李恒震 張艷橋

癌癥是導(dǎo)致人類死亡的重要原因之一，結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)作為全球第三大常見癌癥，每年會(huì)導(dǎo)致約80萬人的死亡，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。近年來，隨著環(huán)境等因素的影響，我國CRC的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升及年輕化的趨勢。局限期CRC患者(Ⅰ期和Ⅱ期)5年生存率接近90%，而伴有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的晚期CRC患者生存率僅為13.1%[2]，而且CRC起病隱匿，約1/4的患者在首次確診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移[3]，在這個(gè)階段，只能選擇姑息性治療，生活質(zhì)量較差且預(yù)后不良，治療相關(guān)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也顯著增加。因此，實(shí)現(xiàn)CRC的早期診斷在疾病診療體系中具有重要地位，有助于疾病的早期干預(yù)和治療，可以顯著改善患者預(yù)后，降低死亡率。

針對(duì)CRC人群，目前臨床常用的篩查手段主要是腸鏡檢查、糞便隱血試驗(yàn)、腫瘤標(biāo)志物檢測和影像學(xué)檢查等。腸鏡檢查可以直接觀察腫瘤的位置及形態(tài)，獲取病變組織進(jìn)一步行病理學(xué)檢查，是目前確診CRC的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其存在有創(chuàng)性、受術(shù)者操作水平的影響，在臨床應(yīng)用過程中仍存在一定局限性。糞便隱血試驗(yàn)及腫瘤標(biāo)志物對(duì)CRC的診斷缺乏敏感性和特異性，而影像學(xué)檢查對(duì)微小殘留病灶和隱匿性轉(zhuǎn)移瘤難以識(shí)別。由此，液體活檢應(yīng)運(yùn)而生并有望彌補(bǔ)這些檢查的不足。液體活檢是通過對(duì)生物源液體(通常是血液)特定成分進(jìn)行分析，用于癌癥診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后評(píng)估的一種無創(chuàng)活檢組織檢查技術(shù)。液體活檢操作方便，可多次重復(fù)取樣，動(dòng)態(tài)反映疾病變化，避免了腫瘤組織活檢的有創(chuàng)性、花費(fèi)高、結(jié)果回報(bào)時(shí)間長等缺點(diǎn)，一定程度上可以克服腫瘤異質(zhì)性，更加全面反映患者疾病狀態(tài)，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，生物源液體特定成分主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells，CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)、細(xì)胞游離DNA(Cell-free DNA，cfDNA)、外泌體(Exosomes，Exs)、腫瘤相關(guān)血小板(Tumor-educated platelets，TEPs)及循環(huán)腫瘤相關(guān)微粒(Tumor-associated microparticles，taMPs)等。本文就上述幾種生物源液體特定成分在CRC臨床診斷中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為完善CRC患者的臨床診斷提供新思路。

1 CTCs

CTCs是從原發(fā)腫瘤病灶中分離出來的腫瘤細(xì)胞群，可以游離在患者的外周血中。CTCs主要通過血管內(nèi)活化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)或原發(fā)腫瘤的被動(dòng)脫落而產(chǎn)生。根據(jù)上皮細(xì)胞和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)差異，CTCs主要分為三種類型：上皮細(xì)胞表型、間質(zhì)細(xì)胞表型和混合表型。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，細(xì)胞粘附分子表達(dá)減少，獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和播散，導(dǎo)致腫瘤的早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此CTCs間質(zhì)細(xì)胞表型的出現(xiàn)意味著患者預(yù)后較差。目前CellSearchTM是FDA批準(zhǔn)的唯一一種用于CTCs富集的技術(shù)，具有較高的特異性，在早期CRC患者中即可以檢測到CTCs的存在。因此，循環(huán)系統(tǒng)中CTCs的檢測有望成為CRC篩查的指標(biāo)。

Wan等[4]通過分析438例腸鏡確診的CRC患者，其中111例為癌前病變，發(fā)現(xiàn)CTCs檢測對(duì)癌前病變的診斷敏感性和特異性分別為76.6%和97.3%，327例為CRC，CTCs檢測診斷的敏感性和特異性分別為86.9%和97.3%。最新研究表明CTCs檢出率與CRC患者分期密切相關(guān)[5]，Ⅰ～Ⅳ期檢出率分別為81.7%、82.4%、91.6%、93.4%，由此可見隨著病情的進(jìn)展，CTCs的檢出率會(huì)顯著增高。與CRC診斷標(biāo)準(zhǔn)臨床方案相比，CTCs對(duì)包括癌前病變在內(nèi)的所有CRC疾病階段的總體診斷準(zhǔn)確率為88%，健康對(duì)照組的假陽性率為3.3%，癌癥患者的假陰性率為16%。由此可見，CTCs檢測在CRC的診斷方面是一種潛在的、可行的新措施。此外，隨著靶向治療的興起，伴隨診斷作為一種新興的體外診斷技術(shù)得到了快速發(fā)展。伴隨診斷通過評(píng)估患者特定生物標(biāo)記物的表達(dá)水平，進(jìn)而評(píng)價(jià)靶向藥物的治療效果，對(duì)患者選擇最佳靶向治療藥物具有重要意義。徐建明團(tuán)隊(duì)[6]的一項(xiàng)研究入選了36例接受了PD1單抗(IBI308)治療的不同類型消化道腫瘤患者，通過對(duì)外周血CTCs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PDL1高表達(dá)(PDL1+++)的CTCs數(shù)目可以預(yù)測PD1治療效果，而且這類細(xì)胞比例越高，響應(yīng)率也越高，因此PDL1+++CTCs高的患者也具有更好的預(yù)后。

2 cfDNA和ctDNA

cfDNA是正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞以及循環(huán)腫瘤細(xì)胞等發(fā)生凋亡或壞死后釋放到血液中的游離DNA片段，不僅存在于腫瘤患者體內(nèi)，也可以在健康人群的血液中檢測到。cfDNA一旦進(jìn)入外周循環(huán)，半衰期很短，很快就會(huì)通過腎臟、肝臟和脾臟從體內(nèi)清除[7]。因此，cfDNA可以實(shí)時(shí)反映機(jī)體全身情況。其中腫瘤來源的DNA被稱為ctDNA，主要通過腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死、CTCs溶解和腫瘤細(xì)胞外的活性分泌進(jìn)入循環(huán)[8]?？梢源嬖谟诨颊叩难?、滑膜液和腦脊液等液體中，經(jīng)尿液和糞便排出。通過測量等位基因突變片段可以獲得定量信息，可用于腫瘤診斷并反映腫瘤負(fù)荷情況[9]。此外，ctDNA在檢測微小殘留病灶和隱匿性轉(zhuǎn)移瘤以及監(jiān)測治療效果等方面均得到了廣泛應(yīng)用[10-11]。

Luo等[12]通過前瞻性隊(duì)列研究驗(yàn)證cfDNA在篩查CRC和高危人群方面的應(yīng)用價(jià)值。該研究共納入801例CRC患者和1 021例正常對(duì)照組的cfDNA樣本，通過統(tǒng)計(jì)方法，以選定的甲基化標(biāo)志物構(gòu)建CRC診斷和預(yù)測模型，對(duì)CRC診斷的敏感性和特異性分別為89.9%和87.5%。預(yù)后模型可以有效預(yù)測CRC患者的預(yù)后和生存期(P<0.001)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)單獨(dú)的ctDNA甲基化標(biāo)志物cg10673833，在診斷CRC和癌前病變時(shí)具有高敏感性(89.7%)和特異性(86.8%)。Wan等[13]通過cfDNA全基因組測序建立分類模型對(duì)局限期(Ⅰ，Ⅱ期)CRC診斷的AUC值為0.92(95%CI：0.91～0.93)，敏感性和特異性均為85%。Church等[14]對(duì)53例CRC患者和1 457例健康志愿者外周血ctDNA基因甲基化水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，血漿SEPT9基因甲基化異常診斷CRC的敏感性為48.2%，特異性為91.5%；對(duì)CRC Ⅰ～Ⅳ期診斷敏感性分別為35.0%、63.0%、46.0%和77.4%，但對(duì)晚期腺瘤的診斷敏感性較低(11.2%)。因此，CRC人群篩查試驗(yàn)大規(guī)模應(yīng)用于臨床還需要提高對(duì)早期癌癥和晚期腺瘤診斷的敏感性。

3 Exs

Exs是一種細(xì)胞通過胞吐方式分泌至微環(huán)境中的囊泡，直徑為40～100 nm，具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)。人體中幾乎所有類型的細(xì)胞均可通過內(nèi)分泌或旁分泌的方式釋放Exs。因此Exs廣泛存在于血漿、唾液、尿液、母乳、羊水、腦脊液等多種體液中[15]。Exs通過其攜帶的微小RNA(micro RNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)、DNA以及蛋白質(zhì)等生物活性成分的運(yùn)輸，在細(xì)胞間物質(zhì)交換和信息交流中發(fā)揮重要作用。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞分泌更多的外泌體，而且患者循環(huán)系統(tǒng)中的外泌體與腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體具有相似的遺傳信息，表明通過對(duì)Exs中遺傳信息的檢測有望成為腫瘤早期篩查的標(biāo)記物。

與cfDNA相比，Exs攜帶的基因片段更加豐富而穩(wěn)定，因此在近幾年受到廣泛關(guān)注。CRC患者Exs中特異性miRNA的異常表達(dá)是早期診斷和分期評(píng)估的可靠生物標(biāo)志物。Ogata-Kawata等[16]篩選并鑒定了16個(gè)可作為CRC生物標(biāo)志物的外泌體miRNA，其中miR-1246和miR-23a的敏感性最高，可以達(dá)到95%和92%。miR-92a-3p和miR-17-5p診斷CRC患者的AUC達(dá)到0.845和0.897[17]。除了能將CRC患者與健康人進(jìn)行區(qū)分，外泌體miRNA還可以區(qū)分出轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移患者。與非轉(zhuǎn)移性患者相比，轉(zhuǎn)移性患者外泌體中miR-1229和miR-25-3p，miR-17-5p和miR-92a-3p表達(dá)量更高，鑒別的AUC可以達(dá)到0.841，0.854[17-18]。此外Uratani等[19]發(fā)現(xiàn)與健康人相比，腺瘤患者的外泌體中miR-29a和miR-21水平升高，特別是外泌體miR-21的AUC值達(dá)到了0.77，敏感性為69.8%，特異性為80.0%。其表達(dá)水平與息肉的大小和數(shù)量也表現(xiàn)出了相關(guān)性。此外，Exs中其他非編碼RNA即lncRNA和circRNA也被證明與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Barbagallo等[20]檢測了CRC患者Exs中17個(gè)lncRNA和31個(gè)circRNA，驗(yàn)證了其中1個(gè)上調(diào)表達(dá)的lncRNA：UCA1，下調(diào)表達(dá)的lncRNA：TUG1，以及上調(diào)表達(dá)的circHIPK3。發(fā)現(xiàn)circHIPK3和UCA1聯(lián)合診斷的AUC為0.814，敏感性為93%，特異性為64%，TUG1和UCA1聯(lián)合診斷的AUC為0.9，敏感性為100%，特異性為70%。外泌體中含有的大量核酸、蛋白質(zhì)等均在CRC患者中顯示出了明顯特異性，但目前的研究只是冰山一角，需要更多的研究來明確外泌體應(yīng)用于CRC診斷和預(yù)后的可行性，是非常值得深入研究的領(lǐng)域。

4 TEPs

血小板是從骨髓成熟的巨核細(xì)胞胞漿脫落下來的小塊胞質(zhì)，在外周血中含量豐富，主要發(fā)揮止血作用。最近研究表明，血小板可以促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并且腫瘤患者血小板反應(yīng)性較高，容易被激活，從而顯著增加了血栓的風(fēng)險(xiǎn)[21-23]。血小板通過攝取腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境釋放的外泌體，在血小板中發(fā)生剪切轉(zhuǎn)化為TEPs。因此TEPs也攜帶豐富的核酸和蛋白質(zhì)，包括mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等，具有豐富的表達(dá)譜。腫瘤患者TEPs表型和功能上的差異增加了它們作為腫瘤標(biāo)志物的可能性[24-25]。TEPs作為一種新興的液體活檢技術(shù)，可用于泛腫瘤分析、區(qū)分腫瘤類型以及腫瘤基因突變的診斷。

Best等[26]通過對(duì)283份來自不同癌種患者和健康受試者的血小板mRNA序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在癌癥患者中TEPs內(nèi)RNA譜發(fā)生改變，通過分析RNA譜的基因變化，可以區(qū)分228例局限性或者轉(zhuǎn)移性腫瘤及健康體檢者，準(zhǔn)確率高達(dá)96%。不僅如此，TEPs還能區(qū)分并定位6種不同的腫瘤類型，其判斷原發(fā)腫瘤位置的準(zhǔn)確率達(dá)71%。Yang等[27]通過分析44例CRC患者和55例健康患者的血小板RNA，發(fā)現(xiàn)了1 099個(gè)表達(dá)異常的基因，其中824個(gè)上調(diào)基因，275個(gè)下調(diào)基因。其中TIMP1的差異尤其明顯，CRC患者血小板中TIMP1 RNA水平明顯高于健康人或者炎癥性腸病患者，研究發(fā)現(xiàn)血小板中的TIMP1 RNA可以通過血小板傳遞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞中，在腫瘤細(xì)胞中被翻譯成有功能的蛋白質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。因此，TIMP1 RNA有望作為診斷CRC的新型生物標(biāo)志物。研究表明無誘因靜脈血栓栓塞患者具有較高的腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，1年內(nèi)被診斷為腫瘤的概率為4%～7%[28]，而其中30%～60%的患者會(huì)因不及時(shí)的腫瘤篩查而延誤診斷和治療。針對(duì)這類特殊的患者，一項(xiàng)臨床研究(NCT02739867)正在進(jìn)行中，通過檢測無誘因靜脈血栓栓塞患者血小板的RNA圖譜變化，探究TEPs中特定類型的基因?qū)@部分人群進(jìn)行腫瘤篩查的準(zhǔn)確性，這也進(jìn)一步顯示了TEPs在腫瘤診斷領(lǐng)域的巨大潛力。

5 taMPs

細(xì)胞微粒(Microparticles，MPs)是細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)的一種，直徑在100～1 000 nm之間，是活化或凋亡的細(xì)胞以及靜止的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡，通過質(zhì)膜直接釋放至細(xì)胞外。在細(xì)胞活化或凋亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，凝溶膠蛋白酶、鈣蛋白酶被激活分裂細(xì)胞骨架。同時(shí)激活磷脂雙向轉(zhuǎn)運(yùn)酶，抑制氨基磷脂轉(zhuǎn)位酶，導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺從細(xì)胞膜外層到細(xì)胞膜內(nèi)部的運(yùn)輸平衡被破壞，從而使膜內(nèi)磷脂發(fā)生不對(duì)稱缺失。這些細(xì)胞骨架和膜表面的變化導(dǎo)致細(xì)胞以出芽方式產(chǎn)生MPs[29]。腫瘤細(xì)胞通過釋放taMPs影響組織因子和表面的磷脂酰絲氨酸的表達(dá)，參與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤相關(guān)凝血活動(dòng)[30-32]。但是檢測taMPs需要排除EVs其他成分的影響，包括Exs和凋亡小體等，技術(shù)要求較高。

Willms等[33]通過對(duì)taMPs研究發(fā)現(xiàn)這是一種具有巨大潛力的生物標(biāo)志物。研究納入了52例CRC、40例非小細(xì)胞肺癌和11例胰腺癌患者與作為陰性對(duì)照組的55例健康受試者和43例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的血清進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析，離心分離后對(duì)taMPs上的抗原CD147和上皮細(xì)胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明EpCAM在這些實(shí)體腫瘤中的總體陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為79.03%和85.29%，總體敏感性為95.15%，特異性為52.73%。EpCAM、CD147聯(lián)合檢測的總體陽性預(yù)測值略高：陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為80.36%和83.87%，總體敏感性為94.74%，特異性為54.17%，CD147作為單獨(dú)診斷指標(biāo)效果較差。在CRC中，EpCAM+CD147+ taMPs與腫瘤體積表現(xiàn)出明顯相關(guān)性，同時(shí)根治術(shù)后，EpCAM+ taMPs明顯下降，也提示與腫瘤存在密切相關(guān)。因此EpCAM+CD147+taMPs以其在腫瘤診斷中較高的敏感性和特異性以及在評(píng)估腫瘤負(fù)荷和腫瘤治療效果的良好表現(xiàn)，在未來可能成為液體活檢中的重要檢查工具。

6 小結(jié)與展望

腫瘤發(fā)生是以致癌基因與抑癌基因平衡破壞為特點(diǎn)的多種因素共同作用的結(jié)果，通過液體活檢識(shí)別腫瘤患者所具有特異性標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對(duì)CRC患者的早期、無創(chuàng)診斷，可以改善患者預(yù)后降低死亡率。通過對(duì)腺瘤等癌前病變篩查及早進(jìn)行干預(yù)可以明顯降低CRC發(fā)生率。通過伴隨診斷為患者選擇合適靶向藥物實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)治療。此外液體活檢可以實(shí)時(shí)監(jiān)測復(fù)發(fā)及治療反應(yīng)，更加全面評(píng)估患者預(yù)后。目前液體活檢的應(yīng)用還受到一些技術(shù)限制，以及許多成分還處于研究階段，但隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，一定會(huì)有越來越多的患者從中受益。