張 暉 王炳新 董 斌 黃永芳

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642；3.廣東省臺山市林業(yè)局，廣東 臺山 529000；4.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510507）

目前油茶研究熱點主要集中在良種選育、繁育和栽培、茶皂素、皂苷等方向[1]。據(jù)不完全計算，我國每年生產(chǎn)茶油、油茶籽粕產(chǎn)量約為150萬噸。油茶餅粕中的茶皂素(占10%-14%)是一種五環(huán)三萜類皂苷，其基本結(jié)構(gòu)由皂苷元、糖體、有機酸構(gòu)成，同時也是一類良好的表面活性劑，同時還具備抗菌消炎、抗高血壓、抗?jié)B透和抑制酒精吸收等生物活性[2-4]。由于油茶餅粕中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可作飼用。但鑒于茶皂素的特殊性，不利于油茶餅粕直接用于飼用，因此，近年關(guān)于茶粕利用微生物以去除茶皂素的研究成為關(guān)注的方向[5-7]。朱培等[8]研究結(jié)果顯示油茶餅粕中氨基酸的均衡性較差，不同加工工藝對油茶餅粕的營養(yǎng)成分有一定的影響，低溫冷榨油茶粕是潛在的飼料原料。目前，油茶茶籽榨油方式還是以傳統(tǒng)壓榨為主。因此如何有效利用油茶餅粕，在油茶餅粕已有的研究上開展一個綠色生態(tài)環(huán)保的新方向成為當前需要解決的問題。油茶餅粕的固態(tài)發(fā)酵常規(guī)做法是通過自然發(fā)酵處理。本研究使用哈茨木霉Trichoderma harzianum、黑曲霉 Aspergillus niger、魯氏毛霉Mucor roxianus 于不同環(huán)境溫度和油茶餅粕含水量下進行固態(tài)發(fā)酵，對比3 種霉菌在已脫茶皂素和未脫茶皂素油茶餅粕中的生長狀況，探討有利于油茶餅粕固態(tài)發(fā)酵的條件控制，為油茶餅粕固態(tài)發(fā)酵作有機肥應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種及活化培養(yǎng)

本試驗采用的菌種哈茨木霉(簡稱木霉)、黑曲霉、魯氏毛霉(簡稱毛霉），為凍干菌種。菌種活化培養(yǎng)用培養(yǎng)基為綜合馬玲薯培養(yǎng)基，1 L 培養(yǎng)基中含20% Potato extract(馬玲薯汁)，KH2PO43 g，Vitanib B1(硫胺素)Trace 8 mg，Glucose(葡萄糖) 20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，pH=6。

1.2 油茶餅粕去茶皂素處理

通過水提法脫去茶皂素的油茶餅粕。水提法是將油茶餅粕浸泡在pH=10，固液比1:10 的80℃熱水中，12 h 后進行脫水，60℃烘干備用[9]。

1.3 菌體的選取

根據(jù)菌體在液體培養(yǎng)基中生長變化曲線，選擇生物量處于最高穩(wěn)定時期作為油茶餅粕發(fā)酵用的菌體材料。

1.4 油茶餅粕發(fā)酵設(shè)置

油茶餅粕（分未脫茶皂素與已脫茶皂素）分裝到組培瓶中，每個組培瓶裝30.0 g 材料，105℃下滅菌4 h（以不滅菌處理為對照）。滅菌后加入無菌水以調(diào)節(jié)油茶餅粕含水量（40%、50%、60%、70%），分別接入菌體2 g 于油茶餅粕中，將材料置于20、30、40℃的人工氣候箱中，每個處理3 個重復(fù)。

試驗分對照（不添加菌種）和添加菌種（毛霉、木霉和黑曲霉）處理，設(shè)置3 個溫度區(qū)間20、30、40℃，以及含水量（40%、50%、60%、70%），試驗進行完全組合。

在第30 天對各處理茶粕中的菌絲生長進行分級評價，無菌絲生長記“0”，茶粕表面生長記“1”，茶粕體上半部生長記“2”，茶粕體全部有菌絲生長記“3”，*代表處理中水與茶粕出現(xiàn)分層。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種霉菌在液體培養(yǎng)基中生長比較

圖1 霉菌在液體培養(yǎng)基生長表現(xiàn)Fig.1 The growth of three fungi in liquid medium

由圖1 可見，毛霉生長較快，培養(yǎng)12 h 時，毛霉生物重為47.6 g/L，而木霉與黑曲霉分別為9.6 和9.5 g/L。毛霉在16-24 h 間生物重平穩(wěn)，隨后生物重逐漸減少；而木霉生物重在36 h 達339.1 g/L，黑曲霉在44 h 時生物重達到最高，為327.4 g/L。油茶茶粕中毛霉、木霉和黑曲霉分別選取其在16、36 和44 h 時間段的菌體作為試驗用的材料。

2.2 3 種霉菌在油茶餅粕中的生長對比

2.2.1 3 菌種接種于未脫茶皂素油茶餅粕中的生長 將3 種霉菌種接種于未脫茶皂素油茶餅粕中，在不同的溫度和含水量條件下培養(yǎng)一段時間，菌種的生長如表1 所示。

在20 ℃，對照處理（含水量40%、50%、60%）菌絲在油茶餅粕表面生長，但未能布滿油茶餅粕，在含水量70%條件下菌絲只能匍匐生長于表面，并且很快停止生長；在30℃下的菌絲生長優(yōu)于20℃，在40℃時油茶餅粕出現(xiàn)明顯分層，菌種生長表現(xiàn)不良。

毛霉在20℃時的生長明顯優(yōu)于對照組。在含水量50%時，其菌絲能遍布整個油茶餅粕。在30℃下，含水量40%、50%和60%的生長與對照組相似；但在40℃條件下，油茶餅粕上的菌絲到第5 天已經(jīng)停止生長，并且此溫度下油茶餅粕上層已經(jīng)逐漸失水干化。

木霉在20℃和30℃下的生長相似，在第3 天時，菌絲開始生長，生長與毛霉相似。在第7 天，40℃處理組，除了含水量40%的油茶餅粕有少量菌絲外，其它處理中的木霉菌絲未見生長。

黑曲霉在20℃時菌絲生長優(yōu)于30℃，特別是在20℃含水量50%時，菌絲能遍布整個油茶餅粕(圖2)，與同處理的毛霉生長相似；在40℃各處理組的菌絲未見生長。

2.2.2 3 種霉菌在已脫茶皂素茶粕中的生長對比 在已脫茶皂素油茶餅粕中（表2），20℃時，對照處理(含水量40%、50%、60%)的菌絲出現(xiàn)時間滯后于其他3 個霉菌處理，但其生長優(yōu)于含水量70%處理組。30℃時，含水量40%和50%處理組是試驗中生長較好的，而含水量70%時其菌絲只在餅粕表面生長，并且生長的時間很短。40℃下的所有含水量處理仍未見菌絲出現(xiàn)。

毛霉的生長優(yōu)于對照組，在20℃下，含水量50%和60%處理組的菌絲能大量生長，并且都能深入到油茶餅粕底部，而含水量40%（圖3）和70%處理組的菌絲停留在茶粕上半部。在30℃，含水量40%、50%、60%處理組比70%的菌絲多，并且50%、60%處理組的菌絲已深入到油茶餅粕下層，而含水量70%處理組的菌絲生長僅限于油茶餅粕表面。30℃下菌絲的生長優(yōu)于20 和40℃。

表1 3 種霉菌在未脫茶皂素油茶餅粕中的生長對比Table 1 The growth of three fungi in Camellia oil-tea cake

圖2 3 種霉菌在未脫茶皂素油茶餅粕生長Fig.2 The growth of three fungi in Camellia oil-tea cake

表2 3 種霉菌在已脫茶皂素油茶餅粕中的生長對比Table 2 The growth of three fungi in non-saponin oil-tea cake(Camellia)

木霉在20 和30℃時，含水量40%、50%和60%處理組的菌絲生長量都比較多，并且能夠長滿整個油茶餅粕，而含水量70%處理組的菌絲只限于表面生長。木霉在40℃各處理中沒有發(fā)生變化。

黑曲霉的生長與木霉相似，優(yōu)于毛霉和對照組。在40℃下各處理組，黑曲霉在接種第3 天開始生長，到第9 天 時已經(jīng)停止生長，并且茶粕也變成黑色。

2.3 單因素分析評價

從圖4 不同菌種在未脫茶皂素油茶餅粕與已脫茶皂素油茶餅粕生長比較結(jié)果可見，黑曲霉在未脫茶皂素與已脫茶皂素油茶餅粕中的生長均優(yōu)于毛霉與對照處理；并且已脫茶皂素油茶餅粕更有利于3 種霉菌在茶粕中生長。

圖3 3 種霉菌在已脫茶皂素油茶餅粕生長Fig.3 The growth of three fungi in non-saponin oil-tea cake

圖4 不同菌種處理生長比較Fig.4 The growth of different fungi in Camellia oil-tea cake and non-saponin oil-tea cake

2.3.1 不同溫度處理生長比較 在未脫茶皂素油茶餅粕中(圖5a)和已脫茶皂素油茶餅粕中（圖5b），30℃時菌體的生長優(yōu)于20 和40℃，而在已脫茶皂素油茶餅粕下菌體生長更好。

2.3.2 不同含水量處理生長比較 在未脫茶皂素油茶餅粕中(圖6a)，含水量40%、50%、60%比70%有利于菌體的生長，40%時木霉生長最好，50%時黑曲霉生長最好，總體來說木霉、黑曲霉較毛霉、對照生長更好。在已脫茶皂素油茶餅粕中(圖6b)，含水量40%、50%和60%對菌體的生長更有利，但是在70%時，則不利于菌體生長。

3 結(jié)論與討論

茶皂素對微生物的抑制作用已有研究，黃衛(wèi)文等[10]用溶劑法提取油茶枯餅中的皂素對大腸桿菌、桔青霉等6 種真菌進行了抑菌試驗，其結(jié)果均表明具有抑制作用。在本研究中，3 種霉菌在同等的條件下，茶皂素對3 種霉菌以及對照的生長具有一定的抑制作用。在未脫茶皂素的油茶餅粕處理中，只有毛霉和黑曲霉在20℃和含水量50%時其菌絲能在茶粕中保持旺盛生長，其它處理只能在表面或上半部生長。對于菌種在未脫茶皂素與已脫茶皂素油茶餅粕的差別，與鐘海雁等[11]研究相一致。

在已脫茶皂素的油茶餅粕中，除了含水量在70%處理組中3 種霉菌只見于油茶餅粕表面生長外，其他的含水量（40%、50%、60%）菌種都能很好的在餅粕中生長。這與3 種霉菌的對氧氣需求性有關(guān)。

溫度對固態(tài)發(fā)酵的影響不只于霉菌的生長溫度。已有的油茶餅粕固態(tài)發(fā)酵研究表明，霉菌的最適生長溫度在28-32℃左右[11]。溫度的高低直接影響其生長活性。在已脫茶皂素和未脫茶皂素油茶餅粕中均顯示，當溫度為40℃時，已經(jīng)不利于試驗中3 種霉菌的生長，主要是水份的散失造成，使得材料在40℃下失水，進而限制菌絲生長。

一直以來，油茶的研究主要集中在食品與化學(xué)方面[12]，對油茶餅粕的固態(tài)發(fā)酵研究不多。油茶餅粕中茶皂素的存在是限制其直接固態(tài)發(fā)酵的因素之一，而茶皂素又是一個經(jīng)濟價值較高的日化原料。雖然茶皂素對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌具有明顯抑制作用[13]。但是如果將油茶餅粕與其他植物材料如豆粕一起混合后發(fā)酵，其抑制效果明顯降低，并能進一步滿足不同要求[14-16]。因此，建議油茶餅粕可先通過物理方法去除茶皂素，再作固態(tài)發(fā)酵。

圖5 不同溫度處理在油茶餅粕生長比較Fig.5 The growth in different temperatures of Camellia oil-tea cake

圖6 不同含水量處理下油茶餅粕生長比較Fig.6 The growth in different water content of Camellia oil-tea cake