圖爾蓀阿依·圖爾貢 王 帆 付龍龍努爾古麗·熱合曼 劉小莉

(1. 新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830054；2. 江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；3. 江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017)

普羅威登斯菌(Providenciavermicola)是一類能夠導致食品腐敗變質的革蘭氏陰性腐敗菌，屬于腸道桿菌科，為條件致病菌，廣泛存在于土壤、水體、食品中，不僅影響食品質量安全，還會引起人體腹瀉、腸道內微感染、尿道感染等[1-2]。何鵬暉等[3]發(fā)現普羅威登斯菌在腐敗發(fā)酵蔬菜中具有產醭特性。施荷等[4]研究表明，冷卻鹿肉貯藏初期會產生普羅威登斯菌，且在貯藏中期活力逐漸增強，是冷卻鹿肉貯藏末期的優(yōu)勢菌屬。黃佳奇[5]研究表明，不同包裝條件下小黃魚表面優(yōu)勢腐敗菌差異較大，普羅威登斯菌是空氣包裝小黃魚的優(yōu)勢腐敗菌之一。課題組[6]從自然腐敗的香辣蟹樣品中分離鑒定出一株普羅威登斯菌，且食品工業(yè)中常用的化學防腐劑如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等，以及生物保鮮劑乳酸鏈球菌素(Nisin)對該菌沒有抑制作用。

丁香酚(Eugenol)是一種熱穩(wěn)定性好、毒性較低、不易殘留的天然香料。作為丁香精油的主要成分，丁香酚對導致食品腐敗的多種細菌和真菌具有較強抑制作用[7-8]，如金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、福氏痢疾桿菌、鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌、李斯特菌、沙克乳酸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等細菌以及根霉菌、鏈格孢菌、灰霉菌等，因而常被用于食品的防腐保鮮[9-11]。試驗擬以前期從香辣蟹樣品優(yōu)勢腐敗菌中分離的普羅威登斯菌作為指示菌，研究并探討丁香酚對普羅威登斯菌的抑制效果及抑菌機理，為后續(xù)丁香酚應用于水產保鮮提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普羅威登斯菌：從自然腐敗的香辣蟹樣品中分離鑒定，菌株編號XLX5，16S rDNA序列結果提交至GenBank核酸數據庫得到Accession number為KC456588，保藏于江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所食品生物工程研究室；

丁香精油：丁香酚含量85%，批號2017030102，用乙醇溶解并配成有效濃度為1 mg/mL母液，江西金源天然香料有限公司；

乳酸鏈球菌素(Nisin)、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、殼聚糖、蘋果酸脫氫酶(MDH)酶活測定試劑盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)酶活測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白濃度測定試劑盒：南京建成生物試劑有限公司；

BCA蛋白濃度測定試劑盒：南京天為生物科技有限公司；

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物有限責任公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀：Epoch型，美國Bioteck公司；

掃描電子顯微鏡：MERLIN型，德國ZEISS公司；

日立透射電鏡：HT7700型，日本Hitachi公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 普羅威登斯菌懸浮液的制備 將P.vermicola接種于無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min下活化培養(yǎng)24 h，用新鮮無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基調整菌懸液細菌濃度為1×107CFU/mL，備用。

1.3.2 體外抑菌試驗 采用平板孔阱擴散法初步測定抗菌活性。按1%接種量將活化好的P.vermicola菌懸液接種至無菌營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基中，倒平板。待培養(yǎng)基冷凝后，用直徑為7 mm的打孔器于平板上均勻打出3個孔，分別吸取50 μL 1 mg/mL丁香酚、Nisin、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、殼聚糖注入孔中，37 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈大小，重復3次取平均值[12]。

1.3.3 丁香酚最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測定 根據文獻[13]確定丁香酚最小抑菌濃度(MIC)。將丁香酚用無菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基稀釋至終濃度分別為1.000，0.500，0.250，0.125，0.063，0.031 mg/mL，備用。向96孔板中分別加入100 μL不同濃度的丁香酚稀釋液，再加入100 μL菌濃度為1×107CFU/mL的P.vermicola菌懸液。分別設置陰性對照(100 μL菌懸浮液+100 μL營養(yǎng)肉湯)和空白對照(200 μL營養(yǎng)肉湯)，37 ℃ 培養(yǎng)24 h。以陰性對照中P.vermicola生長呈渾濁和空白對照透明為前提，其他孔內培養(yǎng)物渾濁情況判斷最小抑菌濃度。從96孔板中取樣液渾濁度明顯減少的丁香酚溶液，涂布接種至無菌的固體營養(yǎng)肉湯平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，未見菌落生長的為最低殺菌濃度(MBC)，重復3次。

1.3.4 丁香酚對菌體的處理 取96微孔板，每孔加入100 μL菌濃度為1×107CFU/mL的菌懸液及100 μL丁香酚溶液，丁香酚溶液終濃度分別為1 MIC、2 MIC。分別設置陰性對照(100 μL菌懸浮液+100 μL營養(yǎng)肉湯)和空白對照(200 μL營養(yǎng)肉湯)，于37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.3.5 丁香酚對菌體生長曲線的影響 取96微孔板，每孔加入100 μL菌濃度為1×107CFU/mL的菌懸液及100 μL丁香酚，丁香酚終濃度分別為1 MIC、2 MIC。分別設置陰性對照(100 μL菌懸液+100 μL營養(yǎng)肉湯)和空白對照(200 μL營養(yǎng)肉湯)，置于37 ℃培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)。每2 h用酶標儀測定620 nm處OD值，重復3次取平均值。

1.3.6 丁香酚對普羅威登斯菌形態(tài)的影響

(1) 樣品前處理：將1.3.4中培養(yǎng)物于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集菌體。以磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol/L，pH 7.0)洗滌菌體3次。所得菌體置于4 ℃、2.5%戊二醛中過夜固定。固定好的細菌用pH 7.0磷酸緩沖液漂洗3次，每次靜置10 min，除去戊二醛。

(2) 掃描電鏡觀察：將1.3.6(1)樣品依次置于30%，50%，70%，80%，90%，100%的乙醇中脫水置換，每次15 min。脫水后臨界點干燥，將干燥的菌體固定至金屬臺上，用離子濺射儀對噴金、鍍膜，采用掃描電子顯微鏡進行觀察。

(3) 透射電鏡觀察：將1.3.6(1)樣品置于1%四氧化鋨中固定3 h；除去固定劑的樣品分別經體積分數為50%，70%，80%，90%，100%的乙醇脫水，每次15 min，繼續(xù)用100%丙酮溶液脫水3次，用Epon812固定劑進行包埋，超薄切片，經醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后，采用透射電子顯微鏡進行觀察和圖像采集。

1.3.7 丁香酚對普羅威登斯菌內容物泄露的影響 取96微孔板，每孔加入100 μL菌濃度為1×107CFU/mL的菌懸液及100 μL丁香酚溶液，丁香酚溶液終濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC。分別設置陰性對照(100 μL菌懸浮液+100 μL營養(yǎng)肉湯)和空白對照(200 μL營養(yǎng)肉湯)，于37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將丁香酚處理組和空白對照組培養(yǎng)物于4 ℃、4 000 r/min離心10 min。取上清分別測定260，280 nm處OD值。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清液中可溶性蛋白含量。

1.3.8 菌體內蘋果酸脫氫酶(MDH)酶活和琥珀酸脫氫酶(SDH)酶活變化 將收集的對數期P.vermicola用0.75% 生理鹽水洗滌重懸為1×107CFU/mL的菌懸浮液，添加丁香酚使其終濃度為1 MIC，未添加丁香酚作為空白對照，于37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取菌懸液10 000 r/min低溫離心10 min，收集菌體，并用0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液洗滌3次，每組試驗平行3次。加入與菌體等體積的2 mg/mL的溶菌酶溶液，攪拌均勻，37 ℃水浴15 min后，迅速冰浴，加入等體積的0.1 mol/L SDS Tris-HCl(pH 9.0)緩沖液，10 000 r/min低溫離心15 min，取上清液備用。按試劑盒說明書方法進行MDH、SDH酶活檢測。

1.4 數據分析

采用SPSS軟件整理數據并進行方差分析和差異顯著性檢驗(P<0.05)，采用OriginPro 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 體外抑菌試驗

抑菌試驗結果顯示，丁香酚處理組透明抑菌圈可達(21.6±0.3) mm，抑菌作用顯著。殼聚糖處理組可延緩P.vermicola生長，但不能完全抑制，表現為平板上出現模糊的抑菌圈；Nisin、山梨酸鉀、苯甲酸鈉處理組均沒有出現透明抑菌圈，說明三者對P.vermicola沒有抑菌活性。當丁香酚濃度>0.25 mg/mL時，P.vermicola處理組孔內培養(yǎng)物比陰性對照組清澈，由此確定最低抑菌濃度為0.25 mg/mL；當丁香酚濃度為0.5 mg/mL時，平板上沒有菌落生長，故最低殺菌濃度為0.5 mg/mL。

2.2 生長曲線

由圖1可知，對照組的OD值在8 h內顯著升高，進入對數生長期(P<0.05)。與對照組(CK)相比，0.5，1.0 MIC 丁香酚處理組分別于20，18 h后進入對數生長期且菌體生長速度明顯延遲于對照組，而2.0 MIC組的OD值幾乎沒有增加。這表明丁香酚可以抑制P.vermicola的生長并延遲細菌對數期的生長時間。

圖1 丁香酚對普羅威登斯菌生長曲線影響

2.3 丁香酚對普羅威登斯菌形態(tài)的影響

2.3.1 掃描電鏡 由圖2可知，與對照組相比，丁香酚處理P.vermicola菌體表面發(fā)現皺紋、菌體不飽滿、缺乏充盈感，少量細胞出現損壞，菌體表面粗糙、不光滑，菌體周邊呈現明顯的內容物泄漏。

2.3.2 透射電鏡圖 由圖3可知，未經丁香酚處理的P.vermicola細胞飽滿，有完整的細胞結構，細胞大小均一且形狀規(guī)則，細胞壁、細胞膜和核區(qū)層次分明且清晰可見，細胞質、內容物分布均勻且充實致密，細胞核緊實并且均勻分布于細胞中間。而經丁香酚處理后，菌體細胞開始出現皺褶，細胞質出現不集中，細胞壁分解不明顯，細胞壁和細胞膜變薄，邊界不清晰，質壁之間出現小的間斷，有小的空白區(qū)，細胞質含量減少并且分布不均，核區(qū)分布逐漸分散，聚攏并且邊聚，出現小的空洞。

2.4 內容物泄漏

細胞壁和細胞膜具有保護細菌的作用，是細菌正常生長的基本保障。細菌壁膜系統(tǒng)一旦遭到破壞，會造成分布于細菌內部的許多重要生物大分子如：核酸、蛋白質、糖類等的外流，影響細菌合成代謝功能。通過測定滲漏至細胞外相關生物大分子含量變化，可以反映細菌壁膜系統(tǒng)的完整性[14]。嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)中均含有共軛雙鍵，核酸在260 nm處對紫外線有最大吸收值；氨基酸中含有共軛雙鍵的色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在紫外線280 nm處，因此OD260 nm、OD280 nm值可反映菌體內核酸和蛋白質物質泄漏情況。

由圖4可知，與對照組相比，經不同濃度丁香酚處理18 h后，普羅威登斯菌培養(yǎng)物上清液OD260 nm、OD280 nm值以及可溶性蛋白含量均不同程度增加，2.0 MIC 丁香酚處理后OD值以及蛋白含量顯著增加(P<0.05)，說明丁香酚能夠作用于P.vermicola的壁膜系統(tǒng)，導致細菌壁膜系統(tǒng)遭到損傷，造成細胞內大分子物質外流。

圖2 普羅威登斯菌掃描電鏡圖

圖3 普羅威登斯菌透射電鏡圖

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.5 蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)酶活變化

由表1可知，與對照組相比，P.vermicola丁香酚處理組MDH和SDH酶活均顯著下降，其作用機理可能是丁香酚影響MDH和SDH的分子結構，使其發(fā)生變化，改變構像，降低酶活性[15]。由此可推斷，丁香酚通過降低MDH和SDH酶活力，破壞細胞的能量代謝途徑，抑制P.vermicola生長。

表1 丁香酚對普羅威登斯菌MDH和SDH酶活的影響?

3 結論

以一株分離自水產品中的普羅威登斯菌為研究對象，研究丁香酚對其的抑菌效果。結果表明，丁香酚對普羅威登斯菌有一定的抑制作用，且抑制效果具有劑量依賴性，最低抑制濃度為0.25 mg/mL。丁香酚促使普羅威登斯菌菌體嚴重變形，破壞菌體的完整性，使胞內物質泄漏，胞外可溶性蛋白含量提高，引起細胞內部滲透壓不穩(wěn)定，進而影響細菌胞內生理生化反應，以及胞內維持細胞正常生長代謝相關的酶類，如蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶酶活的降低，從而表現出抑菌特性。丁香酚對水產品中普羅威登斯菌抑菌效果顯著，其抑菌機理與影響細菌細胞壁、細胞膜的通透性和完整性，干擾細菌生理代謝活動有關。后期可開展丁香酚在香辣蟹產品中應用相關研究。