張鑫 周曉今 逄森 李素貞 黃家興 陳茹梅

（1.中國農(nóng)業(yè)大學理學院應用化學系，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

除吸收鐵（Fe）和鋅（Zn）等元素以滿足自身生長需求外，植物還會從土壤中獲取諸如銅（Cu）、錳（Mn）、鎳（Ni）、鈷（Co）和鎂（Mg）等金屬元素。它們是植物行使各種生理生化功能所必須的元素，其攝入不足會造成營養(yǎng)缺乏性疾?。?］。其中Zn是許多蛋白質(zhì)的關(guān)鍵輔助因子，在細胞生長、發(fā)育和分化等過程中均發(fā)揮重要作用［2-3］，充足的Zn有利于提高作物產(chǎn)量［4］；Cu是植物必需的微量元素，參與光合作用、呼吸作用、解毒和氧化還原等生理過程［5］；Mn參與組成植物光合蛋白和酶的主要結(jié)構(gòu)，缺乏會導致光合系統(tǒng)II的損傷并阻斷電子傳遞［6-7］。由此可見，適量的金屬有益于植物體的生長發(fā)育，但其過量積累可對植物產(chǎn)生毒害作用。重金屬含量的增加可以通過多種機制對細胞造成損害［8］，而且并未發(fā)現(xiàn)鎘（Cd）、鎵（Ga）、金（Au）、鉛（Pb）、鋰（Li）、汞（Hg）、銀（Ag）、錫（Sn）和鈾（U）等重金屬在植物體中參與特定的生物功能，因此它們被認為是植物生存的非必需金屬元素［9］。近年來，由于重金屬向環(huán)境的排放日漸嚴重，在水稻等作物中檢出了過量的Cd和砷（As）。其中，以Cd在植物中的富集尤為常見［10］，因為其通常會被Fe、Zn等金屬的轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運并儲藏在植物體內(nèi)。因此，開展植物對重金屬元素的吸收和運輸機理研究，對于提高作物品質(zhì)和減少可食用部位的重金屬元素含量具有重要的理論和實際意義。

煙酰胺（Nicotianamine，NA）最初在煙草中發(fā)現(xiàn)的一種非蛋白氨基酸［11］，由三分子蛋氨酸經(jīng)煙酰胺合成酶合成而來［12］。NA可作為金屬螯合劑輔助亞鐵離子（Fe2+），錳離子（Mn2+），鋅離子（Zn2+）和銅離子（Cu2+）等金屬離子在植物體內(nèi)長距離運輸［13-16］。此外，NA也是植物鐵載體（Phytosiderophores，PS）合成的前體［17-18］。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高水稻中NA和植物鐵載體的濃度可增加胚乳中Zn和Fe含量，同時發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因株系中Cd的濃度降低，表明NA及PS的合成與分泌也可調(diào)節(jié)Cd在植物體內(nèi)的儲存［19］。NA外排轉(zhuǎn)運體（EFFLUX TRANSPORTER of NA 1，ENA1）首次在卵母細胞中被發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)運NA的能力［20］。缺Fe會誘導ENA1基因在根中上調(diào)表達；在正常營養(yǎng)液培養(yǎng)下，OsENA1過表達轉(zhuǎn)基因幼苗的根毛多于野生型，而在高濃度Zn營養(yǎng)液中根毛數(shù)目并無差異［21］。以上研究表明，ENA1可能對植物體內(nèi)金屬元素的穩(wěn)態(tài)方面有一定的調(diào)節(jié)作用。在擬南芥（Arabidopsis）中發(fā)現(xiàn)了植物鐵載體轉(zhuǎn)運體（TRANSPORTER of MUGINEIC ACIDS 1，TOM1）的同源蛋白ZINCINDUCED FACILITATOR 1（ZIF1），其編碼基因表達受Zn和Mn的誘導，并且ZIF1的突變體對Cd敏感［22］。此外，在過表達ZIF1的擬南芥植株中出現(xiàn)脈間黃化的表型，且轉(zhuǎn)基因幼苗地上部分Zn的含量比野生型植株顯著降低［22-23］。綜上可見，影響NA的轉(zhuǎn)運可能對各類金屬元素的分布和儲存產(chǎn)生不同影響。

ENA1作為NA的轉(zhuǎn)運體在植物體內(nèi)的金屬元素的平衡方面有重要作用，但玉米的ENA1未見相關(guān)報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，玉米（Zea mays.L）中的ZmENA1（Zm00001d052532）與水稻（Oryza sativa.L）中的ENA1同源性最高，并且發(fā)現(xiàn)ZmENA1表達量對Fe的響應非常明顯。因此，本研究克隆了玉米 ZmENA1的開放閱讀框（ORF），分析了其蛋白序列特征，并通過熒光定量技術(shù)分析了ZmENA1在籽粒發(fā)育過程中的時空表達，以及在不同金屬離子濃度下的表達模式，為深入研究ZmENA1通過應答植物自身發(fā)育與環(huán)境金屬元素信號以調(diào)節(jié)NA分泌和金屬離子轉(zhuǎn)運和儲藏的分子機理提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本試驗所用種子由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所保存。玉米B73自交系材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所試驗田（河北省廊坊萬莊）。玉米B73自交系幼苗材料置于28℃和光暗比16 h /8 h的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.1.2 試驗試劑 RNA 提取試劑盒、cDNA第一鏈的合成試劑盒以及 B 載體試劑盒均購自北京全式金生物公司；KOD高保真酶購自東洋紡公司；實時熒光定量 TB GreenTMPremix EX TaqTM購自 TaKaRa 公司；引物合成和測序工作由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成；大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α 購自北京擎科生物科技有限公司；Hoagland 營養(yǎng)液購自北京酷來搏科技有限公司；瓊脂糖膠 DNA 回收試劑盒購自上海博彩生物科技有限公司；大提質(zhì)粒試劑盒購自 Promega 公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 取授粉后4 DAP和10 DAP 的玉米籽粒，此外分別取12 DAP、16 DAP、20 DAP、24 DAP、26 DAP和28 DAP玉米胚乳和種皮的混合部分以及胚。對于不同金屬濃度下幼苗的處理，首先將玉米種子利用卷紙法在清水中進行萌發(fā)，待長到三葉期放入標準 Hoagland 營養(yǎng)液中培養(yǎng)至三葉一心期，隨后進行金屬處理：標準 Hoagland 營養(yǎng)液（對照），在標準Hoaglang營養(yǎng)液基礎上將個別金屬離子濃度分別配制為 c（Zn2+）：200 μmol/L、c（Mn2+）：500 μmol/L、c（Cu2+）：500 μmol/L、c（Cd2+）：500 μmol/L以及分別缺 Zn、Mn 和 Cu 的營養(yǎng)液，并取不同處理時間幼苗的地下部和地上部，液氮速凍存于-80℃。

1.2.2 ZmENA1的克隆將材料進行液氮速凍研磨，并按照RNA提取試劑盒說明書進行總RNA提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。然后以 RNA 為模板參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。以逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，應用上游引物：5'-ATGGGCGGGGATGCGGCG-3'和下游引物5'- ATGGTCTGGTCCATTTTGCCAGT -3'，KOD 高保真酶擴增獲得ZmENA1基因的ORF，擴增程序為：94℃預變性1 min；98℃變性10 s，68℃退火及延伸45 s，35個循環(huán)；68℃延伸10 min。

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，回收目的條帶，與B載體連接，采用熱激法與大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α 進行轉(zhuǎn)化，在含有 IPTG和 X-gaL 的LB平板中進行涂布培養(yǎng)并挑取白色單克隆，隨后將單克隆在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR 驗證成功后送奧科鼎盛生物有限公司測序。

1.2.3 ZmENA1 的生物信息學分析 利用蛋白質(zhì) 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.expasy.org/resources）分析ZmENA1的氨基酸序列特性；利用 ExPASy 的SOPMA 工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預測；通過ExPASy 的 SWISS-MODEL 構(gòu)建蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；通過 NetPhos 在線工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對 ZmENA1 的磷酸化位點進行預測；通過 SignaIP 預測工具（http：//www.bioxyz.net/signal-peptide/index.html）對 ZmENA1 的信號肽進行預測；通過TMHMM Server 2.0跨膜分析 網(wǎng) 站（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對ZmENA1的跨膜區(qū)進行預測。

1.2.4 ZmENA1的實時熒光定量表達分析參照TaKaRa公司SYBR?Fast qPCR Mix試劑盒說明書進行實時熒光定量檢測ZmENA1 的表達模式。利用Primer 3.0（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）網(wǎng)站設計基因特異引物（F：5'-GGACCAGACCATGACTCCAG-3'，R：5'-GGCAAGCCCTATGTTGTTGG-3'）進行實時熒光定量試驗。以玉米Actin1基因為內(nèi)參（F：5'-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3'，R：5'-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3'）。實時熒光定量擴增程序為：94℃預變性30 s；94℃變性5 s，68℃退火及延伸34 s，40個循環(huán)；溶解曲線程序根據(jù)QuantStudio 1儀器設定。實時熒光定量數(shù)據(jù)通過2-ΔΔCt法計算相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 玉米中ZmENA1的克隆

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，ZmENA1是水稻中OsENA1的同源蛋白，并且該基因的表達量對環(huán)境中 Fe 濃度有一定的響應。我們依據(jù)B73數(shù)據(jù)庫中預測的 ZmENA1 基因的ORF區(qū)域進行引物設計，隨后PCR擴增，并對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖1 所示在1 300 bp 左右出現(xiàn)特異條帶，且大小與預測的 ORF 序列長度1 356 bp 相近。將目的條帶回收并連接載體測序，結(jié)果表明獲得了正確的ZmENA1 克隆且其核苷酸序列與玉米 B73 序列一致。

圖1 ZmENA1基因的克隆

2.2 ZmENA1蛋白生物信息學分析

2.2.1 理化性質(zhì)的分析 網(wǎng)站預測 ZmENA1 蛋白長度為 452 個氨基酸，含有 14 個外顯子和 13 個內(nèi)含子，蛋白質(zhì)分子大小為 48.998 kD，理論等電點為8.06。亮氨酸（Leu）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（IIe）和甘氨酸（Gly）在所有氨基酸組成中出現(xiàn)頻率較高，分別為 12.2%，11.7%，9.5%，8.2%，8.0%，6.6%，但組氨酸（His）、天冬酰胺（Asn）、半胱氨酸（Cys）和色氨酸（Trp），出現(xiàn)頻率較低，分別為 0.7%，0.9%，1.5%，1.5%。

2.2.2 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測 通過 ExPASy 的SOPMA 在線工具進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預測，從圖2-A 可以看到ZmENA1 蛋白質(zhì)中二級結(jié)構(gòu)比較豐富，其中 α 螺旋所占比例最高，達到 53.98%，延伸鏈和不規(guī)則卷曲分別占 11.95% 和 28.98%。通過 ExPASy的 SWISS-MODEL 在線工具預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，從圖2-B 中也可觀察到α 螺旋所占比例較大，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果吻合，推測該蛋白可能含有 DNA 結(jié)合基序。

2.2.3 磷酸化位點分析 通過 ExPASy 的 NetPhos在線工具對蛋白質(zhì)磷酸化位點進行預測，圖3 中可以觀察到該蛋白具有 2 個酪氨酸位點，蘇氨酸和絲氨酸位點各一個。推測這些位點的磷酸化可能影響ZmENA1 蛋白質(zhì)的活性。

圖2 ZmENA1 蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預測

圖3 ZmENA1 蛋白磷酸化位點預測

2.2.4 跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽分析 通過 TMHMM Server 2.0 在線分析工具對 ZmENA1 蛋白的跨膜區(qū)進行預測，如圖4-A 所示，該蛋白存在 10 個跨膜區(qū)，并且有一個典型的 MFS（Major facilitator superfamily）家族結(jié)構(gòu)域，屬于跨膜蛋白。此外，通過在線工具預測了 ZmENA1 蛋白的信號肽，如圖4-B 所示，該蛋白的 N 端具有一個信號肽，推測該蛋白可能定位在細胞膜和某種亞細胞結(jié)構(gòu)上。

2.3 ZmENA1在籽粒發(fā)育過程中的表達分析

從圖5 可以看出，ZmENA1 在玉米籽粒的發(fā)育過程中均有一定的表達，在玉米籽粒的發(fā)育前期表達較弱，但在中期有所升高并在 16 DAP 到達峰值，隨后其表達量有所降低。此外，ZmENA1 在籽粒發(fā)育中后期胚乳和種皮中的表達量高于胚（16 DAP-28 DAP），推測該基因可能參與了金屬離子在種皮至胚乳中的運輸與儲藏。

2.4 ZmENA1在不同金屬脅迫下的表達分析

通過培養(yǎng)液中不同金屬離子濃度的處理，研究了 ZmENA1 對環(huán)境中各個金屬元素的應答模式。如圖6 所示，高濃度的 Zn、Mn 和 Cd 均會在一定程度上誘導玉米幼苗根中 ZmENA1 的表達，同時也發(fā)現(xiàn)缺 Zn 也可誘導根中 ZmENA1 的表達。與此不同的是，缺 Zn 和缺 Mn 均可在一定程度上抑制 ZmENA1在玉米幼苗地上部的表達。此外，缺 Cu 處理早期（24 h和48 h）ZmENA1 的表達在地上和地下部分均下調(diào)，但在處理后期（96 h）的地下部其表達再次升高。高濃度的金屬離子誘導ZmENA1 在根中表達和低濃度金屬離子的地上部抑制表明 ZmENA1 可能對 NA 的轉(zhuǎn)運以及金屬的儲藏有一定的作用。

圖4 ZmENA1 蛋白跨膜區(qū)和信號肽預測

3 討論

圖5 ZmENA1 在籽粒發(fā)育過程中的表達

NA 在調(diào)節(jié)植物體內(nèi)金屬離子的轉(zhuǎn)運方面起著重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，在煙草中持續(xù)表達 NAAT造成 NA 含量減少，并導致葉脈間 Fe、Zn、Cu 和Mn 等金屬元素的變化［16］。在擬南芥中過量積累 NA會增加植株對 Ni 的耐受性［24］。ENA 是 NA 的轉(zhuǎn)運體，并且在 2019 年發(fā)現(xiàn) OsENA1 主要定位在水稻根系細胞的質(zhì)膜，同時它也在細胞質(zhì)的囊泡中存在，推測其對于不同細胞間以及細胞內(nèi)不同區(qū)室間 NA的轉(zhuǎn)運具有重要意義［21］。然而，目前對于 ENA 的研究較少。本研究中克隆了玉米 ZmENA1 基因，其具有一個典型的 MFS 家族結(jié)構(gòu)域，同時含有信號肽以及跨膜區(qū)，因此推測 ZmENA1 可能具有在細胞間及細胞內(nèi)膜系統(tǒng)間轉(zhuǎn)運 NA 的功能。此外，我們發(fā)現(xiàn) ZmENA1 含有潛在的磷酸化位點。已有研究報道蛋白磷酸化可調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性或者活性，因而推測 ZmENA1 的穩(wěn)定性或功能可能受到蛋白磷酸化的翻譯后調(diào)控［25］。

研究表明 NA 的積累受到環(huán)境中各金屬元素含量的調(diào)控，同時植物體內(nèi) NA 含量的變化也影響植物對金屬元素的吸收和運輸。首先，NAS 的表達以及 NA 的合成可應答于環(huán)境中金屬元素濃度的變化。小麥中存在的兩類 TmNAS 基因在高鋅和缺鋅條件下表現(xiàn)出不同的表達模式［26］；甘藍在外界缺 Cu 的環(huán)境下會導致韌皮部中 NA 含量的增加［27］。其次，調(diào)節(jié) NA 的合成也可影響植物對多種金屬元素的運輸和積累。在水稻、大豆和甘薯中過表達 NAS 以增加 NA 的含量可影響 Zn 含量［28］，在煙草或擬南芥中過表達 NAS 均可增加轉(zhuǎn)基因植株對 Ni 的耐受性［24，29］。水 稻 的 黃 色 條 紋 樣 蛋 白（YELLOW STRIPE LIKE，OsYSL2）定位于質(zhì)膜上并可以運輸Fe2+-NA 和 Mn2+-NA 復合物，在 OsYSL2-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株的胚乳中發(fā)現(xiàn) Fe 和 Mn 含量降低［30］。相似的是，敲除 OsYSL6 導致水稻共質(zhì)體中 Mn 含量減少以及質(zhì)外體中 Mn 含量增加，表明 NA 也參與植物體內(nèi) Mn的轉(zhuǎn)運［31］。此外，最新的研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié) NA 的分泌也可影響植物器官的發(fā)育，且這一影響受到環(huán)境 Zn含量的調(diào)節(jié)。相較于野生型，過表達 OsENA1 的轉(zhuǎn)基因水稻幼苗根長更短且根毛更多，而在高 Zn 環(huán)境下則觀察不到這一表型［21］。以上研究均表明 NA合成和轉(zhuǎn)運基因的表達會影響植物體內(nèi)的金屬元素含量。

圖6 ZmENA1對不同濃度金屬元素的響應表達

綜上可知 NA 在植物金屬元素吸收及轉(zhuǎn)運過程中具有重要作用。因此，本研究針對玉米中介導 NA運輸?shù)?ZmENA1 開展研究，在克隆獲得該基因的基礎上分析在不同環(huán)境金屬元素條件下 ZmENA1 的表達應答模式，以此推測其調(diào)控的 NA 分泌對各種金屬元素運輸和儲存的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度的 Zn、Mn 和 Cd 均可在不同程度上誘導根中 ZmENA1 的表達，推測在金屬脅迫下，ZmENA1 通過轉(zhuǎn)運 NA 進入囊泡以促進金屬元素在囊泡中的積累，以此緩解細胞毒性。缺 Zn 和缺 Mn 處理可在一定程度上抑制玉米幼苗地上部分 ZmENA1 的表達，由此推測當環(huán)境中這些必需金屬元素缺乏時，植物可能通過降低 ZmENA1 表達以減少 NA 外排，從而抑制金屬元素在各組織中的轉(zhuǎn)運，以此滿足在生長發(fā)育關(guān)鍵組織中的優(yōu)先積累。此外，我們還發(fā)現(xiàn)缺 Cu 早期整株 ZmENA1 的表達被抑制，而延長處理時間后根中ZmENA1 的表達再次升高，暗示 ZmENA1 對于 Cu的響應機制是復雜的。此外，ZmENA1 在玉米胚以及胚乳和種皮混合物中有一定表達，推測其在籽粒發(fā)育過程中金屬元素的儲藏方面起到一定作用。綜上，本研究發(fā)現(xiàn) ZmENA1 的表達可應答于環(huán)境中的多種金屬元素濃度改變，表明植物體內(nèi) ZmENA1 介導的 NA 運輸對于調(diào)節(jié)多種金屬元素的平衡十分關(guān)鍵，并且 ZmENA1 作為 NA 的轉(zhuǎn)運體可能參與了胚與糊粉層中的金屬元素的運輸和儲存，但其機制有待深入研究。

4 結(jié)論

玉米的 ZmENA1 具有典型的 MFS 保守結(jié)構(gòu)域，屬于 MFS 家族蛋白。ZmENA1 在玉米胚乳和種皮混合部分以及在胚中均有一定的表達，推測其可能參與了籽粒發(fā)育過程中的金屬離子轉(zhuǎn)運。此外，ZmENA1 的表達對環(huán)境中 Zn2+、Mn2+、Cu2+以及 Cd2+的不同濃度有一定的響應，推測 ZmENA1在金屬離子轉(zhuǎn)運和儲存方面發(fā)揮了一定的作用。