彭智祥 李雪 黃斌 吳先昊 趙詩(shī)云

（江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046）

天然產(chǎn)物穿心蓮內(nèi)酯，又名穿心蓮乙素，二萜內(nèi)酯類化合物，為穿心蓮Andrographispaniculata（Burm.f.）Nees 的主要活性成分之一，無(wú)臭，味極苦，易溶于丙酮、甲醇、乙醇，幾乎不溶于水，在穿心蓮葉中含量高達(dá)1.84%[1]。穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物具有廣泛的生物活性，除經(jīng)典抗炎作用外，還具有增強(qiáng)免疫、抗動(dòng)脈硬化、抗病毒、抗腫瘤等作用[2～3]。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯衍生物炎琥寧的藥效成分脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯鉀鈉鹽具有較佳的抗血小板聚集活性[4～6]。本團(tuán)隊(duì)基于脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯結(jié)構(gòu)，在C-17 位引入了活性基團(tuán)，設(shè)計(jì)并合成了一系列親水性較強(qiáng)的新型17-氨基取代-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯衍生物，并測(cè)定其抗血小板聚集活性。化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與材料

1.1 儀器 高分辨質(zhì)譜儀（Agilent 6210）、核磁共振儀（Varian Enity Inova-400 MHz）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph）、數(shù)控磁力攪拌器（Heidolph）、AggRam血小板聚集儀（BJF52001）

1.2 試劑 脫水穿心蓮內(nèi)酯（廣安宏益生物技術(shù)有限公司）、脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯（廣安宏益生物技術(shù)有限公司）、氯吡格雷（成都德斯特生物技術(shù)有限公司）、甲醇、二氯甲烷、氯化鈉、亞硫酸鈉、硫酸鈉、芐胺、氯化銨、4- 氨甲基吡啶、環(huán)己胺、N-甲基芐胺、4-氨基-哌啶、環(huán)丙胺（以上試劑均為市售分析純）。

1.3 動(dòng)物 SD 大鼠，清潔級(jí)，180～220 g，雄性（江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

2 合成路線與方法

2.1 合成路線 以脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19- 二琥珀酸半酯作為起始原料，在弱堿性條件下，以間氯過(guò)氧苯甲酸（m-CPBA）作為環(huán)氧化試劑，制備環(huán)氧化中間體化合物4。將環(huán)氧化中間體化合物4 與氨基取代化合物NHR1R2在Lewis 酸條件下制備化合物5。其中，R1獨(dú)立選自氫、烷基中的一種；R2獨(dú)立選自哌啶基、吡啶基、芐基、環(huán)己烷基或環(huán)丙烷基中的一種?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 合成路線

2.2 化合物4 的制備 在反應(yīng)瓶?jī)?nèi)投入20 g（0.037 6 mol）化合物3、19.455 g m-CPBA、9.474 g碳酸氫鈉（NaHCO3），投料摩爾比1:3:3，再加入60 ml 二氯甲烷，在75 ℃溫度下，磁力攪拌6 h。薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)，待原料反應(yīng)完全后，濃縮除去溶劑，再加入飽和亞硫酸鈉水溶液，繼續(xù)攪拌30 min 左右，用乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯層，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得淡黃色粗品19.695 g，轉(zhuǎn)化率95.6%?；衔? 譜圖數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.16～7.03 (m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13 (s,1H),4.82 (d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,7H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47(d,J=12 Hz,1H),2.34(d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03 (m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55(m,2H),1.55～1.42(m,2H),1.32(dd,J1=2 Hz,J2=12 Hz,1H),1.22～1.08(m,1H),1.01(s,3H),0.87(s,3H)；13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,135.5,129.1,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,60.8,54.8,41.6,38.6,38.2,36.6,29.5,2 9.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS（ESI）：m/z (%)=547.2([M-H]-,100%)；HRMS（ESI）calcd for C28H35O11[M-H]-：547.217 9.found 547.218 7。化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 化合物4 化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.3 8-羥基-17-芐氨基-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯 （5a） 的制備 在反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、7.810 g 芐胺、3.905 g 氯化銨，投料摩爾比1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶劑，在室溫條件下，磁力攪拌24 h。TLC 監(jiān)測(cè)，待原料反應(yīng)完全后，濃縮除去溶劑，再加入飽和氯化鈉水溶液，用二氯甲烷萃取3 次，合并二氯甲烷層，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得淡黃色粗品，再用乙醇結(jié)晶，得白色固體22.316 g，轉(zhuǎn)化率93.3%?；衔?a 譜圖數(shù)據(jù)如下：1H-NMR （400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.33 (dd,J1=2.8 Hz,J2=4.0 Hz,2H),7.26 (d,J=2.8 Hz,1H),7.20 (d,J=4.0 Hz,2H),7.16～7.03(m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13(s,1H),4.82(d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57 (m,1H),4.39～4.17 (m,2H),4.33(s,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,7H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47(d,J=12 Hz,1H),2.34(d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03(m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55(m,2H),1.55～1.42 (m,2H),1.32 (dd,J1=2 Hz,J2=12 Hz,1H),1.22～1.08 (m,1H),1.01 (s,3H),0.87(s,3H)；13C-NMR（100MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,143.3,135.5,129.1,126.9,128.5,126.7,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,60.8,54.8,45.9,41.6,38.6,38.2,36.6,29.5,29.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS（ESI）：m/z（%）=654.3([M-H]-,100%)；HRMS（ESI）calcd for C35H44NO11[M-H]-：654.299 3.found 654.300 7?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 8-羥基-17-芐氨基-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯

2.4 8-羥基-17-（4-哌啶甲基-氨基）-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯（5b）的制備 在反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、7.889 g 4-氨甲基吡啶、3.905 g 氯化銨，投料摩爾比1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶劑，在室溫條件下，磁力攪拌24 h。TLC 監(jiān)測(cè)，待原料反應(yīng)完全后，濃縮除去溶劑，再加入飽和氯化鈉水溶液，用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷層，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得淡黃色粗品，再用乙醇結(jié)晶，得白色固體22.804 0 g，轉(zhuǎn)化率95.2%?；衔?b 譜圖數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（400 MHz, DMSO-d6）：δ=8.45 (d,J=8.0 Hz,2H),7.35(d,J=8.0 Hz,2H),7.16～7.03(m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13(s,1H),4.82(d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),4.40(s,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,7H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47 (d,J=12 Hz,1H),2.34 (d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03 (m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55(m,2H),1.55～1.42(m,2H),1.32(dd,J1=2 Hz,J2=12 Hz,1H),1.22～1.08(m,1H),1.01(s,3H),0.87(s,3H)；13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,149.9,147.8,147.1,135.5,129.1,122.4,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,60.8,54.8,45.8,41.6,38.6,38.2,36.6,29.5,29.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS（ESI）：m/z(%)=655.3([M-H]-,100%)；HRMS（ESI）calcd for C34H43N2O11[M-H]-：655.294 5.found 655.295 2?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖5。

圖5 8-羥基-17-（4-哌啶甲基-氨基）-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯

2.5 8-羥基-17-環(huán)己氨基-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯（5c）的制備 在反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、7.235 g 環(huán)己胺、3.905 g 氯化銨，投料摩爾比為1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶劑，在室溫條件下，磁力攪拌24 h。TLC 監(jiān)測(cè)，待原料反應(yīng)完全后，濃縮除去溶劑，再加入飽和氯化鈉水溶液，用二氯甲烷萃取3 次，合并二氯甲烷層，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得淡黃色粗品，再用乙醇結(jié)晶，得白色固體22.163 g，轉(zhuǎn)化率93.8%?；衔?c 譜圖數(shù)據(jù)如下：1H-NMR （400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.16～7.03 (m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13 (s,1H),4.82 (d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,7H),2.57(t,J=3.6 Hz,1H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.42(d,J=12 Hz,1H),2.34(d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03(m,1H),1.83(dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55(m,2H),1.55～1.42(m,4H),1.39 (dt,J1=3.6 Hz,J2=16 Hz,4H),1.32 (dd,J1=2 Hz,J2=12 Hz,1H),1.22～1.08 (m,1H),1.15 (m,4H),1.01(s,3H),0.87 (s,3H)；13C-NMR （100 MHz, DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,135.5,129.1,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,62.5,61.6,60.8,54.8,41.6,38.6,38.2,36.6,34.0,29.5,29.3,29.1,28.9,25.8,25.2,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS （ESI）：m/z (%)=646.3([M-H]-,100% )；HRMS （ESI）calcd for C34H48NO11[M-H]-：646.330 6.found 646.331 8?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖6。

圖6 8-羥基-17-環(huán)己氨基-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯

2.6 8-羥基-17-（N-甲基-1-芐基）-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯（5d）的制備 在反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、8.839 g N-甲基芐胺、3.905 g 氯化銨，投料摩爾比為1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶劑，在室溫條件下，磁力攪拌24 h。TLC 監(jiān)測(cè)，待原料反應(yīng)完全后，濃縮除去溶劑，再加入飽和氯化鈉水溶液，用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷層，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得淡黃色粗品，再用乙醇結(jié)晶，得白色固體20.423 g，轉(zhuǎn)化率83.6%?；衔?d 譜圖數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.34 (dd,J1=4.0 Hz,J2=2.8 Hz,1H),7.27 (d,J=2.8 Hz,1H),7.24 (d,J=4.0 Hz,1H),7.16～7.03(m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13(s,1H),4.82(d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),3.80(s,2H),3.84(s,2H),3.25(s,3H),2.77～2.56(m,7H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47(d,J=12 Hz,1H),2.34(d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03 (m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55(m,2H),1.55～1.42(m,2H),1.32(dd,J1=2 Hz,J2=12 Hz,1H),1.22～1.08 (m,1H),1.01 (s,3H),0.87(s,3H)；13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,140.2,135.5,129.1,128.5,128.0,127.2,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,60.8,57.1,54.8,41.6,38.6,38.2,36.6,35.8,29.5,29.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS（ESI）：m/z(%)=668.3([M-H]-,100%)；HRMS（ESI）calcd for C36H46NO11[M-H]-：668.314 9.found 668.316 1?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖7。

圖7 8-羥基-17-（N-甲基-1-芐基）-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯

2.7 8-羥基-17-（4-哌啶-氨基）-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯（5e）的制備 在反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、7.307 g 4- 氨基- 哌啶、3.905 g 氯化銨，投料摩爾比為1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶劑，在室溫條件下，磁力攪拌24 h。TLC 監(jiān)測(cè)，待原料反應(yīng)完全后，濃縮除去溶劑，再加入飽和氯化鈉水溶液，用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷層，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得淡黃色粗品，再用乙醇結(jié)晶，得白色固體21.487 g，轉(zhuǎn)化率90.8%?；衔?e 譜圖數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.16～7.03(m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13(s,1H),4.82(d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,12H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47 (d,J=12 Hz,1H),2.34 (d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03 (m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55 (m,6H),1.55～1.42 (m,2H),1.32(dd,J1=2 Hz,J2=12Hz,1H),1.22～1.08(m,1H),1.01(s,3H),0.87(s,3H)；13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,135.5,129.1,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,61.2,60.8,54.8,43.5,41.6,38.6,38.2,36.6,32.6,29.5,29.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS（ESI）：m/z(% )=647.3 ([M-H]-,100% )；HRMS （ESI）calcd for C28H47N2O11[M-H]-：647.325 8.found 647.327 3。化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖8。

圖8 8-羥基-17-（4-哌啶-氨基）-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯

2.8 8-羥基-17-環(huán)丙氨基-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯（5f） 的制備 在反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、4.165 g 環(huán)丙胺、3.905 g 氯化銨，投料摩爾比為1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶劑，在室溫條件下，磁力攪拌24 h。TLC 監(jiān)測(cè)，待原料反應(yīng)完全后，濃縮除去溶劑，再加入飽和氯化鈉水溶液，用二氯甲烷萃取3 次，合并二氯甲烷層，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得淡黃色粗品，再用乙醇結(jié)晶，得白色固體21.209 g，轉(zhuǎn)化率96.0%?；衔?f 譜圖數(shù)據(jù)如下：1H-NMR （400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.16～7.03 (m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13 (s,1H),4.82 (d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,7H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47(d,J=12 Hz,1H),2.34(d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03 (m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55 (m,2H),1.55～1.42 (m,2H),1.32 (m,2H),1.22～1.08(m,1H),1.01(s,3H),0.87(s,3H),0.56(m,4H)；13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,135.5,129.1,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,60.8,54.8,41.6,38.6,38.2,36.6,30.9,29.5,29.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2,8.1 ppm；MS（ESI）：m/z(%)=604.3 ([M-H]-,100% )；HRMS （ESI）calcd for C31H42NO11[M-H]-：604.283 6.found 604.285 0?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖9。

圖9 8-羥基-17-環(huán)丙氨基-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯

3 抗血小板聚集活性測(cè)試

選用健康雄性SD 大鼠，隨機(jī)分組，以氯吡格雷作為對(duì)照組，生理鹽水作為空白對(duì)照組，化合物5a、5b、5c、5d、5e、5f 作為給藥組，連續(xù)7 d 灌胃給藥，第6 天禁食過(guò)夜，第7 天給藥2 h 后用水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血流入含有3.8%枸櫞酸鈉溶液（1：9）的離心管中，以轉(zhuǎn)速1 000 r/min 離心10 min 取上清液既得富血小板血漿（PRP），剩余部分以3 000 r/min 離心10 min，取上清液既得貧血小板血漿（PPP），加入二磷酸腺苷（終濃度為1.5 μmol/L）誘導(dǎo)聚集，在37℃下，測(cè)定5 min 內(nèi)血小板最大聚集率（PAGmax），限2 h 內(nèi)完成，并計(jì)算給藥組血小板聚集的最大抑制率（IR），IR=（正常對(duì)照組PAGmax － 給藥組 PAGmax）/ 正常對(duì)照組PAGmax×100%。見表1。

表1 各組血小板最大聚集率和血小板最大抑制率比較(%)

4 討論

本研究以脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯為起始原料，設(shè)計(jì)合成了一系列親水性較強(qiáng)的新型17-氨基取代-脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯衍生物，并通過(guò)Born 氏比濁法測(cè)試抗血小板聚集活性。該類衍生物的制備方法簡(jiǎn)便易行，成本較低，并具有一定抗血小板聚集作用。合成的部分新型17-氨基取代-脫水穿心蓮內(nèi)酯衍生物抗血小板聚集效果優(yōu)于氯吡格雷，值得進(jìn)一步研究，有望成為新型抗血小板聚集藥物。