房 柳 王艷成 董微巍 姬文秀

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000)

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)，素有“百草之王”之美稱，是中國中醫(yī)藥寶庫中的瑰寶，也是吉林省得天獨厚的特產(chǎn)資源，目前已有3 000多年的應用歷史[1]。由于人參具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗氧化、治療糖尿病和抗炎等藥理活性[2-6]。經(jīng)過多年來的產(chǎn)業(yè)培育，人參開始走出中藥柜，被作為主要活性成分添加到食品、保健品之中，用來提高其產(chǎn)品功能性。人參皂苷是人參的主要活性成分，主要包括Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2和Rd等人參主皂苷和一些含量甚微的Rg3、compound K、Rh1、Rh2、Rh3等稀有人參皂苷，不同種類的人參皂苷具有不同的藥理活性。研究[7]表明，人參皂苷經(jīng)水解(脫糖基)作用脫去糖基，轉化為稀有人參皂苷，稀有人參皂苷所含糖基少，生物利用度和藥理活性高。孫廣仁等[8]開發(fā)了一種多菌種發(fā)酵人參酒，人參酒發(fā)酵產(chǎn)生稀有皂苷提高了其功能性，改善了人參酒風味。蔡爽[9]開發(fā)了一種人參術苓酵素，發(fā)酵使人參皂苷轉化，具有緩解非潰瘍性消化不良的功效。篩選有利于人參發(fā)酵、高效轉化人參皂苷的功能菌株，提高人參產(chǎn)品功能性，體外合成稀有人參皂苷已成為國內(nèi)外學者們所關注的焦點[10-12]。

昆蟲體內(nèi)共生菌生存環(huán)境獨特，積累著大量具有特殊生理活性和功能的物質，也是人們發(fā)現(xiàn)微生物新物種和制備較好生物活性代謝產(chǎn)物的重要來源。目前多利用昆蟲共生菌中纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等分解纖維素、木質素、制備生物農(nóng)藥等研究[13]，對開發(fā)利用昆蟲共生功能菌改性中草藥活性的研究報道很少。利用昆蟲內(nèi)生菌資源發(fā)酵改性中草藥提高其功能與活性，為中草藥及其功能產(chǎn)品發(fā)酵提供微生物資源目前已日益被關注。Wang等[14]利用冬蟲夏草中真菌高效轉化人參皂苷Rb1→Rd→F2→compound K，轉化率高達82%，制得compound K純度高達91%。冬蟲夏草是中國青藏高原特有的名貴藥材，其資源稀少，價格昂貴，限制了它的廣泛使用[15]。藥用昆蟲洋蟲(Martianusdermestoides)主要以中藥人參、茯苓、紅花等為食，根據(jù)其習性推測洋蟲體內(nèi)具有降解人參皂苷功能菌株。前期課題組成員[16]對洋蟲幼蟲和成蟲內(nèi)生菌組成結構進行了系統(tǒng)分析，結果表明，洋蟲內(nèi)不可培養(yǎng)的和未被分類的菌種占一定的比例，洋蟲體內(nèi)共生菌是龐大的動態(tài)微生物寄居場所，是有待開發(fā)的生物資源。試驗擬利用動物藥洋蟲內(nèi)特殊生境的微生物進行產(chǎn)β-葡萄糖苷酶功能菌株篩選、鑒定，并與植物藥人參中全組分人參皂苷發(fā)酵反應制備人參稀有皂苷(Rg3、Rh1和compound K)，以期改善人參生物利用度。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

洋蟲：延邊大學植物保護實驗室；

鮮人參根(4年生植物)：吉林集安；

正丁醇、甲醇、無水乙醇等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

PCR相關試劑：美國Genview公司；

色譜級乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)和去離子水：色譜級，美國費希爾科學世界公司；

人參皂苷標準品(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh1、Rg2、Rg3、F1和compound K)：國家標準物質網(wǎng)；

真菌DNA提取試劑盒：上海生工生物工程有限公司；

PCR擴增儀：2720-Thermal-Cycler型，美國應用生物系統(tǒng)公司；

高效液相色譜儀：Aglient1260LC型，安捷倫科技有限公司；

電子天平：YP600型，天津天馬橫基儀器有限公司；

離心沉淀器：80-2型，天津賽得利斯實驗儀器分析制造廠；

旋轉蒸發(fā)儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

恒溫水浴鍋：HH-S8A型，上海儀器儀表科技有限公司。

1.2 人參皂苷提取物

取新鮮人參根(4年生植物)樣品干燥并粉碎，取10 g粉末在82 ℃下用1 000 mL 80%乙醇回流冷凝2 h，反復兩次，合并萃取液，減壓濃縮后在50 ℃的烘箱中烘干，制備人參皂苷粗提物[17]。

1.3 洋蟲內(nèi)共生菌液制備

1.3.1 洋蟲的飼養(yǎng)與馴化 按照80%紅棗和20%人參的比例混合飼料飼養(yǎng)馴化洋蟲，在30 cm×20 cm×10 cm培養(yǎng)箱中保持(24±2) ℃的溫度，培養(yǎng)1年。每批幼蟲培養(yǎng)15 d左右，裝入昆蟲培養(yǎng)箱，保持幼蟲和成蟲的適當密度，便于連續(xù)取食，保持種群的穩(wěn)定。

1.3.2 洋蟲內(nèi)共生菌液制備 取洋蟲成蟲15只，置于75%乙醇中90 s，用無菌水反復沖洗，在無菌操作臺用研缽研磨，加極少量蒸餾水移至離心管；先以500 r/min離心5 min，取出上清液，再以10 000 r/min離心5 min，取下方沉淀，加入生理鹽水制備洋蟲內(nèi)共生菌菌液。

1.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定

1.4.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選 利用10倍稀釋法逐級稀釋菌液，然后取100 μL洋蟲菌液加到MRS篩選培養(yǎng)基(加入七葉苷、檸檬酸鐵)上，采用涂布平板法將菌液在培養(yǎng)基上涂布均勻，密封，厭氧條件下恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72 h，觀察其生長狀況。挑選菌落呈黑色且邊緣整齊的單一菌落，利用劃線法將其接種到新的培養(yǎng)基上，多次重復直至得到單一菌株。從中挑選兩株生長狀態(tài)良好且菌落顏色較深的菌株進行后續(xù)試驗[18]。

1.4.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶功能菌株的鑒定 DP336 試劑盒提取基因組DNA，序列通用引物(ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3’)進行PCR 擴增，PCR產(chǎn)物的測序工作由北京百邁客有限公司完成。

1.5 菌液與人參皂苷提取物發(fā)酵反應

取4 mg人參皂苷粗提物，加入500 μL菌液至2 mL離心管中，在85% N2、10% H2和5% CO2的厭氧條件下，將篩選出的菌株以及二者的混合菌株富集培養(yǎng)24 h，取人參主皂苷與菌液反應20 d，采用高效液相色譜質譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)對不同發(fā)酵時間(0，1，2，3，7，12，20 d)下的生物轉化產(chǎn)物進行研究。

1.6 LC-MS/MS分析產(chǎn)物

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)飽和正丁醇3倍體積萃取，以5 000 r/min離心5 min，取上清液，反復3次；將萃取出的菌液旋轉蒸發(fā)至膏狀，加入100 μL液相甲醇，移至液相小瓶，LC-MS/MS分析。安捷倫1260系列液相色譜系統(tǒng)與安捷倫Poroshell ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和C18保護柱對其進行檢測分析。該系統(tǒng)使用Mass Hunter采集軟件B.07.00進行操作。流動相由水(0.1%甲酸，溶劑A)和乙腈(0.1%甲酸，溶劑B)組成，采用以下梯度洗脫程序：0～13 min，0%～23% B；13～33 min，23%～46% B；33～38 min，46%～68% B；38～45 min，68%～68% B；45～55 min，68%～100% B。進樣量2 μL，流速0.5 mL/min，檢測波長203 nm。

利用安捷倫6420型三重四極質譜儀(QQQ-MS)對化合物進行質譜分析。采用正電噴霧離子化(ESI)MS-MS對人參皂苷的代謝產(chǎn)物進行分析。毛細管電壓為4 000 V，氣體以3 L/min的速度流動，氣體溫度為300 ℃。獲得了m/z500～1 500質量范圍內(nèi)的全掃描質譜圖。通過測定發(fā)酵產(chǎn)物中[M+Na]+或[M-2H2O+OH]+離子片段質量來確定人參皂苷含量。

1.7 方法驗證

定量分析采用外標法。制備含有12種人參皂苷標準物質溶液，并稀釋至適當濃度，以繪制標準曲線。通過繪制峰面積與各分析物濃度之間的關系，得到校正曲線。在色譜條件下，以信噪比S/N=3為檢測限(LOD)、S/N=10為定量限(LOQ)為原則，計算12個目標分析物的檢測限和定量限。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

利用七葉苷顯色原理，即七葉苷被β-葡萄糖苷酶水解后生成的6,7-二羥香豆素也叫七葉苷元，與鐵離子反應，使培養(yǎng)基內(nèi)的菌落周圍生成黑褐色物質，從洋蟲成蟲10個菌液樣品體內(nèi)篩選出2株具有產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的功能真菌，編號為WY1、WY2，經(jīng)18S rRNA基因擴增分別對兩株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌進行鑒定。洋蟲內(nèi)生真菌WY1經(jīng)PCR擴增后獲得1條558 bp左右的特異性條帶，WY2經(jīng)PCR擴增后獲得1條598 bp左右的特異性條帶，將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過軟件CLUSTALX 1.83和MEGA 7.00構建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)。

通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果表明，WY1序列與菌株Chaetomiumglobosum相似度達98%，定性該菌株為Chaetomium屬，WY2序列與菌株Aspergillusfumigatus相似度達93%，初步定性該菌株為Aspergillus屬。

2.2 菌株與人參皂苷發(fā)酵反應

2.2.1 定量方法驗證 對一定濃度范圍內(nèi)的人參皂苷標椎品線性校準曲線進行分析，并進行線性回歸計算，按3倍信噪比和10倍信噪比計算方法分別確定檢出限和定量限，參數(shù)與結果見表1。

如表1所示，在質量濃度50～5 000 ng/mL范圍內(nèi)，相關系數(shù)均大于0.992，所有分析物的濃度與峰面積呈良好的線性關系，可以滿足12種人參皂苷標準化合物檢測計算要求。

2.2.2 內(nèi)生菌WY1與人參皂苷提取液發(fā)酵產(chǎn)物分析

利用內(nèi)生菌WY1對人參皂苷提取液進行生物轉化，通過HPLC-MS/MS對發(fā)酵產(chǎn)物中人參皂苷進行定性分析，檢測結果如圖2所示。

由圖2可知，在人參粗提掖中共有7種人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd)在WY1作用下，發(fā)酵產(chǎn)物為稀有人參皂苷Rh1。

定量分析了人參主皂苷在WY1菌液作用下動態(tài)發(fā)酵過程發(fā)酵產(chǎn)物中人參皂苷的變化趨勢，如圖3所示。人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量隨著與WY1菌液的發(fā)酵反應時間增長而逐漸減少，而人參主皂苷Rd含量呈先減少后升高的變化趨勢。代謝初期Rd 被水解轉化，在0～5 d其含量隨著時間變化而逐漸減少，但是，由于二醇類人參皂苷Rb1、Rc、Rb2在發(fā)酵反應過程中水解掉C-20位外部糖基轉化被轉化生成Rd，在5～20 d 其含量又呈升高趨勢，所以在WY1作用下轉化途徑是Rb1/Rb2/Rc→Rd。稀有人參皂苷Rh1是三醇類人參皂苷(Rg1，Re，Rf)主要發(fā)酵產(chǎn)物，其可能由于在WY1作用下人參皂苷Re水解掉C-6位外部糖基轉化為人參皂苷Rg1，人參皂苷Rg1水解掉C-6位外部糖基轉化為人參皂苷Rh1；Rf水解掉C-6位外部糖基直接轉化為Rh1，其轉化途徑為Re→Rg1→Rh1；Rf→Rh1，為此，隨著發(fā)酵反應進行人參皂苷Rh1含量逐漸升高。目前，稀有人參皂苷Rh1主要是通過合成和轉化的方法來獲取，其中微生物轉化法具有反應體系穩(wěn)定、菌種生長迅速且無需分離純化酶液等優(yōu)點，受到眾多研究者的青睞[19]，試驗從洋蟲內(nèi)分離的C. WY1可以與人參總皂苷發(fā)生去糖基化反應，將人參皂苷中二醇類皂苷轉化為Rd，將三醇類皂苷生物轉化為稀有皂苷Rh1，可為制備靶向制備Rh1發(fā)酵功能菌提供資源。

圖1 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.3 內(nèi)生菌WY2與人參皂苷提取液發(fā)酵產(chǎn)物分析

利用HPLC-MS/MS定性分析內(nèi)生菌WY2對人參皂苷提取液發(fā)酵產(chǎn)物中的人參皂苷，發(fā)酵反應總離子色譜圖如圖4所示。

由圖4可知，在人參粗提液中共有7種人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd)在WY2作用下，發(fā)酵產(chǎn)物為稀有人參皂苷Rh1、Rg3和compound K。定量分析了人參主皂苷在WY2菌液作用下動態(tài)發(fā)酵過程發(fā)酵產(chǎn)物中人參皂苷的變化趨勢，如圖5所示。

表1 12種人參皂苷的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢測限和定量限

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

圖3 發(fā)酵過程中7種人參主皂苷含量及其轉化產(chǎn)物Rh1隨時間變化曲線

WY2菌液發(fā)酵人參皂苷(0，1，3，5，7，10，20 d)動態(tài)反應中，人參主皂苷濃度—時間曲線如圖5(a)所示，人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量隨著與WY2菌液的發(fā)酵反應時間增長而逐漸減少，發(fā)酵第3天產(chǎn)生稀有人參皂苷Rg3和compound K，其主要由于人參皂苷(Rb1、Rb2、Rc)水解掉C-20位外部糖基轉化為人參皂苷Rd，Rd作為中間代謝產(chǎn)物水解掉C-20位糖基轉化為人參皂苷Rg3，水解掉C-3位糖基轉化為compound K，其轉化途徑為Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3/compound K，所以人參主皂苷Rd含量呈先減少后升高，Rg3和compound K含量隨著發(fā)酵反應時間增長而增加的變化趨勢。同2.3.1人參皂苷Rh1是三醇類皂苷Rg1、Re和Rf的主要轉化產(chǎn)物，隨著發(fā)酵反應進行含量逐漸升高。

煙曲霉WY2屬曲霉菌屬，目前在微生物轉化領域具有一定的應用前景，如馬宗敏等[20]采用黑曲霉對薯蕷科植物黃山藥根莖進行微生物轉化，轉化后得到了4個化合物，左明星等[21]利用煙曲霉GZWMJZ-152將茶粕中的山茶苷代謝，從發(fā)酵提取物中分離得到5個化合物，其曲霉菌屬在發(fā)酵中草藥植物中已具有較高的研究價值。試驗利用洋蟲內(nèi)分離的煙曲霉WY2轉化人參皂苷萃取液新增了3種活性皂苷化合物。

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

圖5 WY2發(fā)酵7種人參主皂苷中發(fā)酵產(chǎn)物皂苷含量隨時間變化曲線

2.2.4 內(nèi)生菌WY1/WY2聯(lián)合發(fā)酵人參皂苷提取液產(chǎn)物分析 利用HPLC-MS/MS定性分析內(nèi)生菌WY1/WY2兩菌按1∶1比例復合發(fā)酵人參皂苷，提取液產(chǎn)物中的人參皂苷，發(fā)酵反應總離子色譜圖如圖6所示。

由圖6可知，人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2在聯(lián)合菌劑作用下代謝轉化的稀有人參皂苷分別為Rh1、Rg3和compound K。WY1/WY2聯(lián)合菌劑發(fā)酵人參皂苷在(0，1，3，5，7，10，20 d)動態(tài)反應中定量分析了兩株菌株聯(lián)合發(fā)酵轉化人參皂苷的反應產(chǎn)物，人參皂苷成分隨時間變化曲線如圖7所示。

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

圖7 WY1/WY2發(fā)酵7種人參主皂苷中發(fā)酵產(chǎn)物中皂苷含量隨時間變化曲線

由圖7(a)可知，人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量隨著發(fā)酵反應時間增長逐漸減少，人參皂苷Rd因在WY1/WY2作用下發(fā)生水解反應，發(fā)酵初期因被水解而呈減少趨勢，但由于二醇類主皂苷(Rb1、Rc和Rb2)在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了人參皂苷Rd，其含量在3 d后開始出現(xiàn)逐漸升高趨勢。三醇類皂苷反應產(chǎn)物稀有人參皂苷Rh1在發(fā)酵第1天開始產(chǎn)生，隨著發(fā)酵反應進行含量逐漸升高，在發(fā)酵第3天產(chǎn)生稀有人參皂苷Rg3和compound K，其含量隨著發(fā)酵反應時間增長而增加，轉化機制同2.3.2所述。

微生物在生長發(fā)酵過程中會產(chǎn)生很多酶，具有強大的代謝能力，可以提高中藥的有效成分含量。WY1/WY2雙菌聯(lián)合發(fā)酵，可改善人參皂苷生物活性，與單一菌株相比可提高稀有人參皂苷Rh1、Rg3和compound K的轉化效率。相關的研究[22]以及生產(chǎn)實踐表明，使用多種菌株進行混合發(fā)酵制備的相關產(chǎn)品，與單一菌種發(fā)酵相比，具有更好的品質與效果，在試驗的兩種菌株作用下人參二醇類皂苷比人參三醇類皂苷更容易被轉化，二醇類主皂苷大部分被轉化為稀有人參皂苷Rg3。

3 結論

篩選出兩株洋蟲體內(nèi)共生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌ChaetomiumglobosumWY1和AspergillusfumigatusWY2及WY1/WY2聯(lián)合菌劑分別與全組分人參皂苷發(fā)酵培養(yǎng)，通過比較WY1/WY2聯(lián)合菌劑轉化制備稀有人參皂苷Rh1、Rg3和compound K較為高效，轉化途徑為Re→Rg1→Rh1；Rf→Rh1；Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3/compound K。為了更好地提高人參皂苷的轉化效率，該研究將繼續(xù)對WY1/ WY2聯(lián)合菌劑的培養(yǎng)條件pH、溫度、培養(yǎng)基等進行優(yōu)化。