌（Verticlillium dahliae）和JA 信號的響應(yīng)，并且GhHB12 僅抑制某些JA 響應(yīng)基因（GhJAZ2和GhPR3）表達(dá)，但不抑制棉花的整個(gè)JA 信號通路[10-11]。 如何激活棉花與大麗輪枝菌互作過程中JA 的合成和信號通路尚待探索。

植物轉(zhuǎn)錄因子MYB 是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，與植物生長發(fā)育、生理代謝、細(xì)胞的形態(tài)和模式建成等生理過程有關(guān)[12]。 已通過遺傳分析和分子分析對MYB 類轉(zhuǎn)錄因子在許多植物物種中的功能進(jìn)行了研究， 例如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、矮牽牛 （Petunia hybrida）、 金魚草（Antirrhinum majus）、 葡萄 （Vitis vinifera L.）、 楊樹（Populus tremuloides） 和蘋果 （Malus domestica）[13]。 At-MYB125 是控制雄性生殖細(xì)胞分裂和分化的花粉特異性因子[14]；AtMYB33 和AtMYB65 促進(jìn)了花藥和花粉的發(fā)育[15]；MYB189 在擬南芥和毛果楊（P.trichocarpa）中的過表達(dá)導(dǎo)致木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的含量顯著降低，并且使莖中的維管發(fā)育受到明顯抑制，導(dǎo)致木質(zhì)部纖維的次生細(xì)胞壁厚度顯著降低[16]。 SlMYB21 對JA 生物合成具有正向調(diào)節(jié)作用，而對生長素和赤霉素則具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果表明，SlMYB21 至少部分介導(dǎo)JA 的作用，并可能控制花到果的過渡[17]。然而，關(guān)于MYB 在棉花防御反應(yīng)中調(diào)控JA 信號通路的作用的報(bào)道很少。

近年來，棉花黃萎病的發(fā)生給棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響，并且陸地棉中缺乏有效的抗源。 抗病基因鑒定及其抗病機(jī)制研究對于棉花多抗種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要意義。 因此，本研究篩選到1 個(gè)GhLac1 上游的R2R3-MYB類調(diào)節(jié)因子基因，通過超表達(dá)和病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS）技術(shù)，對其功能進(jìn)行初步鑒定，進(jìn)一步探討棉花對黃萎病的反應(yīng)機(jī)制，為棉花抗病育種提供理論依據(jù)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試植物材料： 黃萎病感病品種陸地棉Jin668（G.hirsutum L.cv.Jin668），耐病品種海島棉7124（G.barbadense L.cv.7124，簡稱“海7124”）及陸地棉YZ1 （Gossypium hirsutum cv.YZ1），均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花課題組保存。

煙草材料為本氏煙（Nicotiana benthamiana），種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花樓附樓光照培養(yǎng)室。

1.2 酵母單雜交（Yeast one hybrid, Y1H）

將目的基因啟動子（Bait） 重組在載體質(zhì)粒pHISi-1 上， 將重組好的質(zhì)粒進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）陽性檢測，并測序比對，保證目的序列無突變。 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Y1H 菌株涂布于含有0、15、30 mmol·L－13-氨基-1，2，4- 三唑（3-AT）的SD/-Trp/-His 營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，進(jìn)行酵母互作分析，將培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 d， 觀察菌斑的生長情況[18]。

1.3 GhMYB43 基因的序列分析和植物轉(zhuǎn)化

GhMYB43 基因的全長序列可從網(wǎng)站https://cottonfgd.org/ 獲得。 分別使用ClustalX（http://www.clustal.org/）和MEGA5（http://www.megasoftware.net/）比對氨基酸序列和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

從Jin668 克隆全長GhMYB43， 并通過attB與attP 位點(diǎn)（BP）重組和attL 與atRR 位點(diǎn)重組（Invitrogen）插入Gateway 載體pK2GW7.0（Ghent University）中，以生成過表達(dá)載體。根據(jù)先前的研究方法[19]，通過根癌農(nóng)桿菌（菌株GV3101）介導(dǎo)法用GhMYB43 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Jin668。

1.4 供試菌株、載體

所用的菌株是大腸桿菌TOP10 和根癌農(nóng)桿菌GV3101 菌株， 它們均由本研究小組儲存在20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的甘油中，并儲存在－80 ℃的超低溫冰箱中。

所用的載體：中間載體pDONER221、pDONERZ60、pGBKT7、pGADTT7 等，亞細(xì)胞定位載體pMDC43， 均 保 存 在－80 ℃；VIGS 中 間 載 體pTRV1、pIRV2、pTRVCLA，由荷蘭瓦赫寧根大學(xué)Bart P. H. J. Thomma 教授提供， 保存在本課題組； 超表達(dá)載體pGWB409 和干涉載體pHellsgate4 保存于本課題組。

1.5 棉花DNA 及RNA 的提取

棉花DNA 提取主要參照天根植物DNA 提取試劑盒（Tiangen Biotech,DP305），具體操作步驟參見產(chǎn)品說明。 采用天根生化科技有限公司RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（DP441）提取棉花不同組織的RNA。

1.6 RNA 逆轉(zhuǎn)錄（RT）及實(shí)時(shí)定量PCR 分析

從－80 ℃冰箱中取出提取備用的RNA，通過0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性， 用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo）測定核酸濃度。 RNA 逆轉(zhuǎn)錄具體操作步驟：①基因組DNA 的除去反應(yīng)。 加入2.0 μL 的5×gDNA Eraser Buffer，1.0 μL 的 gDNA Eraser，RNA 總量≤1.0 μg， 用RNA Free ddH2O 補(bǔ)充體系到10.0 μL。 于42 ℃溫浴2 min 或者室溫放置30 min，放于4 ℃冰箱或置于冰上備用。 ②RNA逆 轉(zhuǎn) 錄 反 應(yīng)。 5×PrimeScriptBuffer 2（Real Time）4.0 μL，1.0 μL PrimeScriptRT Enzyme Mix Ⅰ，1.0 μL RT Primer Mix，10.0 μL 的步驟①反應(yīng)液，4.0 μL RNase Free ddH2O。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在37 ℃的水浴中進(jìn)行15 min （或用PCR 儀完成此步），然后酶滅活反應(yīng)在85 ℃的高溫水浴中進(jìn)行5 s，將合成的cDNA 置于－20 ℃冰箱保存。

RT-qPCR 具體操作步驟： 將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 取出，加水稀釋100 倍后作為反應(yīng)模板。先加入SYBR Green mix（Bio-Rad），7.5 μL；再加入正反向引物各0.25 μL；最后，加入稀釋好的cDNA模板。 使用ABI Prism 7500 Sequence Detection System 儀器和軟件（Applied Biosystems,USA）檢測， 程序?yàn)?5 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃35 s，40個(gè)循環(huán)。 每個(gè)反應(yīng)3 次生物學(xué)重復(fù)。 本研究所用RT-qPCR 引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 RT-qPCR primers used in this study

1.7 亞細(xì)胞定位分析

采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法， 用構(gòu)建好的35S∷Gh-MYB43-GFP 融合表達(dá)載體、空載體（35S-GFP）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101。按照煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，選取培養(yǎng)3 周的煙草，將準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液注射到完整且平展的煙草葉片中。 注射后對侵染的煙草葉片避光處理，48 h 后在熒光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 VIGS 分析

使用BamHⅠ和KpnⅠ將GhMYB43 的cDNA 序列克隆到基于煙草脆裂病毒（Tobaceo rattle virus, TRV） 的質(zhì)粒中， 以構(gòu)建TRV∷Gh-MYB43 VIGS 載體，然后如前所述通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101 中[19]。如前所述[20]，使用無針注射器將攜帶TRV∷00（對照）和TRV∷GhMYB43 載體的農(nóng)桿菌注射到已生長10 d 的海7124 幼苗的子葉中。侵染約10 d 后，從棉花根中提取RNA 以測定GhMYB43 的表達(dá)水平。 保持在25～28 ℃的恒定溫度下，光周期（暗/ 光）為8 h/16 h，相對濕度為60%。

1.9 超表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)獲得的全長GhMYB43 cDNA 設(shè)計(jì)引物。 將SacⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基分別添加到引物的兩端。然后，以GhMYB43 基因的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 PCR 產(chǎn)物用SacⅠ和XbaⅠ酶切， 并用DNA Recovery Kit（Qiagen DNA 回收試劑盒）回收。pGEB409 和pHellsgate4也用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切， 大片段用DNA Recovery Kit 回收。 將回收的PCR 片段與大載體片段在4 ℃下連接，并通過PCR 驗(yàn)證連接產(chǎn)物。 將構(gòu)建的過表達(dá)和干涉載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。

1.10 Southern 雜交（地高辛標(biāo)記法）

為確定轉(zhuǎn)GhMYB43 基因株系的DNA 序列拷貝數(shù)，采用植物基因組DNA 試劑盒DP305（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。用HindⅢ（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室） 酶切20 mg 基因組DNA 60 h， 根據(jù)制造商的說明， 使用DIG-High Prime DNA 標(biāo)記和檢測起始試劑盒Ⅱ（Roche）進(jìn)行Southern 雜交。 用nptⅡ基因片段作為探針檢測拷貝數(shù)。

1.11 黃萎病菌接種和病情分析

用大麗輪枝菌菌株V991 接種Jin668（野生型，WT） 和轉(zhuǎn)基因系的幼苗。 保持培養(yǎng)在25～28 ℃的恒定溫度下，光周期（暗/ 光）為8 h/16 h，相對濕度為60%。持續(xù)觀察病情。每處理使用至少25 株的病情指數(shù)和發(fā)病率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并重復(fù)至少3 次。 根據(jù)Xu 等[21]公式計(jì)算病情指數(shù)和發(fā)病率。

1.12 組織化學(xué)染色和總木質(zhì)素含量的測定

在接種后第13 天， 從接種的棉花和經(jīng)水處理的棉株根部手工切出橫截面。 使用Wiesner 試劑檢查木質(zhì)素的組織化學(xué)。 將根部橫截面在體積分?jǐn)?shù)4%的間苯三酚溶液 （其中乙醇體積分?jǐn)?shù)95%）或95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇（染色對照）中孵育10 min， 然后用9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）HCl 處理5 min，然 后 直 接 用 立 體 顯 微 鏡（MZFLIII，Leica，Wetzlar，德國）觀察。

根據(jù)以前的研究[22]，使用木質(zhì)素- 巰基乙酸反應(yīng)確定無蛋白的細(xì)胞壁餾分中根和幼葉的木質(zhì)素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以干物質(zhì)計(jì)），至少3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhMYB43 基因的克隆及序列特征分析

在以前的研究中，證明超量表達(dá)棉花漆酶基因GhLac1 能增強(qiáng)棉花對各種病蟲害的廣譜抗性[23]。通過Y1H 技術(shù)從棉花轉(zhuǎn)錄因子酵母文庫中篩選到與GhLac1 啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子Gh_D12G0544。 生物信息學(xué)初步分析結(jié)果顯示，其編碼基因位于陸地棉D(zhuǎn)t 亞組第12 號染色體上，開放閱讀框?yàn)? 131 bp，包含2 個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，編碼1 個(gè)含376 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì) （圖1）。 根據(jù)NCBI 的Protein 數(shù)據(jù)庫和Nucleotide 數(shù)據(jù)庫中已提交的Gh_D12G0544 在不同物種中的同源序列，并考慮物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，選取甜橙（Citrus sinensis）、榴蓮（Durio zibethinus）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）、哥倫比亞錦葵（Herrania umbratica）、胡楊（Populus euphratica）、可可樹（Theobroma cacao）、金絲小棗（Ziziphus jujuba）、擬南芥等物種的Gh_D12G0544同源蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)該蛋白與擬南芥中AtMYB43 和雷蒙德氏棉中GrODORANT1 同源性最高，因此命名為GhMYB43。氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，GhMYB43 含有2 個(gè)MYB 結(jié)構(gòu)域，屬于典型的R2R3 類MYB 轉(zhuǎn)錄因子（圖2）。

圖1 GhMYB43 的基因克隆和結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Gene cloning and structure analysis of GhMYB43

2.2 GhMYB43 基因的轉(zhuǎn)錄模式分析

在GhMYB43 的3' 非編碼區(qū)（3'-untranslated region，3'UTR）設(shè)計(jì)特異引物，通過組織轉(zhuǎn)錄模式分析發(fā)現(xiàn)，GhMYB43 在莖中優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄，在其他組織中略有轉(zhuǎn)錄（圖3a）。 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄模式分析表明，GhMYB43 受水楊酸（Salicylic acid, SA）和H2O2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平上升（圖3b、c）， 而受茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate, Me-JA） 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平下降（圖3d）。由此猜測GhMYB43 可能參與了這些激素信號通路的調(diào)控。 而在接菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄模式分析中，發(fā)現(xiàn)GhMYB43 在接菌后6 h、12 h、24 h 時(shí)受誘導(dǎo)顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄，而在48 h 后又受誘導(dǎo)下調(diào)轉(zhuǎn)錄（圖3e），推測GhMYB43 可能參與棉花抗黃萎病調(diào)控。

2.3 GhMYB43 亞細(xì)胞定位分析

通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化空載體（35S-GFP）的煙草幼嫩葉片細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核中均能觀察到綠色熒光， 而35S∷GhMYB43-GFP 與核標(biāo)記基因AtHY5-RFP 共定位于細(xì)胞核（圖4）。因此，認(rèn)為GhMYB43 是1 個(gè)核定位蛋白，符合一般轉(zhuǎn)錄因子特征。

2.4 GhMYB43 自激活活性分析

在棉花原生質(zhì)體中利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)對GhMYB43 的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行驗(yàn)證， 結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件（25 ℃培養(yǎng)16 h）下，與空載體（Control）對比，融合GAL4DB 的GhMYB43蛋白對熒光素酶有2.4 倍的轉(zhuǎn)錄激活活性 （圖5）。初步證實(shí)，GhMYB43 是1 個(gè)具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子。

2.5 GhMYB43 負(fù)調(diào)控棉花對黃萎病菌的抗性

通過對以棉花Jin668 為受體材料遺傳轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行拷貝數(shù)分析（Southern blotting）以及轉(zhuǎn)錄水平測定，篩選了轉(zhuǎn)錄水平符合預(yù)期的、 低拷貝的3 個(gè)超表達(dá)株系OE-77、OE-81 和OE-8 進(jìn)行后續(xù)研究 （圖6a、b）。 對超表達(dá)Gh-MYB43 轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了黃萎病菌V991 接種鑒定，結(jié)果表明：與野生型（WT）相比，超表達(dá)Gh-MYB43 轉(zhuǎn)基因系對黃萎病菌V991 抗性減弱，出現(xiàn)典型的黃萎病癥狀，如葉片黃化、萎蔫脫落等（圖6c）， 相應(yīng)的病情指數(shù)和發(fā)病率也支持該結(jié)果（圖6d）。此外，剖稈鑒定和真菌恢復(fù)培養(yǎng)的結(jié)果與表型結(jié)果相符（圖6e、f）。 以上結(jié)果表明， 超表達(dá)Gh-MYB43 轉(zhuǎn)基因株系對黃萎病菌的敏感性增強(qiáng)。

圖2 GhMYB43 同源蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹和同源蛋白質(zhì)多重序列比對Fig. 2 Phylogenetic tree and multiple sequence alignment homologous proteins of GhMYB43

圖3 GhMYB43 組織誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄模式分析Fig. 3 Tissue expression patterns and induced expression patterns of GhMYB43 analyzed by RT-qPCR

為了進(jìn)一步鑒定GhMYB43 在棉花響應(yīng)黃萎病菌侵染中的功能， 構(gòu)建了GhMYB43 的VIGS 載體， 通過特異干涉棉花中GhMYB43 基因的表達(dá)考察棉花植株對病原菌抗性的變化。 棉花CLA 基因參與葉綠素的形成，VIGS 抑制CLA的表達(dá)后會造成棉花植株葉片白化（圖7a），因此可作為陽性對照。通過RT-qPCR 分析，與TRV∷00對照相比，TRV∷GhMYB43 植株的GhMYB43轉(zhuǎn)錄水平明顯降低（圖7b），黃萎病癥狀較輕（圖7c）。 從發(fā)病率和病情指數(shù)可以看出，TRV∷Gh-MYB43 植株發(fā)病率明顯低于TRV∷00 植株（圖7d）；剖稈鑒定和真菌恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果也與表型結(jié)果相符（圖7e、f）。以上結(jié)果表明，抑制GhMYB43 轉(zhuǎn)錄會增強(qiáng)棉花植株對黃萎病菌的抗性。

圖4 GhMYB43 亞細(xì)胞定位Fig. 4 Subcellular localization of GhMYB43

圖5 GhMYB43 棉花原生質(zhì)體中的轉(zhuǎn)錄激活活性的分析Fig. 5 Transcriptional activity assay of GhMYB43 in cotton protoplasts

2.6 GhMYB43 是木質(zhì)素合成中的負(fù)調(diào)節(jié)因子

在前期研究中，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素代謝在棉花抵御黃萎病菌入侵的過程中發(fā)揮重要作用[21]。 而多有文獻(xiàn)報(bào)道， 木質(zhì)素代謝主要由NAC、MYB 等其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。 據(jù)此筆者猜測GhMYB43 可能也參與調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成通路[24-26]。 因此，首先對超表達(dá)GhMYB43 轉(zhuǎn)基因材料和對照材料（WT）中的木質(zhì)素進(jìn)行了組織化學(xué)染色和含量測定。從結(jié)果可以看出，無論水處理或V991 接種處理，轉(zhuǎn)Gh MYB43 基因材料的染色程度均低于野生型材料（圖8a）， 表明轉(zhuǎn)GhMYB43 基因材料的木質(zhì)素積累低于對照材料。且木質(zhì)素含量測定結(jié)果與染色結(jié)果相符，超表達(dá)GhMYB43 轉(zhuǎn)基因材料的木質(zhì)素含量明顯低于對照材料（圖8b）。

圖6 超表達(dá)GhMYB43 抑制了轉(zhuǎn)基因材料對黃萎病菌的抗性Fig. 6 Overexpressing of GhMYB43 impair cotton resistance to Verticillium dahliae

圖7 VIGS 抑制棉花GhMYB43 的表達(dá)情況及其對黃萎病菌的抗性鑒定結(jié)果Fig. 7 VIGS inhibition of the expression of GhMYB43 in cotton and its resistance to Verticillium dahliae

圖8 超表達(dá)GhMYB43 棉花的木質(zhì)素含量情況Fig. 8 Lignin content of cotton overexpressing GhMYB43

為了探索GhMYB43 在木質(zhì)素代謝中的功能，分析了木質(zhì)素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。 在水處理?xiàng)l件下， 與WT 植株相比， 超表達(dá)Gh-MYB43 株系中的GhHCT-1、GhCCoAOMT-3 基因的轉(zhuǎn)錄水平降低（圖9a）。 同時(shí)，在V991 處理下，超表達(dá)GhMYB43 株系中的GhHCT-1、GhCCoAOMT-3 基因的轉(zhuǎn)錄水平也比WT 植株的低（圖9b）。 還檢測了TRV∷GhMYB43 和TRV∷00幼苗中這類基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)無論是水處理還是接種V991 處理， 與TRV∷00 幼苗相比，TRV ∷GhMYB43 幼 苗 中 GhHCT-1、GhCCoAOMT-1 和GhCOMT-2 的轉(zhuǎn)錄水平均較高（圖9c、d）。 這些結(jié)果表明，GhMYB43 在木質(zhì)素合成中充當(dāng)負(fù)調(diào)節(jié)因子。

圖9 GhMYB43 負(fù)調(diào)控木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 9 GhMYB43 negatively regulates the expression level of genes involved in lignin synthesis

2.7 GhMYB43 負(fù)調(diào)控JA 信號通路

JA 在棉花對大麗輪枝菌的抗性中起重要作用。 基于病原從根部侵染棉花的考慮，分析了接種后根部JA 信號通路基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，在水處理（Mock）和V991 處理下，超表達(dá)GhMYB43 顯著降低了JA 代謝和信號通路基因 的 轉(zhuǎn) 錄 水 平， 例 如GhLOX4-1、GhLOX6-1、GhAOS1 和GhAOC3（圖10a）。 相反，VIGS 抑制GhMYB43 的表達(dá)后，JA 代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的表達(dá)水平在接種V991 和Mock 處理中都 上 調(diào)， 并 且 在 接 菌 后，GhLOX4-1、GhAOS1、GhAOC3 的表達(dá)顯著上調(diào)（圖10b）。 這些結(jié)果表明，GhMYB43 是JA 信號通路中重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子。

圖10 GhMYB43 負(fù)調(diào)控JA 激素合成相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 10 GhMYB43 negatively regulates the expression level of genes involved in JA synthesis

3 討論

植物細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠多糖以及少量結(jié)構(gòu)蛋白組成， 是1 種動態(tài)結(jié)構(gòu)， 通常決定植物與病原體之間相互作用的結(jié)果[27-28]。 木質(zhì)素代謝在植物病害和棉花對大麗輪枝菌抗性中發(fā)揮積極作用。 細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量越高，植物抗病性越強(qiáng)[22,28]。 GhLAC15 的過表達(dá)顯著提高了擬南芥的木質(zhì)素含量，從而提高了擬南芥對黃萎病的抗性[7]。 GhLac1 的過度表達(dá)導(dǎo)致木質(zhì)化程度增加，與增強(qiáng)對真菌V. dahliae的耐受性相關(guān)[23]。 本研究發(fā)現(xiàn)， 棉花接種V.dahliae 后木質(zhì)素合成相關(guān)基因和木質(zhì)素含量顯著增加。 研究還發(fā)現(xiàn)，在抑制木質(zhì)素代謝之后，棉花黃萎病發(fā)生加重。 然而，最近的研究表明，降低次生細(xì)胞壁的木質(zhì)素含量會產(chǎn)生損傷相關(guān)分子模式（Damage-associatedmolecularpattern,DAMP），并可能誘導(dǎo)免疫激活[29]。因此，木質(zhì)素代謝與免疫激活的關(guān)系還比較復(fù)雜。 以往的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成的轉(zhuǎn)錄因子有多種， 如AtMYB15、PtoMYB156、OsSND2、GhUMC1、MYB20、MYB42、MYB43、MYB85、LTF1、GhFSN5、CmMYB8、GbERF1-like[6,9,24-26,30-32]。 本 研 究 發(fā) 現(xiàn)GhMYB43也是1 種木質(zhì)素代謝調(diào)節(jié)因子。 對木質(zhì)素含量及相關(guān)基因表達(dá)的分析表明，GhMYB43 是木質(zhì)素代謝的負(fù)調(diào)節(jié)因子，但GhMYB43 與其他調(diào)節(jié)因子的相互作用及具體作用方式尚不清楚。

JA 合成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物抗黃萎病中起著重要作用[33]。 已經(jīng)鑒定了調(diào)節(jié)JA 合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的幾個(gè)關(guān)鍵基因。CPK33 通過促進(jìn)茉莉酸合成酶基因OPR3 的降解來減少JA 的積累，從而削弱抗病性[34]。 GbWRKY1 通過激活JAZ1 表達(dá)來減弱JA 信號，因此起負(fù)調(diào)節(jié)因子的作用[10]。 本研究發(fā)現(xiàn)GhMYB43 可以調(diào)節(jié)JA 合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。 參與JA 合成調(diào)控的基因在超表達(dá)GhMYB43 株系中下調(diào)表達(dá)。 同時(shí)，當(dāng)GhMYB43 轉(zhuǎn)錄被抑制時(shí)， 棉花中JA 合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)， 表明Gh-MYB43 對JA 合成有負(fù)調(diào)控作用。但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。 此外，JA 的合成和代謝可能與木質(zhì)素合成代謝有關(guān)。 JA 合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達(dá)的變化可以引起木質(zhì)素代謝的變化，同時(shí)木質(zhì)素代謝的變化也可以引起JA 合成或代謝的變化[35-36]。這表明JA 合成與木質(zhì)素合成之間的相互作用有多種調(diào)控途徑。 本研究發(fā)現(xiàn)，Gh-MYB43 可以同時(shí)調(diào)節(jié)JA 的合成和木質(zhì)素的合成， 但GhMYB43 是否能調(diào)節(jié)JA 引起的木質(zhì)素合成尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)室已有的研究基礎(chǔ)上， 從陸地棉Jin668 中克隆了1 個(gè)R2R3 類MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因。 氨基酸序列分析顯示，該基因編碼的蛋白含有2 個(gè)MYB 結(jié)構(gòu)域， 且與擬南芥的AtMYB43具有較高的相似性； 因此， 將其命名為Gh-MYB43。 GhMYB43 位于陸地棉D(zhuǎn)t 亞組第12 號染色體上， 編碼1 個(gè)含376 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，具有2 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子。RT-qPCR 分析發(fā)現(xiàn)GhMYB43 在莖中優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄，受SA 和H2O2誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而受Me-JA 誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，且轉(zhuǎn)錄水平會受V.dahliae 誘導(dǎo)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，GhMYB43 蛋白定位于細(xì)胞核且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。 抗病性鑒定發(fā)現(xiàn)，抑制GhMYB43 轉(zhuǎn)錄會增強(qiáng)棉花植株對黃萎病菌的抗性， 超表達(dá)Gh-MYB43 增強(qiáng)了棉花對黃萎病菌的敏感性。RT-qPCR 結(jié)果、木質(zhì)素組織化學(xué)染色和含量測定結(jié)果表明，GhMYB43 負(fù)調(diào)控木質(zhì)素合成和JA 信號通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。