劉 將， 周 倉

（1.上海華源安徽錦輝制藥有限公司，安徽阜陽 236018；2.亳州學(xué)院，安徽亳州 236800）

丹參滴注液是中藥丹參單方制劑，具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心、活血消腫、養(yǎng)血安神等功效.研究表明，丹參具有抗動脈粥樣硬化、抑制心肌肥厚、抗心肌缺血、抗心肌纖維化、抗心律失常等作用[1，2].臨床用于治療冠心病、心絞痛、胸中憋悶等疾病.丹參滴注液為丹參藥材經(jīng)純化水提取、乙醇沉淀除雜的方式配制而成，其有效成分主要是丹酚酸B等水溶性酚酸類成分[3].

丹參滴注液提取工藝中，丹參原材料雖然經(jīng)過多次水提醇沉，但是其制劑中仍存在單糖和低聚糖，該糖類成分直接影響注射液的滲透壓、固含量等參數(shù)[4，5].而且丹參原材料在煎煮過程中，丹酚酸B分解轉(zhuǎn)化成了丹參素以及其它酚酸類成分[3]，成品制劑中丹酚酸B的含量相對較低.在現(xiàn)行丹參滴注液質(zhì)量和工藝要求中，其質(zhì)量控制主要是控制丹參素鈉、原兒茶醛等成分[6]，但是對于丹參滴注液中存在的果糖、丹酚酸B并未做相關(guān)要求.糖類成分的檢測目前有多種方法，比較常用的有旋光法、電泳法等，雖然獲得了較滿意的效果[7，8]，但是此類方法對糖類的分離檢測效果的專屬性不是很好，共存物質(zhì)會對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾.

因此建立一種適用于丹參滴注液中果糖、丹酚酸B的檢測方法，對該產(chǎn)品工藝的持續(xù)性、穩(wěn)定性、質(zhì)量可控性均有著積極的意義.為了提高檢測的專屬性和靈敏度，本項目采用HPLC-RID和HPLC-UV分別對丹參滴注液中果糖、丹酚酸B含量檢測進行試驗性探析，根據(jù)試驗情況和制劑特點建立適用性較好的檢測方法.

1 儀器與試劑

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀，安捷倫VWD紫外-可見檢測器，RI230型依利特示差折光檢測器.

1.2 樣品及試劑

果糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100231-201807，純度99.6%）、丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111562-201716，純度94.1%）、乙腈（色譜純，國藥），冰醋酸（色譜純，國藥），三乙胺（分析純，國藥）.

丹參滴注液（上海華源安徽錦輝制藥有限公司，批號：18120501、18120502、18120503）.

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-RID法檢測丹參滴注液果糖含量

2.1.1 色譜條件

圖1 果糖定性HPLC圖 [A：果糖對照品；B丹參滴注液]

圖2 葡萄糖定性HPLC圖 [A：葡萄糖對照品；B丹參滴注液]

經(jīng)過前期試驗探索，在保證分離度等試驗要求下，最終確定以下色譜條件：

色譜柱：Phecda-NH2氨基柱（250×4.6 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司）.示差折光檢測器：通用型（RID）.柱溫：30 ℃.流速：1.0 mL/min.進樣量：20 μL.流動相：乙腈：水：三乙胺 =75：25：0.5.

在上述條件下，圖譜前期的試劑峰與主峰分離度較好，與果糖峰相鄰的葡萄糖峰（相同色譜條件下葡萄糖定性HPLC圖見圖2）分離也較好.為了確保定量分析的準(zhǔn)確，要求果糖理論塔板數(shù)不得低于3 000.果糖定性HPLC圖見圖1.

2.1.2 果糖對照品溶液精密度試驗

精密稱取果糖對照品200.74 mg，加入到10 mL容量瓶中，取該溶液5 mL移至10 mL容量瓶中，定容后平行進樣6針，根據(jù)峰面積計算精密度，RSD為0.83%，試驗精密度較好，符合試驗相關(guān)要求規(guī)定.

2.1.3 果糖對照品溶液穩(wěn)定性試驗

將上述對照品溶液每2 h進樣一次，平行6次，根據(jù)圖譜計算RSD為0.69%，在10 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好，符合試驗要求規(guī)定.

2.1.4 果糖對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

果糖標(biāo)準(zhǔn)品逐級稀釋法分別配成6個梯度對照品溶液，各濃度對照品溶液分別進樣20 μL，每個濃度進樣2次，分別測定含量，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得果糖回歸方程：Y=203.98X-9.8267（R2=0.9999）. 果糖濃度在 0.6273～20.0740 mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系.

2.1.5 果糖對照品溶液靈敏度試驗

精密量取標(biāo)準(zhǔn)曲線中0.6273（mg/mL）對照品溶液，稀釋10倍，作為靈敏度檢測用溶液.試驗結(jié)果表明，果糖濃度與檢測信號的比值約為5，當(dāng)果糖進樣量為10 μg時（20 μL），對應(yīng)出現(xiàn)色譜峰面積約為 2.7，峰型及分離較好，表明該檢測條件對于果糖微量檢測時靈敏度較低且檢測下限較小.

2.1.6 供試品溶液穩(wěn)定性試驗

取制劑供試品溶液，分別于 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h各進樣一次，根據(jù)圖譜顯示計算供試品溶液中果糖RSD為0.55%，符合試驗要求.結(jié)果表明，在試驗室條件下，供試液中果糖在10 h內(nèi)未發(fā)生降解和衍生情況，基本穩(wěn)定.

2.1.7 供試品溶液回收率試驗

取供試品溶液（批號：18120501）5 mL，共平行6份，加入10 mL容量瓶中，再分別加入果糖對照品溶液（8.021 mg/mL）1.5、1.5、2.0、2.0、2.5、2.5mL，定容，搖勻并進樣檢測，得果糖平均回收率為100.15%，RSD為0.77%，符合要求，結(jié)果見表1.

2.1.8 丹參滴注液果糖含量測定

依據(jù)上述檢測方法對3批丹參滴注液制劑（250 mL/瓶）中的果糖含量進行檢測.三批18120501、18120502、18120503丹參滴注液中的果糖檢測結(jié)果分別為633.68、643.50、640.75 mg/瓶，平均含量為 639.31 mg/瓶.

2.2 HPLC-UV法對丹參滴注液制劑丹酚酸B含量進行檢測

2.2.1 色譜條件

經(jīng)過前期試驗探索，在保證分離度等試驗要求下，最終確定以下色譜條件：

色譜柱：安捷倫 C18（250×4.6 mm，5 μm）.檢測波長：281 nm.柱溫：30 ℃.流速：1.0 mL/min.流動相：乙腈-0.5%冰醋酸（28：72）為流動相.理論塔板數(shù)大于5 000.

在上述色譜試驗條件下丹酚酸B分離度及峰型較好，能夠?qū)⒅苿┲械し铀酈同其他成分進行較好分離.丹酚酸B定性HPLC圖見圖3.

表1 供試品溶液回收率試驗

圖3 丹酚酸B定性HPLC圖（A：丹酚酸B對照品，B：丹參滴注液）

2.2.2 丹酚酸B對照品溶液精密度試驗

精密稱取丹酚酸B對照品10.80 mg，用50%甲醇定容至25 mL容量瓶中.連續(xù)平行進樣6次，根據(jù)圖譜計算峰面積RSD為0.21%，結(jié)果表明試驗精密度較好.

2.2.3 丹酚酸B對照品溶液穩(wěn)定性試驗

取上述丹酚酸B對照品溶液，隔2 h測一次，共6次，6次檢測結(jié)果幾乎無明顯變化（RSD為0.37%），表明對照品丹酚酸B溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.2.4 丹酚酸B對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

將上述丹酚酸B對照品溶液（43.2 μg/mL），用50%甲醇分別稀釋至 21.6 μg/mL、10.08 μg/mL、5.4 μg/mL、2.7 μg/mL的溶液，每個濃度進樣2次，分別測定含量，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=10.62X+0.5042（R2=1.0000），丹酚酸B濃度在2.7～43.2 μg/mL之間呈良好的線性關(guān)系.

2.2.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗

取丹參滴注液制劑（批號：18120501），制備供試品溶液，分別于 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 各進樣一次，計算得RSD為2.34%，說明室溫條件下10 h內(nèi)丹參滴注液中丹酚酸B是穩(wěn)定的，符合實驗要求.

2.2.6 供試品溶液回收率試驗

精密量取已測定含量的制劑（批號：18120501）共6份，精密量取各5 mL，置10 mL容量瓶中，分別加入丹酚酸 B 對照品（43.2 μg/mL） 溶液 1.2、1.2、1.5、1.5、1.8、1.8 mL，再分別加甲醇定容至刻度，搖勻，依法測定.得果糖平均回收率為100.3%，RSD為1.51%，符合要求，結(jié)果見表2.

表2 供試品溶液回收率試驗

2.2.7 丹參滴注液制劑中丹酚酸B含量測定

依據(jù)上述方法對 18120501、18120502、18120503 批次丹參滴注液制劑進行檢測.三批制劑丹酚酸B含量分別為 3.21 mg/瓶、3.29 mg/瓶、3.07 mg/瓶.

3 討論

上述試驗采用HPLC-RID法檢測丹參滴注液中果糖含量的方法（色譜條件：色譜柱Phecda-NH2氨基柱，示差檢測器，30℃柱溫，1.0 mL/min流速，20 mL進樣量，流動相為乙腈：水：三乙胺 =75：25：0.5）和 HPLC-UV 法檢測丹參滴注液中丹酚酸B含量的方法（色譜條件：安捷倫C18柱，紫外檢測器波長281 nm，30℃柱溫，1.0 mL/min流速，20 mL進樣量，流動相為乙腈：5%冰醋酸=28：72），優(yōu)化了丹參滴注液制劑中所含果糖成分、丹酚酸B成分的檢測方法，能夠進行快速、準(zhǔn)確的檢測，該兩種方法相較于旋光法、電泳法、HPLC-ELSD法專屬性更強、靈敏度更高、適用性好，且過程基本控制在10min左右，達到了快速檢測的效果，基本能夠滿足對丹參滴注液果糖、丹酚酸B的中間體和成品檢測要求，能有效提高丹參滴注液的質(zhì)量控制水平，進一步保障藥品臨床使用的有效性、安全性.