陳林 潘貞志 戴毅 宋麗

（1.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

流式細(xì)胞術(shù)是應(yīng)用流式細(xì)胞儀對處于液流中的單個細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速分析定量及分選的方法。隨著熒光分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞檢測廣泛的應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域：如通過流式細(xì)胞術(shù)來分析細(xì)胞的各種代謝特征，判斷細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死［1-2］，評估細(xì)胞的分化和增殖特性［3］，以及DNA含量分析、細(xì)胞群比例的測定和分選［4］。流式細(xì)胞檢測在植物學(xué)研究中的應(yīng)用主要有以下幾個方面：（1）植物細(xì)胞核分析，如：測定DNA的含量［5］、進(jìn)行植物遺傳倍性分析［6］、細(xì)胞周期分析、測定基因組大?。?-8］；（2）染色體分析及分選和構(gòu)建染色體文庫［9-10］；（3）原生質(zhì)體和細(xì)胞融合產(chǎn)物分析及分選［11］；（4）應(yīng)用在系統(tǒng)生物學(xué)和生態(tài)學(xué)上［12］。

然而，與動物細(xì)胞或醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域不同，植物細(xì)胞具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，細(xì)胞成分如多酚等大量富集，難以分離得到用于流式檢測的單細(xì)胞懸液。因此，為了對植物材料中核DNA進(jìn)行定性及定量分析，目前主要采取兩種策略［13］：一種策略是酶解去除植物細(xì)胞的細(xì)胞壁從而收獲原生質(zhì)體，原生質(zhì)體在低滲溶液中吸水破裂進(jìn)一步分離細(xì)胞核；另一策略是在合適的緩沖液中，通過物理機(jī)械切割植物材料使植物細(xì)胞破裂，從而使細(xì)胞核釋放到緩沖液中。Galbraith等［14］最早提出建立機(jī)械切割的方法并通過Galbraith’s核解離液成功測定了數(shù)種植物的DNA含量和細(xì)胞周期。Lee 等［15］改良MgSO4緩沖液成分并使核提取液通過一個棉柱，去除多酚類和細(xì)胞碎片，可從蘭花中可分離出完整的細(xì)胞核用于流式檢測；Loureiro等［16］采用GPB和WPB緩沖液制備了37種不同葉組織結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的草本和木本植物標(biāo)本，采用流式細(xì)胞儀分析其細(xì)胞核DNA含量；李思璐［17］通過流式細(xì)胞檢測MgSO4緩沖液制備的核懸浮液，研究不同逆境脅迫下玉米不同組織器官在各個發(fā)育時期內(nèi)核復(fù)制的發(fā)生規(guī)律；張琳琳等［18］分別在Otto和LB01緩沖液中解離出細(xì)胞核并利用流式細(xì)胞術(shù)首次測定藥用植物黃芩的基因組大?。粍ⅧP霞等［19］從5種緩沖液中篩選出適合通過機(jī)械切割制備完整的梨葉片的細(xì)胞核懸浮液的核解離液。

大豆是我國重要的糧油作物，然而近年來干旱或洪澇災(zāi)害發(fā)生頻繁，嚴(yán)重影響了其生產(chǎn)發(fā)展。大豆根系發(fā)育愈好，受水分脅迫危害的程度就愈小，抗逆性越強(qiáng)。因此，深入挖掘逆境下大豆根系發(fā)育的調(diào)控機(jī)理，對減輕干旱或澇漬威脅、保障大豆安全生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義［20］。植物根系的生長發(fā)育離不開細(xì)胞的分裂和分化，無論是根原基的起始與分裂，還是分生組織的形成和活化，都涉及到細(xì)胞周期中的細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長兩個交替循環(huán)的過程［21-22］。此外，植物中一些細(xì)胞由于發(fā)育和/或環(huán)境因素的影響會在S期后跳過G2和M期直接回到G1期，再次起始DNA復(fù)制，如此循環(huán)導(dǎo)致形成多倍體的細(xì)胞［23-24］。因此研究細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)理不僅可以闡明植物生長發(fā)育的分子機(jī)制，也有利于闡明脅迫對作物生長影響的機(jī)制。

本研究在參考流式細(xì)胞術(shù)在其它植物物種檢測DNA含量的研究基礎(chǔ)上，尋找適合不同大豆品種的葉片及根組織的細(xì)胞核解離液及完善植物流式細(xì)胞分析方法及細(xì)胞核的制備方法，并利用該技術(shù)對PEG模擬的干旱脅迫下大豆根尖中細(xì)胞周期的調(diào)控進(jìn)行了分析，為今后使用流式細(xì)胞儀對測定大豆DNA的含量、細(xì)胞比例和遺傳倍性、細(xì)胞周期的調(diào)控研究提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為大豆品種包括William 82、Holladay、PI 567611、PI 567651、Fiskeby III，由揚(yáng)州大學(xué)大豆遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 植物細(xì)胞核解離液配制 本實(shí)驗(yàn)所用6種核解離液配方見表1。

1.2.2 PEG 6000模擬干旱處理 大豆種子經(jīng)吸水膨脹后種植在土壤中，萌發(fā)生長6 d，選擇生長狀態(tài)一致的豆苗，避免損傷大豆根系的前提下洗凈塵土，根系分別浸沒在濃度分別為0%和20% PEG 6000溶液中脅迫7 d后，將根系殘余的PEG 6000洗滌干凈，取2 cm左右的幼嫩根尖用于細(xì)胞核懸浮液制備。

1.2.3 細(xì)胞核懸浮液制備 取新鮮幼嫩的大豆葉片或根組織，蒸餾水洗凈表面塵土并用濾紙吸干殘余水分。培養(yǎng)皿置冰上預(yù)冷，加入5 mL預(yù)冷細(xì)胞核解離液，將植物材料浸沒在解離液中，用鋒利的刀片一次性快速切割植物材料。輕微的吹吸核解離液，但避免產(chǎn)生氣泡，以減少釋放的細(xì)胞核粘連在植物組織上，細(xì)胞核解離液經(jīng)400目細(xì)胞濾器過濾，濾液放置于4℃或者冰上孵育5 min。濾液于4℃、1 000 r/min離心1 min，小心移去上清，沉淀經(jīng)適量體積的新鮮的細(xì)胞核解離液重懸，經(jīng)終濃度為4 μg/mL的DAPI染色10 min至60 min。

表1 核解離緩沖液配方

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析 取制備好的細(xì)胞核懸浮液500 μL，用FACS LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀（BD公司，美國）在低流速條件下檢測，至少吸取10 000 個經(jīng)DAPI染色的顆粒。用Modfit 5.0軟件分析結(jié)果，分別畫出吸收的顆粒數(shù)（count）和熒光強(qiáng)度（Fluorescence intensity，F(xiàn)L）關(guān)系圖，所有樣品運(yùn)行參數(shù)設(shè)置一致，測定參數(shù)主要有相對熒光強(qiáng)度、變異系數(shù)（Coefficient variation，CV）、碎片背景（Debris background factor，DF）。

2 結(jié)果

2.1 不同核解離液對細(xì)胞核解離的影響

本研究共采用6種不同核解離液分離大豆葉片細(xì)胞的細(xì)胞核。經(jīng)流式檢測分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)散射光檢測信號，Galbraith’s核解離液（圖1-A）、LB01核解離液（圖1-B）、和mG核解離液（圖1-C）可獲得清晰的2團(tuán)細(xì)胞器顆粒信號聚集區(qū)域，而Tris·MgCl2核解離液（圖1-D）、GPB核解離液（圖1-E）和WPB（圖1-F）核解離液中僅有一團(tuán)細(xì)胞顆粒信號富集區(qū)域。通過對比大豆根中細(xì)胞核散射光信號，確認(rèn)黑色框選中區(qū)域的信號對應(yīng)為細(xì)胞核的散射光信號，推測在黑色框以外區(qū)域的信號富集可能為葉綠體細(xì)胞器。

2.2 不同解離液對DNA相對含量的影響

為了進(jìn)一步確定適合大豆幼嫩葉片細(xì)胞核提取的核解離液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Modfit5.0軟件，以熒光面積信號為橫軸，以細(xì)胞核顆粒數(shù)為縱軸，根據(jù)所選定的信號區(qū)域顯示統(tǒng)計(jì)結(jié)果。通過DNA相對含量直方圖（圖2）可以得出：在Galbraith’s核解離液（圖2-A）、mG核解離液（圖2-B）和LB01核解離液（圖2-C）提取的細(xì)胞核懸浮液在G0/G1期均形成了呈正態(tài)分布的DNA峰，并且其變異系數(shù)CV均小于5%，分別是2.78%、4.24%和2.96%。但是Galbraith’s核解離液和mG核解離液中多倍體檢測到的量較少，在G2/M期未形成較明顯的峰，這有可能對DNA倍性和細(xì)胞周期以及有絲分裂各時期細(xì)胞數(shù)量的分析造成一定的誤差。LB01核解離液可檢測到顯著的G2/M期峰，雖然LB01解離液所形成的碎片較Galbraith's核解離液和mG核解離液多，但是在檢測細(xì)胞周期及遺傳倍性中相對更好。相反，GPB核解離液（圖2-E）和WPB核解離液（圖2-F）中DNA峰較差，碎片很多，其變異系數(shù)較大。Tris·MgCl2核解離液（圖2-D）可以形成呈正態(tài)分布的DNA峰，但DNA峰與另外由5種核解離液所得的DNA峰在熒光強(qiáng)度上，明顯相對減小且偏移較大，表明Tris·MgCl2核解離液可能對核內(nèi)染色質(zhì)的分布造成了影響。

進(jìn)一步利用Galbraith’s核解離液（圖3-A）和LB01 核解離液（圖3-B）對大豆根中的細(xì)胞核進(jìn)行了解離，研究結(jié)果表明兩種核解離液均在G0/G1期和G2/M 期均形成了呈正態(tài)分布的DNA峰。綜上所述，Galbraith’s和 LB01 核解離液適用于大豆葉和根中細(xì)胞核的解離。

圖1 不同核解離液處理獲得的大豆嫩葉組織細(xì)胞核散射光特征

2.3 不同核解離液對細(xì)胞核提取效率的比較

用Galbraith’s和LB01兩種不同核解離液提取的懸浮液細(xì)胞核形態(tài)觀察結(jié)果見圖3。結(jié)果表明這兩種核解離液不但可獲得較多的單個細(xì)胞核，而且細(xì)胞核呈飽滿的圓形或者橢圓形懸浮在核解離液中，較好辨認(rèn)。因此這兩種核解離液能較好保證完整的細(xì)胞核從細(xì)胞中釋放出來，同時可以減少細(xì)胞中的次生代謝物的游離，盡管也有少量的幾個單顆粒細(xì)胞核黏在一起或者與其他雜質(zhì)黏在一起的情況發(fā)生。

對比6種核解離液產(chǎn)生的細(xì)胞碎片發(fā)現(xiàn)，WPB和GPB核解離液中碎片較多，其中GPB核解離液不能分離出完整的細(xì)胞核，且細(xì)胞核的形態(tài)不完整，導(dǎo)致熒光信號不能聚集。因此這兩種核解離液不適合分離大豆細(xì)胞核。其中Tris·MgCl2核解離液中葉綠體的污染較少，但是細(xì)胞碎片較多。WPB、GPB以及Tris·MgCl2核解離液流速較慢，單位時間內(nèi)顆粒數(shù)較少，也表明這3種核解離液不能高效的分離細(xì)胞核。

2.4 LB01核解離液在不同大豆品種上的適用性及應(yīng)用性

為驗(yàn)證LB01解離液是否具有廣適性，首先分別取大豆不同品種Holladay、PI 567611、PI 567651、FiskebyIII新鮮幼嫩的根尖，在LB01核解離液中機(jī)械切割釋放出細(xì)胞核，通過流式細(xì)胞儀檢測其DNA含量并分析遺傳倍性，結(jié)果如圖4所示。細(xì)胞核懸浮液在G0/G1期和G2/M期均形成了呈正態(tài)分布的DNA峰，并且其變異系數(shù)CV均小于5%。因此，LB01核解離液在其他大豆品種上亦具有良好的適用性。盡管不同大豆品種的細(xì)胞核的散射光特征上存在微小差異，可能是由于細(xì)胞核在顆粒大小及復(fù)雜程度上存在細(xì)微差異。

為進(jìn)一步分析LB01解離液和流式細(xì)胞儀在大豆細(xì)胞周期檢測上的應(yīng)用，我們同時檢測了PEG6000模擬干旱處理對不同大豆品種根尖的細(xì)胞周期的調(diào)控。結(jié)果（圖4）表明20% PEG6000處理使G2/M細(xì)胞比例相對增多，顯著促進(jìn)核內(nèi)復(fù)制。同時我們發(fā)現(xiàn)不同品種大豆對相同濃度PEG脅迫響應(yīng)程度不同，例如PI 567651根尖的G2/M期細(xì)胞比例未處理為16.17%，處理后為63.22%，說明細(xì)胞周期被顯著阻滯（圖4-E-F）；但是PI 567611中根尖的G2/M期細(xì)胞比例未處理為24.36%，處理后的29.24%，雖然細(xì)胞周期被抑制，但是其響應(yīng)PEG脅迫程度較其它品種低（圖4-C-D）。該研究結(jié)果不僅表明利用LB01核解離液和流式細(xì)胞術(shù)可成功檢測大豆根尖的細(xì)胞周期，而且表明干旱脅迫參與調(diào)控大豆根尖的細(xì)胞周期進(jìn)程，及不同大豆品種響應(yīng)程度有差異。

圖2 不同核解離液獲得的大豆嫩葉組織細(xì)胞核DNA相對含量

圖3 不同核解離液獲得的大豆根細(xì)胞核DNA相對含量及形態(tài)學(xué)觀察

3 討論

田新民等［25］建議選取適合實(shí)驗(yàn)材料的解離液時可參照成功測定同屬或同科的物種的解離液，因此本研究為將來研究豆科植物利用流式細(xì)胞儀技術(shù)上提供參考。此外，由于流式細(xì)胞檢測需要在短時間內(nèi)分析大量的細(xì)胞核懸液，因此對提取的細(xì)胞核懸液的純度和濃度要求較高，濃度為1×105-1×107個/mL的高純度完整的單顆粒細(xì)胞核較為適宜［26］。本實(shí)驗(yàn)中由于葉綠體DNA可與染料DAPI結(jié)合，在分選時出現(xiàn)熒光值而干擾細(xì)胞核信號，而根組織中沒有葉綠體，由其制備的細(xì)胞核懸液的純度和濃度更高。因此，葉片組織和根組織相比，根組織是更適合流式細(xì)胞儀分選的材料。

核解離液中添加非離子型表面活性劑（如Tween-20或Triton X-100）可以促進(jìn)細(xì)胞核的釋放及防止黏性物質(zhì)粘住細(xì)胞核。本研究中所有的核解離液均添加了一定濃度的Triton X-100，但是提取細(xì)胞核的效果有差異。在所有的細(xì)胞核解離液，Galbraith’s解離液的解離效果最好，其Triton X-100濃度是0.1%，而WPB和GPB中，Triton X-100 濃度較高（0.5%-1%），核解離液中Triton X-100 的濃度可能是關(guān)鍵因素之一。此外，離心強(qiáng)度過大或時間過短，細(xì)胞核仍懸浮在核解離液中達(dá)不到富集的效果，在下一步棄多余核解離液而丟失；離心強(qiáng)度過大或時間過長，制備的細(xì)胞核懸浮液雜質(zhì)會明顯增加甚至干擾檢測。

圖4 不同大豆品種在PEG模擬干旱脅迫前后細(xì)胞周期的分析

核內(nèi)復(fù)制有助于維持植物在壓力條件下的生長以適應(yīng)不利的環(huán)境因素。在許多物種中，水分脅迫可以通過降低細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性來抑制有絲分裂周期，增加核內(nèi)復(fù)制周期。細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制水平的提高可促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)張，從而減輕水分虧缺對細(xì)胞大小的影響，幫助植物減緩所受到的脅迫傷害［27-28］。本研究在篩選適合大豆組織的核解離液的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對大豆干旱脅迫下細(xì)胞周期的調(diào)控進(jìn)行了初步分析，本實(shí)驗(yàn)采用LB01核解離液提取的細(xì)胞核懸浮液的變異系數(shù)均小于5%，且碎片較少，主峰非常明顯，說明該核解離液不僅分離大豆根的細(xì)胞核效果較好，而且由此對應(yīng)的細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，為進(jìn)一步研究逆境對大豆核內(nèi)復(fù)制水平的影響提供技術(shù)支持。本研究為使用流式細(xì)胞儀簡便、快速、準(zhǔn)確地研究大豆細(xì)胞核DNA的含量、細(xì)胞周期和遺傳倍性奠定了基礎(chǔ)

4 結(jié)論

本研究利用流式細(xì)胞儀分析對比了6種細(xì)胞核解離液的分離效果，找到了適合大豆葉片及根組織的細(xì)胞核解離液。其中Galbraith’s核解離液的核分離效果最好，LB01核解離液次之，但LB01核解離液可檢測到顯著的G2/M 期峰，在細(xì)胞周期及遺傳倍性中相對更好。進(jìn)一步通過比對不同大豆品種中PEG處理前后根尖細(xì)胞核細(xì)胞周期，表明LB01核解離液亦具有良好的適用性及應(yīng)用性。