郭曉平 劉興飛 李曉楠 呂雪茹 郤少梅 田園

（山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）生命科學學院，泰安 271016）

近年來，化學農(nóng)藥的濫用對人類生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了惡劣的影響，還導(dǎo)致了病蟲害抗性等問題［1］。生物農(nóng)藥具有選擇性強、藥效高、對環(huán)境較友好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，這些特性不僅滿足當代人的需求，更滿足可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略目標，所以，發(fā)展生物農(nóng)藥具有十分廣闊的前景，生物農(nóng)藥必將成為最具發(fā)展?jié)摿Φ霓r(nóng)藥品種［2-3］。研發(fā)生物農(nóng)藥有多種途徑，其中，分離篩選具有防病、殺蟲等生防作用的微生物成為一個新興的研究熱點［4-5］。植物內(nèi)生菌廣泛存在于健康植物體內(nèi)，在與植物長期進化過程中，形成了獨特的生理和代謝機制，可以提高植物抗逆能力；同時還能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，具有促生、固氮、防治病蟲害等多種特性；是尚未被完全開發(fā)的微生物資源［6-7］。因此，從植物內(nèi)生菌中挖掘生防菌具有廣闊前景，且對保護和開發(fā)稀有植物資源有著重要的現(xiàn)實意義。

泰山黃精（Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute）是泰山四大名藥之一，屬百合科多年生草本植物［8］。黃精是中國傳統(tǒng)的藥食同源的植物資源，現(xiàn)代化學成分研究證明，黃精中含有多糖、皂苷、黃酮、揮發(fā)油等多種化學成分，其中黃精多糖是黃精化學組成的一個重要部分，是黃精的主要生物活性成分之一［9］；此外還含有多種人體所需的氨基酸和維生素等。藥理學研究證明，黃精多糖具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、防動脈硬化、抗病毒、抗菌、抗炎、提高機體免疫力、提高和改善記憶等多種藥理作用［10］，具有良好的開發(fā)利用價值。近年來關(guān)于泰山黃精內(nèi)生菌的報道，僅見于對其內(nèi)生真菌的研究［11-12］，而未見對其內(nèi)生細菌的研究。因此，本研究將對泰山黃精內(nèi)生細菌進行分離，以期篩選出對植物病原菌有較強拮抗活性的生防菌，為泰山黃精內(nèi)生細菌的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，同時也為拓展泰山野生黃精資源的保護和利用途徑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：泰山黃精（Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute）健康植株采自山東省泰山自然保護區(qū)海拔800 m處。

供試病原菌：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、層生鐮刀菌（Fusarium solani）、白絹病菌（Sclerotium rolfsii），禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），由山東農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室惠贈。

供試培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基［13］（內(nèi)生細菌用培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.2。PDA培養(yǎng)基（植物病原真菌用培養(yǎng)基）：瓊脂條20 g，葡萄糖20 g，土豆200 g，水1 000 mL，自然pH。綠豆湯培養(yǎng)基（制備真菌孢子用培養(yǎng)基）：將20 g綠豆清洗干凈，置于1 000 mL蒸餾水中加熱煮沸，至綠豆裂開，三層紗布過濾去除豆粒即得。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離純化 采用組織塊培養(yǎng)法對黃精內(nèi)生細菌進行分離與純化［13］：新鮮的黃精根莖，先用自來水將表面的泥沙雜質(zhì)沖洗干凈，然后用5%（V/V）次氯酸鈉溶液處理5 min，無菌水漂洗4次后用無菌濾紙吸去殘留無菌水；再用75%乙醇溶液處理5 min，用無菌水漂洗4次后吸去殘留無菌水并干燥；最后將根莖切成直徑3 mm小塊，接種到固體LB培養(yǎng)基上。于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3 d，將組織塊周圍生長的細菌菌斑用接種環(huán)挑取到LB培養(yǎng)基上，采用四區(qū)劃線法反復(fù)純化直至獲得純凈菌株。

1.2.2 內(nèi)生菌的篩選 參照穆靜娟等［14］的方法對內(nèi)生菌進行篩選。

初篩：采用平板對峙法，將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的真菌病原菌，用打孔器打孔獲得直徑5 mm的病原菌餅，用無菌鑷子將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基正中央，同時用接種環(huán)挑取分離得到的內(nèi)生細菌單菌落均勻接種于真菌菌餅四周，距離菌餅外緣2 cm處，以只接種病原菌菌餅，不接種內(nèi)生細菌的平板作為空白對照（CK），置于28℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察抑菌情況。

復(fù)篩：將初篩中抑菌效果最好的內(nèi)生菌，均勻地分4點接種在病原真菌菌病四周，每個處理重復(fù)3次，以不接拮抗菌為空白對照，置于28℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，計算抑菌率。抑菌率=（對照組菌落直徑平均值-處理組抑菌菌落直徑平均值）/對照組菌落直徑平均值×100%。

1.2.3 菌株鑒定 形態(tài)學鑒定：將篩選出的抑菌活性最強的菌株于LB平板上四區(qū)劃線接種，置于37℃培養(yǎng)1 d后，觀察菌落形態(tài)；并進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)。

生理生化鑒定：參照文獻［15-16］對菌株進行生理生化鑒定。

分子生物學鑒定：利用16S rDNA測序?qū)赀M行分子學鑒定。將LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的細菌菌液直接交給睿博興科（青島）測序部進行PCR及測序。將測定的16S rDNA序列與GenBank中已知核酸序列進行BLSAT分析，從中獲得與菌株同源的序列，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌的抑制作用 參照穆靜娟等［14］的方法，將活性菌株按1%接種量接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃200 r/min培養(yǎng)24 h，然后12 000 r/min離心去掉上清液，吸取50 μL濃縮菌液用涂布棒涂布于LB固體平板上，晾干菌液。打孔獲得5 mm植物病原真菌菌餅，并分別接種到PDA培養(yǎng)基中央，然后將上述涂過濃縮菌液的LB平板與接有病原真菌的PDA平板倒扣起來，接有內(nèi)生細菌的一面朝上，兩個平板用封口膜密封，此為處理組；同時，以只接病原真菌，不接拮抗菌為對照組。每組重復(fù)3次，置于28℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4 d觀察結(jié)果，測量真菌生長直徑，計算抑菌率（計算方法見1.2.2）。

1.2.5 發(fā)酵液對病原菌的抑制作用 取植物病原菌菌餅接種于100 mL綠豆培養(yǎng)基中，28℃ 150 r/min培養(yǎng)5 d。雙層無菌紗布過濾除去菌絲，用血球計數(shù)板進行孢子計數(shù)，并用無菌水調(diào)整孢子濃度為105個/mL。將調(diào)整好濃度的孢子液放置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將活性菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h取1 mL菌液暫存于4℃冰箱，連續(xù)取樣4 d。然后將4次收集的菌液12 000 r/min離心5 min，上清以無菌濾膜過濾徹底除菌。取1 mL真菌孢子懸液與融化的PDA混合倒平板，并用打孔器在平板上打5個孔，分別加入4次的無菌上清液，并以LB培養(yǎng)基作空白對照。培養(yǎng)4 d觀察抑菌情況，確定抑菌物質(zhì)產(chǎn)生時間。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 黃精內(nèi)生細菌的分離純化

利用組織塊分離法對黃精內(nèi)生細菌分離，并通過多次純化，共獲得12株黃精內(nèi)生細菌命名為HJ-1-HJ-12，其中HJ-12的抑菌活性最好，用于后續(xù)研究。

2.2 內(nèi)生拮抗菌HJ-12的抑菌率

如圖1所示，菌株HJ-12對白絹病菌、串珠鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、層生鐮刀菌6種植物病原菌均有不同程度的抑制作用。

從表1可見，株HJ-12對不同病原菌抑制程度不同，抑菌率為（18.57±0.25）%-（48.33±0.15）%。對立枯病菌抑制活性最強，抑菌率為（48.33±0.15）%，對白絹病菌抑制活性最弱，為（18.57±0.25）%。

圖1 菌株HJ-12對不同病原真菌抑菌譜

表1 菌株HJ-12對6種植物病原真菌的抑菌率

2.3 內(nèi)生菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學鑒定 菌株HJ-12在LB 平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)初期可觀察到菌落光滑、飽滿、乳白色；培養(yǎng)后期表面粗糙，有曲折的溝槽樣外觀。顯微鏡下觀察到該菌株為革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀、單生、有芽孢、無莢膜（圖2）。

圖2 HJ-12菌株油鏡下的形態(tài)（100×10）

2.3.2 生理生化鑒定 HJ-12菌株為嚴格好氧菌株，VP實驗陰性，接觸酶陽性，可發(fā)酵葡萄糖、甘露醇，不能利用木糖、阿拉伯糖，能水解酪素、明膠、不能水解淀粉，能利用檸檬酸鹽，不能利用丙酸鹽，不產(chǎn)生吲哚和硫化氫，硝酸鹽還原實驗陽性。其生理生化特性與短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）的特征吻合［15］。

2.3.3 分子生物學鑒定 為進一步確定菌株的分類學地位，測定其16S rDNA 基因序列，擴增目的基因序列長度為1 415 bp，GenBank號為MN883861。將該序列進行BLAST比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與Brevibacillus brevis同源性最高，相似度為99.72%。選出相關(guān)性較高的屬內(nèi)相關(guān)菌株的序列，用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），HJ-12與Brevibacillus brevis DYJL44和Brevibacillus brevis GZDF3處于同一分支，結(jié)合菌落菌體形態(tài)及生理生化特征，將該菌株鑒定為Brevibacillus brevis HJ-12。

圖3 根據(jù)HJ-12菌株16s rDNA同源序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 揮發(fā)性物質(zhì)抑菌效果

由圖4可以看出HJ-12產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)同樣具有廣譜抑菌活性，且比細菌菌體對于病原真菌具有更加明顯的抑菌效果。

由表2可知，HJ-12產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌率為（21.05±0.17）%-（83.53±0.19）%，對白絹病菌抑制效果最好為（83.53±0.19）%，對尖孢鐮刀菌抑制效果最低為（21.05±0.17）%。

2.5 發(fā)酵液抑菌活性及抑菌物質(zhì)產(chǎn)生時間

由圖5可以看出HJ-12產(chǎn)生的發(fā)酵液上清同樣具有抑菌活性。在培養(yǎng)時間上，培養(yǎng)1 d的發(fā)酵液上清尚未產(chǎn)生抑菌效果，2 d以后，發(fā)酵液無細胞上清具有明顯抑菌圈，說明抑菌物質(zhì)需要在培養(yǎng)2 d后才開始產(chǎn)生。

圖4 HJ-12產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌譜

表2 HJ-12產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對6種植物病原菌的抑菌率

3 討論

圖5 HJ-12發(fā)酵液活性

隨著植物病害對已有農(nóng)藥的耐藥性加劇及新的病害的不斷出現(xiàn)，對新型生物源農(nóng)藥的開發(fā)也越來越迫切。其中，利用生防菌防治植物病害在國內(nèi)外已有較多的研究［17］；在眾多生防菌來源中，植物內(nèi)生菌對各種作物病害具有很好的防治效果［18］。本研究從泰山黃精中分離得到一株內(nèi)生細菌HJ-12，對尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、層生鐮刀菌、白絹病菌、禾谷鐮刀菌、立枯絲核菌均具有不同程度的拮抗作用，這是首次關(guān)于泰山黃精內(nèi)生細菌拮抗植物病原真菌的報道。其他地區(qū)黃精內(nèi)生細菌也有類似的研究，遲惠榮等［19］獲得一株多花黃精內(nèi)生貝萊斯芽胞桿菌，該菌株對尖孢鐮刀菌拮抗作用明顯，但并未研究該菌株對其他植物病原真菌的抑制活性。柏曉輝等［13］獲得一株黃山黃精內(nèi)生細菌，對綠膿桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和蘇云金芽孢桿菌3種細菌有良好的抑菌活性。以上結(jié)果表明，黃精中普遍存在芽孢桿菌屬內(nèi)生菌，且該屬菌株產(chǎn)生的代謝物具有抑菌作用。

本研究獲得的菌株HJ-12，經(jīng)形態(tài)學、生理生化反應(yīng)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，鑒定為短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）。短短芽孢桿菌廣泛分布于根際土壤及植物微生態(tài)系統(tǒng)中，王玉婷等［20］報道過一株對番茄早疫病菌菌絲和孢子均有致畸作用的內(nèi)生短短芽孢桿菌011；祝學海等［21］從根際土壤中獲得了3株對半夏塊莖腐爛病致病菌有拮抗活性的細菌，經(jīng)鑒定全部為短短芽孢桿菌；楊從軍［22］獲得的內(nèi)生短短芽孢桿菌W4對番茄灰霉病菌具有良好的抑制活性，其優(yōu)化后的發(fā)酵液稀釋25倍后對病原菌的抑制率可達92.8%。以上結(jié)果說明短短芽孢桿菌是一類理想的生防菌。

菌株Brevibacillus brevis HJ-12產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)與菌體相比具有更好的廣譜抑菌效果。利用揮發(fā)性物質(zhì)對抗植物病原菌是芽孢桿菌發(fā)揮拮抗作用的重要機制［23］，與非揮發(fā)性抗菌物質(zhì)相比，揮發(fā)性抗菌物質(zhì)更易于在土壤或空氣中滲透和擴散，能更有效地殺滅病原菌。另外，研究發(fā)現(xiàn)HJ-12的無細胞發(fā)酵液上清液具有抑菌活性，說明該菌的抑菌機制可能是幾種作用的結(jié)合。本研究所分離篩選的內(nèi)生細菌是在體外條件下對病原菌進行的拮抗實驗，其在活體上生防效果還需進一步研究驗證。

4 結(jié)論

本研究從健康黃精根莖中分離得到1株對尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、層生鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、白絹病菌、立枯絲核菌均具有不同程度拮抗作用的內(nèi)生菌株HJ-12，根據(jù)菌體特征、生理生化特征及16SrDNA序列分析將其命名為Brevibacillus brevis HJ-12。HJ-12菌株所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)以及無菌上清液對于各種病原菌也存在廣譜的抑制作用，且發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生時間為液體培養(yǎng)2 d后。