楊洪 胡燕玲，2 岳鎰繁，2 鄧治 代龍軍 李德軍

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南京 210095）

橡膠是四大工業(yè)原料之一，根據(jù)來源不同分為天然橡膠和合成橡膠。天然橡膠在彈性、耐磨性和延展性等特性方面具有合成橡膠不可替代的優(yōu)勢(shì)，在一些重要工業(yè)領(lǐng)域（如航空、航天和重型汽車等制造業(yè)）廣泛應(yīng)用。我國(guó)是天然橡膠第一大消費(fèi)國(guó)和進(jìn)口國(guó)，自2017年我國(guó)天然橡膠年消費(fèi)量和進(jìn)口量均在5.0×106t以上，而我國(guó)天然橡膠年產(chǎn)量持續(xù)在8.0×105t上下波動(dòng)，供需缺口懸殊，需要通過進(jìn)口來填補(bǔ)國(guó)內(nèi)天然橡膠資源短缺。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis，簡(jiǎn)稱橡膠樹）是典型的熱帶雨林喬木，是天然橡膠的主要來源［1］。天然橡膠產(chǎn)業(yè)是典型的環(huán)境約束型產(chǎn)業(yè)，受自然因素約束我國(guó)適宜種植橡膠樹的地區(qū)主要集中在海南、廣東、云南三地。截至2018年末，我國(guó)天然橡膠種植面積約為1.15×106hm2。目前，我國(guó)天然橡膠產(chǎn)業(yè)面臨植膠區(qū)域有限且種植趨于飽和及天然橡膠價(jià)格持續(xù)低迷等問題，已很難通過擴(kuò)大種植面積來增加產(chǎn)量。我國(guó)地處熱帶北緣，橡膠樹在生長(zhǎng)周期中不可避免地會(huì)遭受低溫寒害、臺(tái)風(fēng)和季節(jié)性干旱等氣候影響。不良的氣候環(huán)境嚴(yán)重影響橡膠樹單位面積產(chǎn)量，縮短橡膠樹經(jīng)濟(jì)壽命。因此，提高橡膠樹單位面積產(chǎn)量及其對(duì)逆境脅迫的耐受能力是緩解天然橡膠供需平衡壓力的最佳途徑。

多胺（Polyamine，PAs）是一類小分子脂肪族含氮多聚物，幾乎存在于所有的生物體。在植物中多胺主要以腐胺（Putrescine，Put）、亞精胺（Spermidine，Spd）和精胺（Spermine，Spm）的形式存在，其中Put是多胺生物合成的中心產(chǎn)物［2-4］。Put的合成涉及兩條途徑，一條為通過鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylases，ODC）催化鳥氨酸脫羧形成腐胺的簡(jiǎn)單反應(yīng)，稱為鳥氨酸途徑；另一條以精氨酸為起始物質(zhì)，因此稱為精氨酸途徑。精氨酸經(jīng)精氨酸脫羧酶（Arginine decarboxylase，ADC）脫羧形成鯡精胺（Agmatine，Agm），鯡精胺在鯡精胺亞氨水解酶（Agmatine iminohydrolase/Agmatine deiminase，AIH）的催化下水解生成N-氨甲基腐胺（N-carbamoylputrescine，NCP），最后在N-氨甲酰基腐胺酰胺水解酶（N-carbamoylputreseine amidohydrolase，CPA）的催化水解下生成腐胺［5-7］。植物是唯一能夠通過精氨酸途徑合成Put的真核生物，該途徑是某些植物（如擬南芥、小立碗蘚）腐胺合成的唯一途徑［8］。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，常通過外源施加PAs來提高作物產(chǎn)量和增強(qiáng)作物耐逆性。例如，外源施加Put能夠提高小麥的耐熱性［9］，減輕蘋果愈傷組織鹽脅迫損傷［10］。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高PAs合成相關(guān)基因的表達(dá)能使內(nèi)源PAs在生物體內(nèi)積累，從而達(dá)到作物抗逆、增產(chǎn)的目的［11-15］。Put是橡膠樹膠乳中的主要PAs，割膠能夠促進(jìn)其生物合成［16］。目前，關(guān)于橡膠樹PAs合成相關(guān)基因的研究?jī)H限于SAMDC、ADC、AIH等少數(shù)幾個(gè)基因的克隆及功能分析［17-19］。為進(jìn)一步豐富和了解橡膠樹PAs合成途徑相關(guān)基因的生物學(xué)功能及表達(dá)特性，本文從橡膠樹品系熱研7-33-97中克隆了首個(gè)CPA基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)特性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

本文所用材料均為橡膠樹品系熱研7-33-97。健康樹樹皮、葉片、莖尖、雌花、雄花、膠乳等組織樣品及死皮橡膠樹膠乳、樹皮樣品均采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)；不同發(fā)育階段葉片樣品采自國(guó)家橡膠樹種質(zhì)資源圃（儋州）；過氧化氫（H2O2）、乙烯利（Ethephon，ET）和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）處理的膠乳樣品均來自于已達(dá)到開割標(biāo)準(zhǔn)的未開割橡膠樹；低溫、干旱、高鹽脅迫處理的葉片樣品取自移栽6個(gè)月且長(zhǎng)勢(shì)基本一致的橡膠樹組培苗，處理方法參照楊洪等［19］方法。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的通用植物總RNA提取試劑盒，按其使用說明書提取樣品總RNA，分光光度法檢測(cè)RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整性檢測(cè)。參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行樣品cDNA合成。

1.2.2 HbCPA全長(zhǎng)序列克隆 進(jìn)行橡膠樹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析時(shí)我們獲得了一條與植物CPA基因序列高度同源的unigene，通過NCBI的blast比對(duì)確定其為CPA基因。由于該unigene缺少閱讀框3'末端序列，因此采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，USA）試劑盒進(jìn)行3'-RACE擴(kuò)增。3'-RACE所用引物為5'-CACATTTTATGGGAACTCATTC-3'和5'-CAAATCCAAGAGACATAGTTGG-3'。按照試劑盒說明書用3'-RACE CDS Primer A對(duì)1 μg各組織混合RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得用于3'-RACE的模板cDNA。以獲得的3'-RACE cDNA為模板用PrimeSTAR Max Premix（TaKaRa，China）進(jìn)行3'端序列擴(kuò)增。將獲得的3'端序列與轉(zhuǎn)錄組中獲得的unigene序列進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接序列并設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 HbCPA生物信息學(xué)及進(jìn)化分析 用NCBI的ORF finder預(yù)測(cè)開放閱讀框；用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)橡膠樹CPA蛋白保守結(jié)構(gòu)域；用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域；用Expasy網(wǎng)站的Prot-Param程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；用NCBI中的BLAST和DNASTAR軟件進(jìn)行同源性分析；用SignalP 4.1Server 軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析；用TMHMM 2.0程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用在線工具（https：//wolfpsort.hgc.jp）分析目的序列的亞細(xì)胞定位；用ClustalX和MEGA6.0進(jìn)行多序列比對(duì)和Neighbor-Joining進(jìn)化樹的構(gòu)建，用多序列比對(duì)顯色工具ESPript對(duì)多序列比對(duì)顯示美化［20］。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)CPA序列設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物（F：5'-GACGTCCAGATTTGTACAAGG-3'和R：5'-CCACAAAAAATTCATGGTTGGG-3'）。以橡膠樹18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因（F：5'-GCTCGAAGACGATCAGATACC-3'和R：5'-TTCAGCCTTGCGACCATAC-3'）。以不同樣品反轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋5倍后為模板，反應(yīng)體系為20 μL，包含2 μL模板，10 μL 2×SYBR Premix、10 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL、滅菌水補(bǔ)足至20 μL。qPCR在Bio-Rad CFX96 qPCR儀進(jìn)行，程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析，以確定引物的特異性?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用公式2-ΔΔCt計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 HbCPA的克隆及序列分析

通過對(duì)橡膠樹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析，獲得了一條長(zhǎng)度為1 068 bp的unigene。NCBI在線blast比對(duì)顯示該unigene與高度植物CPA基因序列相似性均在85%以上，推測(cè)其為橡膠樹CPA基因。由于該unigene缺少閱讀框3'末端序列，因此進(jìn)行了3'-RACE擴(kuò)增。經(jīng)過測(cè)序、拼接及RT-PCR驗(yàn)證，獲得具有完整閱讀框的橡膠樹CPA基因全長(zhǎng)序列，并將其命名為HbCPA。HbCPA序列全長(zhǎng)1 342 bp，開放閱讀框906 bp，編碼301個(gè)氨基酸（圖1）。

HbCPA預(yù)測(cè)理論分子量約為33.48 kD，理論等電點(diǎn)為6.01。不穩(wěn)定系數(shù)為33.67，為穩(wěn)定蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbCPA不含信號(hào)肽，為胞內(nèi)蛋白。疏水性分析表明，該蛋白親水性氨基酸殘基為62個(gè)，占20.60%；疏水性氨基酸殘基為113個(gè)，占37.54%，平均疏水系數(shù)為-0.269，為親水性蛋白。氨基酸組成中帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）共有40個(gè)，占13.29%；帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）共有35個(gè)，占11.63%?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbCPA不含跨膜結(jié)構(gòu)域，為非膜蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbCPA定位于細(xì)胞質(zhì)。

2.2 HbCPA同源比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明CPAs在不同植物中高度相似，本研究所選物種的CPAs與HbCPA的一致性均大于87%。HbCPA與木薯MeCPA氨基酸序列一致性最高，達(dá)98.01%；其次是克萊門氏小柑橘CcCPA和大戟科的麻風(fēng)樹JcCPA，一致性均為92.36%。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明無規(guī)則卷曲為HbCPA二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件，占39.87%；其次是α-螺旋和β-片層結(jié)構(gòu)，占比分別為29.90%和23.36%；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)最少，僅占6.98%（圖2）。

為了分析HbCPA與其他植物CPA蛋白的親緣關(guān)系，選取與HbCPA同源的15個(gè)不同植物CPAs進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果（圖3）表明，橡膠樹HbCPA先與同屬大戟科的木薯MeCPA、蓖麻RcCPA和麻風(fēng)樹JcCPA聚為一枝，然后再與胡楊PeCPA和毛白楊PtCPA聚為一枝，表明它們有較近

2.3 HbCPA系統(tǒng)進(jìn)化分析

的親緣關(guān)系。而蒺藜苜蓿MtCPA、大豆GmCPA和水稻OsCPA聚為較遠(yuǎn)的一枝，暗示它們與HbCPA的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 HbCPA cDNA序列及其編碼的氨基酸序列

2.4 HbCPA組織表達(dá)特性及對(duì)橡膠樹死皮的響應(yīng)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖4-A）顯示，HbCPA在橡膠樹的不同組織（樹皮、葉片、莖尖、雌花和雄花）均有較高的表達(dá)量，但其表達(dá)存在組織差異。表達(dá)量從高到低依次最高為樹皮、葉片、雌花、雄花、莖尖。葉片不同發(fā)育時(shí)期HbCPA表達(dá)結(jié)果（圖4-B）表明，淡綠期HbCPA的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他4個(gè)時(shí)期，變色期和穩(wěn)定期表達(dá)量相當(dāng)，古銅期和衰老期表達(dá)量相當(dāng)，但變色期和穩(wěn)定期的表達(dá)量高于古銅期和衰老期。比較健康和死皮橡膠樹中表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)（圖4-C），HbCPA在死皮橡膠樹樹皮中表達(dá)明顯上升，而在膠乳中HbCPA的表達(dá)基本一致。

2.5 HbCPA在逆境脅迫及激素處理的表達(dá)模式

圖3 HbCPA與其它物種CPAs蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖4 HbCPA在橡膠樹不同組織（A）、葉片不同發(fā)育時(shí)期（B）及健康/死皮橡膠樹膠乳和樹皮（C）表達(dá)模式

橡膠樹膠乳中HbCPA的表達(dá)還受乙烯利（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）等處理和低溫、干旱、高鹽和H2O2等逆境條件的影響。H2O2處理后HbCPA表達(dá)先下降再上升，處理24 h表達(dá)量最低，至48 h表達(dá)量略有上升但也低于處理前水平（圖5-A）。ET處理后膠乳中HbCPA表達(dá)呈現(xiàn)波動(dòng)變化，處理后各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均低于處理前水平。ET處理4 h表達(dá)量急劇下降至8 h表達(dá)量達(dá)到最低水平，24 h開始表達(dá)量開始上調(diào)，72 h開始下降至24 h的表達(dá)水平（圖5-B）。MeJA處理4 h HbCPA表達(dá)急劇下降，處理8 h后逐漸升高直至處理48 h，然后又開始下降至處理72 h其表達(dá)水平與24 h基本一致（圖5-C）。低溫處理抑制HbCPA的表達(dá)，并且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用越明顯（圖5-D）。膠乳中HbCPA的表達(dá)還受干旱和高鹽脅迫調(diào)控，且表達(dá)趨勢(shì)基本一致（圖5-E，F(xiàn)）。干旱或高鹽處理24 h，HbCPA表達(dá)達(dá)到最高水平，分別為處理前的3.3倍和4.4倍；處理48 h表達(dá)水平明顯下降，但仍略高于處理前水平（干旱）或與處理前一致（高鹽）。

圖5 不同處理?xiàng)l件下HbCPA的表達(dá)模式

3 討論

CPA是一種腈水解酶，其功能活性依賴于Glu-Lys-Cys催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)［21］。作為精氨酸途徑合成腐胺過程的終反應(yīng)酶，深入了解CPA基因的結(jié)構(gòu)、功能對(duì)理解生物體內(nèi)PAs代謝平衡具有重要意義。本文首次從橡膠樹中克隆了一個(gè)CPA基因HbCPA，該基因ORF長(zhǎng)906 bp，編碼301個(gè)氨基酸，含有其功能活性所需的Glu-Lys-Cys催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。生物信息學(xué)分析表明，HbCPA為親水性蛋白，不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，是一個(gè)胞質(zhì)酶。序列分析表明HbCPA與其他植物的CPAs一致性很高，說明CPAs在不同植物中具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。進(jìn)化分析表明HbCPA與同屬大戟科的木薯MeCPA、蓖麻RcCPA和麻風(fēng)樹JcCPA親緣關(guān)系最近，與植物學(xué)傳統(tǒng)分類一致。

天然橡膠是在樹皮特化細(xì)胞——乳管中合成。組織表達(dá)譜分析表明，HbCPA在樹皮中的表達(dá)量最高，同時(shí)該基因在死皮樹樹皮中明顯上調(diào)表達(dá)。死皮是橡膠樹割面部分或全部不排膠的現(xiàn)象，是橡膠樹產(chǎn)膠、排膠障礙的極端形式。HbCPA的表達(dá)分析表明，該基因可能與橡膠樹橡膠生物合成和代謝相關(guān)，可能是橡膠樹產(chǎn)膠排膠的負(fù)向調(diào)控因子。橡膠樹葉片發(fā)育分為古銅期、變色期、淡綠期、穩(wěn)定期和衰老期五個(gè)時(shí)期。質(zhì)體的發(fā)生、發(fā)育是橡膠樹葉片由淡綠期轉(zhuǎn)化到穩(wěn)定期的重要原因［22］。橡膠樹葉片不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析表明，HbCPA在葉片淡綠期大量表達(dá)，推測(cè)其可能與葉片由淡綠期轉(zhuǎn)化到穩(wěn)定期密切相關(guān)，可能與質(zhì)體的發(fā)生、發(fā)育有關(guān)。

乙烯作為延長(zhǎng)排膠時(shí)間提高產(chǎn)膠量而被廣泛應(yīng)用的植物激素，而多胺和乙烯的合成競(jìng)爭(zhēng)同一底物S-腺苷蛋氨酸（SAM）［23］。MeJA是橡膠樹乳管分化和發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，可以誘導(dǎo)橡膠樹乳管分化，調(diào)節(jié)橡膠生物合成［24-26］。本研究發(fā)現(xiàn)ET和MeJA處理均抑制了HbCPA的表達(dá)，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)HbCPA表達(dá)整體呈上升趨勢(shì)，暗示HbCPA可能在調(diào)控橡膠樹產(chǎn)排膠信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。CPAs還與植物逆境響應(yīng)密切相關(guān)。水稻含有4個(gè)CPAs基因，分別為OsCPA1-4。干旱脅迫下OsCPA3表達(dá)下調(diào)而OsCPA1、OsCPA2、OsCPA4轉(zhuǎn)錄水平未出現(xiàn)變化［27］。擬南芥CPA在水脅迫處理下出現(xiàn)滯后上調(diào)表達(dá)［28］；同樣的，在本研究中發(fā)現(xiàn)HbCPA表達(dá)也受干旱、低溫、高鹽和H2O2等逆境脅迫影響，表明HbCPA可能參與橡膠樹逆境脅迫應(yīng)答。

4 結(jié)論

從橡膠樹中克隆獲得HbCPA，其開放閱讀框906 bp，編碼301個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其為親水性蛋白。HbCPA表達(dá)無組織特異性，在檢測(cè)的組織中均有表達(dá)。HbCPA可能參與橡膠樹葉片由淡綠期向穩(wěn)定期轉(zhuǎn)化過程，參與低溫、干旱、高鹽、氧化脅迫等非生物逆境應(yīng)答等過程，并可能負(fù)向調(diào)控橡膠樹死皮發(fā)生。