楊高潔，陳俊孚，吳蘇州，李麗坤，劉 昱

(1. 華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430074)(2. 深圳晶萊新材料科技有限公司，廣東 深圳 518000)(3. 廣東省焊接技術(shù)研究所，廣東 廣州 510650)(4. 華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

1 前 言

天然骨是由以膠原蛋白為主的有機(jī)相和以低結(jié)晶度羥基磷灰石為主的無機(jī)相構(gòu)成的復(fù)合礦物質(zhì)，具有精妙的多層級(jí)有序結(jié)構(gòu)。通過仿生礦化法合成的鈣磷納米粒子，不但可以在成分上接近天然骨，還能在納米尺度上模擬天然骨的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[1-3]。近年來，許多研究通過微圖案化法在生物材料表面構(gòu)建微米尺度的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[4]。因此，通過模板誘導(dǎo)礦化自組裝和微圖案化相結(jié)合的制造技術(shù)，有望制備模擬天然骨的仿生微納結(jié)構(gòu)，為獲得非生長因子依賴的復(fù)合骨組織工程材料提供有利條件，是具有較大意義的制備策略。

目前，有許多研究利用復(fù)合模板誘導(dǎo)仿生礦化和協(xié)同自組裝，調(diào)節(jié)生物材料的微觀結(jié)構(gòu)與形貌，從而獲得仿生納米結(jié)構(gòu)。這種可控的仿生納米結(jié)構(gòu)能夠有效調(diào)控機(jī)體干細(xì)胞行為?，F(xiàn)已有多種高分子材料可被用作鈣磷晶體生長調(diào)控的礦化模板，促進(jìn)磷酸鈣的成核、生長，實(shí)現(xiàn)結(jié)晶產(chǎn)物尺寸和形貌的可控合成。從宏觀上講，促進(jìn)礦化的分子模板，例如膠原蛋白、絲素蛋白、硫酸軟骨素、海藻酸鹽、合成多肽等[5]，其分子鏈段上的酰胺基團(tuán)、側(cè)鏈上的氨基和羥基對Ca2+具有一定的吸附結(jié)合能力，可以促進(jìn)磷酸鈣成核結(jié)晶。然而，一些抑制礦化的酸性蛋白分子模板，例如牙釉質(zhì)蛋白1、多聚天冬氨酸[6]等，其分子側(cè)鏈上帶有的大量羧基會(huì)競爭性結(jié)合并屏蔽Ca2+，阻止其與PO43-有效結(jié)合，進(jìn)而抑制磷酸鈣的成核。因此，可以通過選擇促進(jìn)或抑制礦化的高分子模板調(diào)控礦化鈣磷納米粒子的形貌。

有序的微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可以調(diào)控細(xì)胞獨(dú)特或有序的生長形態(tài)，以模擬原生機(jī)體組織中的細(xì)胞排列，從而潛在性地激發(fā)細(xì)胞定向分化[7, 8]。隨著現(xiàn)代生物材料種植體的發(fā)展，基于微圖案化的可控表面設(shè)計(jì)被認(rèn)為可實(shí)現(xiàn)對機(jī)體細(xì)胞行為的調(diào)控，并對植入體在機(jī)體環(huán)境中的骨整合起著至關(guān)重要的作用[9-12]。體外研究表明，微圖案結(jié)構(gòu)(如微米或納米的槽、脊、壁龕或柱陣列)可調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘著、肌動(dòng)蛋白聚合和進(jìn)一步分化[9, 10, 13, 14]。此外，在基底材料表面整合微圖案化的顆?；蚍肿?如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白)，也被認(rèn)作是指導(dǎo)細(xì)胞行為的有效方法[15, 16]。細(xì)胞與材料基質(zhì)的相互作用會(huì)影響?zhàn)ぶ叩姆植己图?dòng)蛋白的聚合，從而細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)途徑刺激細(xì)胞活性，最終實(shí)現(xiàn)定向分化。例如，在線性或矩形微圖案上生長的具有細(xì)長形態(tài)的干細(xì)胞，可以分化為成骨細(xì)胞或心肌細(xì)胞[17, 18]；在方形微圖案上生長的干細(xì)胞由于牽引力的減小從而分化成脂肪細(xì)胞；而在網(wǎng)格狀微圖案上生長的干細(xì)胞由于細(xì)胞間特殊的相互接觸和作用，可被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元細(xì)胞[19, 20]。

鑒于微納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在指導(dǎo)細(xì)胞行為，特別是細(xì)胞分化中的重要作用，構(gòu)建基于仿生雜化納米顆粒的組合微圖案結(jié)構(gòu)主要通過以下幾個(gè)方面誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞的生物學(xué)響應(yīng)：① 通過設(shè)計(jì)的微圖案結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細(xì)胞的空間形態(tài)和排列[21]；② 通過仿生雜化納米顆粒的組成及其高表面能改善細(xì)胞外基質(zhì)的粘附和分泌[22]；③ 通過細(xì)胞與基底材料微納仿生結(jié)構(gòu)的相互作用，模擬機(jī)體內(nèi)的骨再生環(huán)境刺激干細(xì)胞分化[23]。結(jié)合以上復(fù)合策略，將有可能改善骨修復(fù)材料的生物相容性和誘導(dǎo)生物活性，從而加速骨再生。

本研究介紹了一種礦化羥基磷灰石納米顆粒(hydroxyapatite nanoparticles, HANPs)從納米尺度到微米尺度拓?fù)湫蚊驳目煽刂苽浞椒?，即利用?fù)合仿生模板作為介導(dǎo)，通過模擬生物礦化過程獲得形貌可控的HANPs，再以微圖案形式排列、整合在水凝膠膜中，制得一種在成分、微米結(jié)構(gòu)、納米形貌上高度仿生的骨修復(fù)材料。隨后，以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone mesenchymal stem cells, rMSCs)作為研究對象，對合成的骨修復(fù)材料進(jìn)行一系列體外細(xì)胞生物學(xué)評價(jià)。首次在體內(nèi)評價(jià)這種大尺度仿生礦化HANPs微圖案的促進(jìn)骨修復(fù)能力?；趶?fù)合仿生模板礦化法，并結(jié)合微圖案化制備具有微納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的仿生骨組織工程材料，是一種很有前景的干細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，可為發(fā)展新型基于表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的骨組織工程材料奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 仿生骨組織工程材料的制備

2.1.1 復(fù)合礦化模板的構(gòu)建

分別制備質(zhì)量濃度為1 mg/mL的I型膠原蛋白(collagen I，簡稱Col I，由美國Sigma公司提供)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，簡稱CS，由美國Sigma公司提供)、海藻酸鈉(sodium alginate，簡稱SA，由國藥集團(tuán)提供)和聚丙烯酸鈉(sodium polyacrylate，簡稱PAA，由中國阿拉丁試劑公司提供)溶液，以及同樣濃度的Col-CS、Col-SA、Col-PAA高分子復(fù)合溶液(按濃度1∶1混合)。隨后利用J-810型圓二色譜儀(日本Jasco公司)對各組高分子溶液進(jìn)行檢測，分析高分子模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)和模板間的相互作用。

2.1.2 礦化HANPs的制備

為了模擬天然礦化過程中鈣磷鹽在有機(jī)-無機(jī)界面聚集成核結(jié)晶，以及有機(jī)-無機(jī)組分協(xié)同共組裝過程，采用水-油-固相法和仿生礦化法相結(jié)合的方法獲得HANPs。具體過程為：取0.25 g十八胺(由國藥集團(tuán)提供)、2 mL亞油酸(由美國Sigma公司提供)和8 mL無水乙醇(由國藥集團(tuán)提供)共混并充分溶解，再將2 mL、0.5 mol/L的Col I與1 mL、5 mol/L的硝酸鈣溶液共混后，將這兩種混合溶液共混并攪拌30 min；隨后，分別將50 g/L的CS、SA、PAA溶液與1 mL、3 mol/L的磷酸氫二銨溶液充分混合，緩慢滴入之前攪拌的混合體系中，同時(shí)用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)該體系的pH值至7～8，在37 ℃的恒溫水浴中充分?jǐn)嚢? h后，靜置于該溫度的水浴中陳化3 d；將得到的沉淀用去離子水清洗數(shù)次以獲得純化的HANPs，分別命名為Col-CS/HA、Col-SA/HA和Col-PAA/HA，對他們進(jìn)行凍干后保存在-4 ℃的冰箱內(nèi)。

2.1.3 仿生微圖案的構(gòu)建

首先，設(shè)計(jì)了寬度、間距均為50 μm的條紋狀和寬度為50 μm、間距為100 μm網(wǎng)格狀微圖案掩膜版，通過光刻技術(shù)在涂有負(fù)性光刻膠的硅片上形成與掩膜版相對應(yīng)的微圖案結(jié)構(gòu)，再利用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膠倒模形成具有反向微圖案結(jié)構(gòu)的二級(jí)印章；其次，在PDMS膠二級(jí)印章上覆蓋100 g/L的瓊脂糖(由國藥集團(tuán)提供)，冷凝倒模后形成親水的瓊脂糖微圖案印章；最后，將經(jīng)過超聲預(yù)處理的10 g/L的礦化HANPs懸液滴加在瓊脂糖微圖案印章表面，形成均勻薄層并晾干后，通過微接觸法將礦化HANPs微圖案影印在光滑的PDMS膠表面。

2.1.4 仿生骨組織工程材料的制備

將先前制備的Col-CS/HA、Col-SA/HA、Col-PAA/HA 3組礦化HANPs以50 mg/mL的質(zhì)量濃度分別分散于5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的明膠(由國藥集團(tuán)提供)水溶液中，并設(shè)置不添加HANPs的空白組，在4 ℃固化后進(jìn)行凍干處理。將凍干后的支架浸入預(yù)冷的1%戊二醛溶液(由國藥集團(tuán)提供)中，反應(yīng)交聯(lián)1 h；多次水洗后，加入10 g/L牛血清白蛋白(由中國Biosharp公司提供)溶液封閉殘余醛基，再經(jīng)數(shù)次水洗后獲得礦化HANPs多孔支架。

將含有10 g/L羥基聚乙二醇活性酯(NHS-PEG-OH，由美國Sigma公司提供)和100 g/L明膠(由武漢申試公司提供)的混合溶液覆蓋在PDMS膠表面的礦化HANPs微圖案上，并置于4 ℃的冰箱內(nèi)；待凝固后，將其加入預(yù)冷的1%戊二醛溶液中，反應(yīng)交聯(lián)1 h；經(jīng)多次水洗后，加入10 g/L牛血清白蛋白溶液封閉殘余醛基，再經(jīng)數(shù)次水洗后，獲得整合了礦化HANPs微圖案的仿生骨組織工程材料。此外，以同樣的方法將礦化HANPs微圖案整合在透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，簡稱HA，由美國Sigma公司提供)水凝膠和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，簡稱PLGA，由美國Sigma公司提供)上。

2.2 成分與顯微組織的表征與分析

使用Tecnai G2 20型透射電鏡(TEM，荷蘭FEI公司)和Sirion 200型掃描電鏡(SEM，荷蘭FEI公司)觀察礦化HANPs混合溶液的納米形貌，并通過X’Pert PRO型X射線衍射儀(XRD，荷蘭PANalytical公司)和能量色散光譜(EDX)分析其成分。利用場發(fā)射掃描電鏡(FSEM，荷蘭FEI公司)和IX71型共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM，日本Olympus公司)對微圖案結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

通過熒光顯微鏡、FSEM觀察仿生骨組織工程材料的表面形貌。此外，為了強(qiáng)化仿生骨組織工程材料上微圖案的調(diào)控能力，將其置于含有0.14 g/L CaCl2的DPBS緩沖溶液中，在36.5 ℃下礦化沉積24 h后，用去離子水清洗去除殘留，并通過FSEM觀察其表面Ca,P沉積情況。

2.3 生物學(xué)性能的表征與評價(jià)

2.3.1 體外細(xì)胞學(xué)評價(jià)

將接有羅丹明的具有礦化HANPs微圖案的骨組織工程材料作用于細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞的限定作用。為了研究該仿生骨組織工程材料高效調(diào)控細(xì)胞行為的能力，先將樣品經(jīng)過體外礦化沉積獲得強(qiáng)化的磷酸鈣微圖案層；隨后，將所有樣品都置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，并進(jìn)行伽馬輻射滅菌；最后，將rMSCs(由賽業(yè)生物科技有限公司提供)以1×105/mL的濃度種于材料表面，并用DMEM完全培養(yǎng)基(10%的胎牛血清(FBS)和雙抗(由Gibco提供))在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～7 d。

為了研究rMSCs的形貌，將經(jīng)4%多聚甲醛(由谷歌生物提供)固定的樣品，通過磷酸緩沖鹽溶液(PBS，由Gibco提供)清洗后，使用0.3%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，由美國賽默飛世爾科技公司提供)通透，隨后用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(由美國Cytoskeleton提供)和DAPI(由上海碧云天生物科技公司提供)分別對細(xì)胞骨架和細(xì)胞核進(jìn)行染色，并使用CLSM對其進(jìn)行觀察。

為了研究材料對細(xì)胞分化的影響，采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)和免疫熒光(immunofluorescence, IF)檢測血管的生成和成骨標(biāo)志物的表達(dá)。將rMSCs在DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，用Trizol試劑(由美國賽默飛世爾科技公司提供)提取其總RNA，隨后用sensifast cDNA合成試劑盒(由美國Bioline公司提供)從1 g總RNA中合成互補(bǔ)DNA，并利用SYBR Green qPCR主混合物(由美國賽默飛世爾科技公司提供)在ABI Prism 7500型熱循環(huán)儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上對RUNX-2、OCN、VEGFR-2、CD144進(jìn)行RT-PCR基因表達(dá)分析。通過IF染色對培養(yǎng)14 d的rMSCs進(jìn)行成骨和成血管相關(guān)蛋白的標(biāo)記和分析，即將用兔抗大鼠lgG標(biāo)記RUNX-2、OCN、VEGFR-2、CD144的rMSCs在4 ℃下孵育過夜，之后再用羅丹明-山羊抗兔二級(jí)抗體標(biāo)記。將用熒光標(biāo)記細(xì)胞肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞核的rMSCs放在熒光顯微鏡下觀察，并用FC500型流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)進(jìn)一步定量測定成骨和血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)，即對細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化。經(jīng)PBS洗滌后，用40 g/L多聚甲醛固定，再進(jìn)行如上的IF染色操作，然后用流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行分類。

2.3.2 體內(nèi)細(xì)胞學(xué)評價(jià)

雄性SD大鼠(約300 g)的皮下植入：首先，在3只大鼠背部皮膚上分別劃出約1 cm的切口，將Col-CS/HA、Col-SA/HA、Col-PAA/HA多孔支架和空白對照組(純明膠)，以及具有條紋狀、網(wǎng)格狀和隨機(jī)分布狀微圖案結(jié)構(gòu)的仿生骨膜材料植入每只大鼠皮下。保存2周后，將樣品取出，用PBS清洗并固定在40 g/L多聚甲醛中，使用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行切片處理后，通過蘇木精-伊紅(H&E)和Masson’s組織學(xué)染色進(jìn)行分析。其次，通過對大鼠顱骨建立臨界尺寸缺損模型評估仿生骨組織工程材料促進(jìn)骨修復(fù)的能力。具體步驟為：將所有大鼠隨機(jī)分成4組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3只。將大鼠麻醉后，在其頭皮上做一個(gè)切口以露出頭骨，用鉆孔機(jī)構(gòu)建一個(gè)直徑為5 mm的顱骨缺損，分別填充上條紋狀、網(wǎng)格狀和無規(guī)則狀圖案組的材料后縫合傷口，并在術(shù)后立即對大鼠肌肉注射20 000國際單位的青霉素。術(shù)后4周時(shí)取出大鼠顱骨，對取出的顱骨樣品進(jìn)行顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro CT)分析，并對感興趣區(qū)域進(jìn)行3D重建，定量計(jì)算缺損區(qū)域的成骨體積、骨密度、骨小梁數(shù)目和骨厚度。此外，對獲得的樣本切片并進(jìn)行H&E和Masson’s染色，分析其組織形態(tài)；通過IF雙染，對成骨相關(guān)的RUNX-2蛋白和成血管相關(guān)的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)進(jìn)行標(biāo)記，并在熒光顯微鏡下對這兩種蛋白進(jìn)行觀察。

2.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(x±s)表示，*P<0.05被認(rèn)為是顯著性差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)合模板的結(jié)構(gòu)分析

通過圓二色圖譜表征分析(圖1)，Col的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)被引入調(diào)控模板，通過氫鍵作用使這兩種結(jié)構(gòu)被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變成了β折疊結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析可知，CS、SA、PAA 3種調(diào)控分子作為單一模板與Col分子組成復(fù)合模板后，其β折疊結(jié)構(gòu)的含量減少了。這是因?yàn)橐哉{(diào)控分子作為單一模板時(shí)，其分子重復(fù)鏈段結(jié)構(gòu)簡單，功能基團(tuán)(羧基)排列規(guī)整，故在水溶液中有利于通過氫鍵形成穩(wěn)定的β折疊結(jié)構(gòu)。當(dāng)體系中加入Col分子后，兩種分子模板之間會(huì)形成分子間氫鍵，擾亂了調(diào)控分子內(nèi)規(guī)整氫鍵形成的β折疊結(jié)構(gòu)，故降低了復(fù)合體系中β折疊結(jié)構(gòu)的含量。因此，利用Col分子為主模板，通過引入不同的第二元分子模板(CS、SA、PAA)，從而調(diào)控礦化納米顆粒在復(fù)合模板上誘導(dǎo)生成的形貌。

圖1 復(fù)合模板的圓二色圖譜和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Circular dichroism spectra and secondary structure analysis of bi-templates

3.2 礦化HANPs的形貌調(diào)控

在不同模板的誘導(dǎo)調(diào)控下，礦化顆粒的形貌各有不同，如圖2所示。其中，在Col模板下形成了棒狀晶體，沿Col長軸方向排列；在CS模板下形成了針狀晶體，呈現(xiàn)束狀排布；在SA模板介導(dǎo)下合成的礦化顆粒具有小的片狀結(jié)構(gòu)；在PAA模板介導(dǎo)下合成的礦化顆粒為球形串珠狀；在Col-CS、Col-SA、Col-PAA 3種復(fù)合模板的誘導(dǎo)調(diào)控下，礦化顆粒的形貌分別呈現(xiàn)長棒狀、長而寬的片狀和相互連接的串珠狀。

根據(jù)XRD分析結(jié)果(圖3a)，合成的納米顆粒顯示出羥基磷灰石的特征衍射峰，且都呈現(xiàn)出一定程度的寬化現(xiàn)象。此外，EDX圖譜也同樣表明，納米顆粒均為缺鈣型羥基磷灰石(圖3b)。Col-CS復(fù)合模板由于具有較弱的Ca2+結(jié)合能力，導(dǎo)致生成的礦化顆粒缺鈣程度較低；而Col-PAA復(fù)合模板大量奪取了溶液中用于晶體生長的Ca2+，故最終生成產(chǎn)物的缺鈣程度較高。以不同模板為介導(dǎo)的礦化HANPs均具有可控形貌，都能在最大程度上模擬新生天然骨的納米級(jí)精細(xì)結(jié)構(gòu)和成分。

圖2 不同模板誘導(dǎo)下的礦化顆粒微觀形貌的SEM(a)和TEM(b)照片F(xiàn)ig.2 SEM (a) and TEM (b) images showing the microstructures of mineralized particles induced by different templates

圖3 以不同模板為介導(dǎo)的礦化HANPs的XRD(a)和EDX(b)圖譜Fig.3 XRD (a) and EDX (b) patterns of mineralized HANPs induced by different templates

3.3 仿生微拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的構(gòu)建

為了模擬機(jī)體天然骨的多層級(jí)結(jié)構(gòu)，達(dá)到更好地誘導(dǎo)干細(xì)胞行為的效果，本研究設(shè)計(jì)了條紋狀和網(wǎng)格狀陣列微圖案。通過光刻技術(shù)和微接觸法，將設(shè)計(jì)的微圖案加載到PDMS膠基底上，從而獲得具有微圖案的HANPs陣列結(jié)構(gòu)。微接觸法是一種有效制備大面積微圖案結(jié)構(gòu)的方法，被廣泛用于蛋白分子、生物大分子和納米粒子的拓?fù)潢嚵蟹植糩24]。如圖4所示，通過該方法獲得的礦化HANPs微圖案結(jié)構(gòu)完整、效果穩(wěn)定、可大范圍制備，是一種有效構(gòu)建二維微拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的方法。通過將形貌可控的礦化HANPs構(gòu)建成二維仿生微拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，使該材料在大尺度上表現(xiàn)出可潤濕性和高表面能，從而更有利于細(xì)胞的募集、粘附。此外，礦化HANPs也被證實(shí)可以顯著刺激干細(xì)胞行為，特別是在促進(jìn)細(xì)胞的成骨和成血管分化上具有很好表現(xiàn)[25]。

3.4 仿生骨組織工程材料的構(gòu)建

考慮到PDMS膠不可降解且?guī)缀鯖]有生物活性，不利于體內(nèi)骨組織修復(fù)，故將PDMS膠基底上的微圖案轉(zhuǎn)移到明膠水凝膠膜表面，形成具有礦化HANPs微圖案層膜結(jié)構(gòu)的仿生骨膜材料[26, 27]。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，礦化HANPs微圖案被很好地固定在明膠水凝膠膜表面(圖5a)。純明膠基質(zhì)表面光滑，可以透過其表面觀察到礦化HANPs的微圖案結(jié)構(gòu)(圖5b)。此外，礦化HANPs微圖案也被成功整合到了PLGA和HA材料表面，這意味著該工藝可以擴(kuò)展到其他類型的組織工程有機(jī)材料上。

圖4 礦化HANPs的條紋狀和網(wǎng)格狀微圖案結(jié)構(gòu)：(a)微圖案設(shè)計(jì)，(b)SEM照片，(c)激光共聚焦掃描顯微鏡照片F(xiàn)ig.4 Microstructures of line and grid patterns for mineralized HANPs: (a) designed micropatterns, (b) SEM images, (c) CLSM images

通過在仿生骨膜材料表面進(jìn)行體外礦化，選擇性地沉積磷酸鈣(圖5c)，顯著增強(qiáng)了材料上的礦化HANPs微圖案結(jié)構(gòu)。通過強(qiáng)化HANPs微圖案結(jié)構(gòu)，可以將這種有序的二維薄層結(jié)構(gòu)構(gòu)建成具有一定厚度的三維結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)后期蛋白質(zhì)的吸收和干細(xì)胞的粘附，進(jìn)一步增強(qiáng)仿生骨組織工程材料對干細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力和其在骨科的潛在應(yīng)用。

3.5 形貌調(diào)控細(xì)胞行為的研究

大量研究證明，特定尺寸的條紋狀和網(wǎng)格狀微圖案可以控制細(xì)胞的形態(tài)和排列，從而指導(dǎo)干細(xì)胞的分化[28, 29]。本研究對仿生骨組織工程材料進(jìn)行了NHS-PEG-OH修飾，以防止細(xì)胞粘附在沒有礦化HANPs的區(qū)域，從而更好地調(diào)控rMSCs行為。根據(jù)圖6的熒光顯微鏡照片可知，礦化HANPs微圖案結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的限定和取向生長具有良好的調(diào)控能力。將rMSCs在這兩種圖案中培養(yǎng)14 d后，礦化HANPs微圖案對細(xì)胞限定和生長取向的調(diào)控效果依舊明顯，rMSCs仍表現(xiàn)出持久且大范圍的取向分布。

圖5 具有礦化HANPs微圖案的仿生骨膜材料的微觀形貌：(a)以明膠為基底的骨膜材料的熒光和明場顯微照片；(b)不同基底的骨膜材料的FSEM照片；(c)經(jīng)體外礦化的骨膜材料的FSEM照片F(xiàn)ig.5 Morphologies of biomimetic bone periostea based on mineralized HANPs with micropatterns: (a) fluorescent and bright field microscope images of bone periostea using gelatin membrane as substrate; (b) FSEM images of bone periostea using different substrates; (c) FSEM images of bone periostea after being mineralized in vitro

圖6 具有礦化HANPs微圖案的仿生骨組織修復(fù)材料上粘附的rMSCs的熒光顯微照片F(xiàn)ig.6 Fluorescent microscope images of rMSCs adhered to the biomimetic bone tissue engineering materials with different micropatterns of mineralized HANPs

利用RT-PCR定量分析了rMSCs在仿生骨組織工程材料上RUNX-2、OCN、VEGFR-2和CD144的表達(dá),如圖7a和7b所示。具有礦化HANPs微圖案的材料上的rMSCs均有RUNX-2、OCN、VEGFR-2和CD144的強(qiáng)表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了該材料具有顯著促進(jìn)成骨和血管生成的能力。與隨機(jī)分布的礦化HANPs組相比，微圖案組中表達(dá)的鈣結(jié)節(jié)更明顯(圖7c)，這說明定向排列的rMSCs鈣化水平更高，這也是微圖案結(jié)構(gòu)促進(jìn)成骨的積極標(biāo)志。

由此可知，這種具有礦化HANPs微圖案的仿生骨組織工程材料，可以顯著促進(jìn)細(xì)胞在體外成骨和血管生成，且條紋組表現(xiàn)出更加顯著的分化相關(guān)基因表達(dá)。這可能歸因于：首先，通過細(xì)胞形態(tài)依賴的方式使細(xì)胞的排列和生長長期受到微圖案結(jié)構(gòu)的限定和調(diào)控，從而誘導(dǎo)其定向分化；其次，細(xì)胞粘附于外基質(zhì)的HANPs上，礦化HANPs的成分激活了血管生成的Ca2+依賴通道和成骨的p-AMPK途徑；最后，前期分化的細(xì)胞分泌的成骨或成血管相關(guān)蛋白，如BMP-2或VEGF，可以與磷灰石共沉積，進(jìn)一步刺激周圍受到限制的其他細(xì)胞從而強(qiáng)化細(xì)胞分化水平。礦化HANPs微圖案結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的同時(shí)，避免了對多種生長因子的需求，從而大大優(yōu)化了干細(xì)胞培養(yǎng)和研究平臺(tái)。

圖7 rMSCs的成骨(a)和成血管(b)相關(guān)基因表達(dá)情況，以及其經(jīng)茜素紅染色后的顯微照片(c)Fig.7 Osteogenesis (a) and angiogenesis (b) gene expression of rMSCs and micrographs after they being stained by alizarin red (c)

3.6 仿生骨組織工程材料的體內(nèi)評價(jià)

3.6.1 礦化HANPs的體內(nèi)生物活性

為了評價(jià)不同形貌的礦化HANPs的組織相容性，將納米顆粒分散于明膠水凝膠中，凍干交聯(lián)形成多孔支架。礦化HANPs均可分散在多孔支架表面，有利于細(xì)胞粘附、生長于顆粒表面并行使細(xì)胞功能。支架皮下植入大鼠體內(nèi)2周后，經(jīng)H&E和Masson’s染色后的顯微照片如圖8所示。不同形貌的礦化HANPs均表現(xiàn)出良好的組織相容性，軟組織長入明顯，并分泌了大量膠原纖維，顯著提高了細(xì)胞活性。其中Col-SA/HA組支架的降解程度最高，大部分支架已經(jīng)被降解成島狀并被巨噬細(xì)胞和纖維細(xì)胞所環(huán)繞，其間還存在更多的血管結(jié)構(gòu)。這說明弱晶態(tài)的Col-SA/HA更易在體內(nèi)被組織降解、代謝吸收。

3.6.2 微納結(jié)構(gòu)的分化誘導(dǎo)

將具有礦化HANPs微圖案的仿生骨組織工程材料(圖9a)進(jìn)行體外礦化處理，通過選擇性鈣磷富集，從而強(qiáng)化礦化HANPs微圖案結(jié)構(gòu)，避免其在復(fù)雜體內(nèi)環(huán)境中降解。通過大鼠皮下植入，評價(jià)了具有不同礦化HANPs微圖案的仿生骨組織工程材料的生物相容性，以及其促進(jìn)體內(nèi)血管生成和異位成骨的能力。通過RT-PCR定量分析了仿生骨膜在體內(nèi)促進(jìn)血管生成和成骨的能力。與隨機(jī)分布組相比(圖9b)，條紋組和網(wǎng)格組中CD144和VEGFR-2因子的表達(dá)顯著增加，且條紋組最高。OCN作為成骨分化晚期的標(biāo)志性因子，相較于隨機(jī)分布組，在條紋組和網(wǎng)格組具有更高的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。此外，RUNX-2的mRNA含量太小未被檢測到。組織學(xué)染色分析證實(shí)(圖9c)，這些仿生材料均表現(xiàn)出良好的組織相容性和低的免疫原性。微圖案組的成纖維組織生長良好，并伴隨大量血管生成，且新生血管的數(shù)量和面積明顯大于隨機(jī)分布組。

圖8 不同形貌的礦化HANPs支架經(jīng)H&E(a, c, e, g)和Masson’s(b, d, f, h)染色后的顯微照片：(a, b)Col-CS/HA，(c, d)Col-SA/HA，(e, f)Col-PAA/HA，(g, h)空白對照組Fig.8 Micrographs of mineralized HANPs with different microstructures deposited scaffold after H&E (a, c, e, g) and Masson’s (b, d, f, h) staining: (a, b) Col-CS/HA, (c, d) Col-SA/HA, (e, f) Col-PAA/HA, (g, h) control group

綜上，具有微圖案結(jié)構(gòu)的仿生骨膜可能有一定的促進(jìn)異位成骨的能力，本研究將進(jìn)一步通過骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

3.6.3 促血管化骨再生

采用大鼠顱骨臨界尺寸缺損模型評價(jià)不同形貌的礦化HANPs誘導(dǎo)骨再生的能力。在整個(gè)骨修復(fù)過程中，仿生多孔骨組織支架與機(jī)體骨及周圍組織具有良好的柔性和機(jī)械相容性，基本保持在原始缺損位置。植入4周后取出顱骨，由Micro CT評估骨修復(fù)情況可知，不同形貌的礦化HANPs表現(xiàn)出不同的促骨愈合能力。其中，片狀的Col-SA/HA組的礦化基質(zhì)體積增大，新骨覆蓋率最高，缺損區(qū)域幾乎完全長合(圖10)。

隨后，在大鼠顱骨缺損區(qū)域植入具有礦化HANPs微圖案的仿生骨膜材料，4周后，對樣品進(jìn)行組織學(xué)染色。結(jié)果顯示，與其他組相比，條紋組和網(wǎng)格組材料促進(jìn)成纖維組織生長、膠原分泌、血管生成更明顯。觀察組織與種植體之間的界面可見，空白對照組的顱骨缺損部位主要由纖維結(jié)締組織橋接，骨修復(fù)僅限于原生骨邊緣；而條紋組和網(wǎng)格組中有更多的類骨組織，并形成了大量新生血管，如圖11所示。其中，條紋組新形成的骨化組織明顯厚于其他組，缺損部位完全愈合，骨結(jié)構(gòu)平坦連續(xù)且呈現(xiàn)逐漸成熟趨勢。同時(shí)，隨機(jī)分布組也呈現(xiàn)出良好的新骨形成狀態(tài)，由此說明明膠作為礦化HANPs的載體膜材料，具有良好的骨傳導(dǎo)性。

圖9 仿生骨組織工程材料的皮下植入：(a)植入材料照片；(b)成骨和成血管相關(guān)基因表達(dá)情況；(c)經(jīng)H&E(左)和Masson’s(右)染色后的植入材料的顯微照片F(xiàn)ig.9 Subcutaneous implantation of biomimetic bone tissue engineering materials: (a) photos of implant materials; (b) osteogenesis and angiogenesis gene expression; (c) micrographs of implant materials after H&E (left) and Masson’s (right) staining

圖10 不同形貌的礦化HANPs的顱骨修復(fù)評價(jià)：(a)基于Micro CT的大鼠顱骨缺損部位的3D構(gòu)建俯視圖(上)和截面圖(下)；(b) 缺損部位成骨量的定量分析Fig.10 Evaluation on skull defect repair of mineralized HANPs with different microstructures: (a) 3D reconstruction vertical (upper) and transverse (lower) section views based on Micro-CT; (b) quantitative evaluation of bone formation content in defect sites

圖11 基于組織學(xué)染色的仿生骨膜材料的血管化成骨體內(nèi)評價(jià)：(a)H&E染色，(b)Masson’s染色Fig.11 Evaluation on vascularized osteogenesis of biomimetic bone periostea in vivo base on histological staining: (a) H&E staining, (b) Masson’s staining

通過IF染色進(jìn)一步評價(jià)了仿生骨膜材料促進(jìn)血管化骨再生的能力，IF標(biāo)記的α-SMA代表血管的生成。與其他組相比，條紋組新生血管的量和面積明顯最大；同時(shí)，熒光標(biāo)記的成骨RUNX-2蛋白也顯示，微圖案組的成骨率高于隨機(jī)分布組和空白組，且條紋組的成骨表達(dá)水平最高，如圖12所示。此外，仿生骨組織工程材料的結(jié)構(gòu)也具有良好的骨傳導(dǎo)性。因此，在仿生骨組織工程材料成分、形貌和結(jié)構(gòu)的共同作用下，可誘導(dǎo)生成更多的膠原和骨樣組織，從而形成骨小梁，最終促進(jìn)新骨組織的再生。

4 結(jié) 論

本研究開發(fā)了一個(gè)有效的組織工程平臺(tái)來調(diào)控干細(xì)胞行為和誘導(dǎo)新骨再生。將形貌可控的礦化HANPs高度有序地排列成幾何微圖案，并大規(guī)模地整合在仿生骨組織工程材料內(nèi)，以模擬天然骨的組成和微納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。通過體外礦化促進(jìn)鈣磷在微圖案表面的選擇性沉積和富集，從而增強(qiáng)其微納結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用。礦化HANPs微圖案可大范圍地限制rMSCs的形態(tài)和取向分布，誘導(dǎo)其成骨和成血管分化。

更重要的是，本研究首次證明了礦化HANPs微圖案可用于大規(guī)模調(diào)節(jié)體內(nèi)血管生成和骨形成，而且具有條紋狀微圖案結(jié)構(gòu)的仿生骨組織工程材料表現(xiàn)出更顯著的促血管化骨再生能力。此外，該材料具有很強(qiáng)的制作可行性，在現(xiàn)有和新興的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒕哂型怀龅呐R床應(yīng)用價(jià)值。

圖12 基于免疫熒光標(biāo)記的仿生骨膜材料的成骨和成血管能力評價(jià)Fig.12 Evolution on the ability of osteogenesis and angiogenesis gene expression of biomimetic bone periostea based on immunofluorescence labeling