付文倩，張敏新，姚囡囡，張麗麗，宋洪濤 （. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院藥學(xué)科，福建 福州 350025；2. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 006）

替考拉寧（teicoplanin）是一種糖肽類抗生素， 常用于治療包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）在內(nèi)的G+菌引起的感染[1]。它包括5 個(gè)主要成分（TA 2-1、TA 2-2、TA 2-3、TA 2-4 和 TA 2-5）、1 個(gè)水解成分（TA 3-1）和 4 個(gè)次要成分（RS-1～RS-4）[2]。其中,TA 2-2 組分是活性最強(qiáng)的化合物，占各組分相對(duì)含量的40%以上[3-4]，臨床上常常通過測(cè)定TA 2-2 的含量來監(jiān)測(cè)替考拉寧的濃度[5-6]。目前，替考拉寧治療藥物監(jiān)測(cè)主要以測(cè)定總濃度為主，但監(jiān)測(cè)結(jié)果存在較大的個(gè)體差異。主要因?yàn)樘婵祭瓕幍鞍捉Y(jié)合率較高（90 %～95%），在血液循環(huán)中主要與白蛋白（Alb）結(jié)合并處于動(dòng)態(tài)平衡，未結(jié)合的游離部分在體內(nèi)發(fā)揮藥效[7]。健康狀態(tài)下，人體白蛋白為正常水平（35～52 g/L），不同患者藥物的血漿蛋白結(jié)合率變化不大；但在低蛋白血癥（Alb＜25 g/L）[8-10]、危重癥、酸血癥、腎衰竭、肝硬化、吸煙、多種藥物合用等特殊情況下，患者常伴有白蛋白水平下降，當(dāng)Alb＜30 g/L 時(shí)，白蛋白就會(huì)對(duì)替考拉寧游離濃度產(chǎn)生顯著影響從而影響療效[7,10]。同時(shí)，游離藥物水平升高導(dǎo)致腎臟排泄增加，腎毒性風(fēng)險(xiǎn)增加[11-12]。所以，針對(duì)上述白蛋白水平較低的患者，單純用總濃度去評(píng)價(jià)替考拉寧的療效和安全性是片面的，若同時(shí)測(cè)定替考拉寧游離濃度，將更加利于臨床精準(zhǔn)調(diào)整給藥方案，以獲得滿意的治療效果，減少或避免不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究旨在建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的離心超濾結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）用來測(cè)定替考拉寧游離濃度，為臨床實(shí)現(xiàn)替考拉寧游離血藥濃度監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

QTRAP 5 500 型三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó) AB-SCIEX 有限公司）；30AD 型超高效液相色譜儀（日本島津有限公司）；AL204 型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；Vortex-5 型渦旋混合機(jī)（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；超純水儀系統(tǒng)（默克密理博上海有限公司）；Centrifree?超過濾裝置（截留分子量＞30 000 的物質(zhì)）（默克密理博上海有限公司）；DK-S24 型電熱恒溫水浴器（上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品和試劑

替考拉寧對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲酸、醋酸銨（色譜純，Dikma 科技有限公司）；乙腈（色譜純，Sigma-Aldrich 公司）。

1.3 UPLC-MS/MS 分析條件

1.3.1 UPLC 分析條件

色譜柱：EndeavorsilTMC18柱 (50 mm×2.1 mm，1.8 μm)； 流 動(dòng) 相 A：0.02 mol/L 醋 酸 銨 溶 液（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫信息見表1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μl。

1.3.2 MS 檢測(cè)條件離子源參數(shù)：

噴霧針電壓（ISV）：5 500 V；碰撞氣（CAD）：medium；氣簾氣（CUR）：20 psi；入口電壓（EP）：10 V；去簇電壓（DP）：78 V；碰撞能量（CE）：20.74 V；碰撞池出口電壓（CXP）：13 V；離子源氣體 1（GS1）：55 psi；離子源氣體 2（GS2）：60 psi；離子源溫度（TEM）：550 ℃。檢測(cè)模式：電噴霧離子化（ESI），選擇性離子檢測(cè)（SIM），正離子。多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）離子對(duì)：替考拉寧TA2-2 m/z 940.7→316.2。掃描時(shí)間：200 ms。

表1 梯度洗脫信息

1.4 工作液的配制

精密稱取替考拉寧對(duì)照品2.0 mg 置于100 ml容量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，得到濃度為20.0 μg/ml 的儲(chǔ)備液。分別取不同體積的替考拉寧儲(chǔ)備液，用超純水稀釋成濃度為0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、12.0、16.0 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，以及 0.50、3.00、12.0 μg/ml 的質(zhì)控工作液。

1.5 血漿樣品的處理

取1 ml 血漿樣品置于Centrifree?超濾裝置（截留分子量＞30 000 的物質(zhì)）中，在37 ℃水浴中平衡30 min，然后在 37 ℃，1 500×g 下離心 30 min，取樣品超濾液直接進(jìn)樣。

1.6 血漿超濾液樣品的配制

分別取“1.4”項(xiàng)下各濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液以及質(zhì)控工作液 100 μl，加入 100 μl 空白血漿超濾液，稀釋成濃度為0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿超濾液樣品，以及濃度為 0.25、1.50、6.00 μg/ml 的質(zhì)控點(diǎn)血漿超濾液樣品。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

取空白血漿超濾液，直接進(jìn)樣，得到色譜圖A；空白血漿超濾液加替考拉寧對(duì)照品溶液配制成一定濃度（1.00 μg/ml），混合均勻后進(jìn)樣，得色譜圖B；取使用替考拉寧的患者血漿，按“1.5”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣后得色譜圖C，考察方法的專屬性。根據(jù)色譜圖1 中A、B、C，可以看出血漿中內(nèi)源性物質(zhì)沒有干擾替考拉寧的檢測(cè)，同時(shí)TA 2-2 與TA 2-3 完全分開，TA 2-2 保留時(shí)間為11.57 min，可以準(zhǔn)確定量TA 2-2。

圖1 替考拉寧色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

分別取“1.6”項(xiàng)下各濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿超濾液樣品5 μl 直接進(jìn)樣分析，以替考拉寧游離濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得線性回歸方程為Y=51 708.90X+1 397.10（r=0.999，n=8），結(jié)果表明，替考拉寧游離濃度在0.10～8.00 μg/ml 范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，定量下限為0.10 μg/ml。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度

按照“1.6”項(xiàng)下質(zhì)控點(diǎn)血漿超濾液樣品配制方法，配制低、中、高濃度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的質(zhì)控點(diǎn)血漿超濾液樣品各6 份，直接進(jìn)樣分析，計(jì)算批內(nèi)精密度。按照相同的方法重復(fù)測(cè)定3 次，計(jì)算批間精密度。結(jié)果見表2。如表2 所示，在低、中、高濃度水平，樣品的批內(nèi)和批間RSD (%)均不超過7.00%，實(shí)測(cè)值與理論值相對(duì)誤差在-5.00%～7.00%之間，精密度與準(zhǔn)確度均符合生物樣品測(cè)定要求。

表2 批內(nèi)和批間精密度與準(zhǔn)確度 (n=6，s)

表2 批內(nèi)和批間精密度與準(zhǔn)確度 (n=6，s)

理論濃度（μg/ml）精密度（%）批內(nèi) 批間0.25 0.25±0.02 1.56 6.91 6.77 1.50 1.43±0.05 -4.52 2.53 3.83 6.00 5.95±0.20 -0.88 2.99 3.44實(shí)測(cè)濃度（μg/ml）準(zhǔn)確度（%）

2.4 方法回收率

按照“1.6”項(xiàng)下質(zhì)控點(diǎn)血漿超濾液樣品配制方法，配制低、中、高濃度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的質(zhì)控點(diǎn)血漿超濾液樣品各6 份，直接進(jìn)樣分析，按線性回歸方程計(jì)算實(shí)測(cè)濃度，以實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的比值計(jì)算方法回收率。表3 結(jié)果顯示，低、中、高濃度水平的回收率在93.8%～101%范圍內(nèi)，總回收率為97.9%，同時(shí)RSD (%)也符合生物樣品分析要求。

表3 替考拉寧的方法回收率 (n=6，s)

表3 替考拉寧的方法回收率 (n=6，s)

濃度水平（μg/ml）回收率（%）RSD(%)總回收率（%）總RSD(%)0.25 101±7.00 6.91 97.9 5.50 1.50 93.8±2.37 2.53 6.00 98.5±2.96 3.01

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

取來源不同的6 個(gè)空白血漿樣品，按照“1.6”項(xiàng)下質(zhì)控點(diǎn)血漿超濾液樣品配制方法，每個(gè)來源都分別配制成低、中、高濃度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的質(zhì)控點(diǎn)血漿超濾液樣品（每個(gè)濃度3 份），直接進(jìn)樣分析，得峰面積A1。此外，用超純水配制低、中、高濃度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的替考拉寧對(duì)照品溶液（每個(gè)濃度3 份），直接進(jìn)樣分析，得峰面積A2。計(jì)算相應(yīng)樣品中替考拉寧的A1/A2值，即為基質(zhì)因子（MF），考察基質(zhì)效應(yīng)。表4 結(jié)果顯示，低、中、高濃度水平所有樣品的平均基質(zhì)因子為0.97，接近1.00，且RSD (%)為2.12%，符合生物樣品分析要求，說明基質(zhì)效應(yīng)不會(huì)影響分析方法的準(zhǔn)確性。

2.6 穩(wěn)定性考察

2.6.1 血漿超濾液樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性

配制低、中、高濃度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的質(zhì)控點(diǎn)血漿超濾液樣品，每個(gè)濃度有6 個(gè)重復(fù)樣品，放置在室溫10 h 后與當(dāng)日配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測(cè)定，考察替考拉寧血漿超濾液樣品在室溫下的穩(wěn)定性。結(jié)果見表5，室溫放置10 h 后，樣品實(shí)測(cè)濃度與理論濃度偏差在-4.00%～2.17%，RSD(%)不超過6.00%，在生物樣品分析要求范圍內(nèi)，表明樣品在室溫下放置10 h 后穩(wěn)定性較好。

表4 替考拉寧在血漿超濾液中的基質(zhì)效應(yīng) (n=3，s)

表4 替考拉寧在血漿超濾液中的基質(zhì)效應(yīng) (n=3，s)

濃度水平（μg/ml） 基質(zhì)因子0.25 1.50 6.00基質(zhì)A 0.96±0.02 0.96±0.01 0.98±0.02基質(zhì)B 0.95±0.03 0.96±0.03 0.97±0.01基質(zhì)C 1.00±0.01 0.97±0.01 0.99±0.01基質(zhì)D 0.97±0.02 1.00±0.01 0.98±0.01基質(zhì)E 0.99±0.03 0.98±0.02 0.99±0.03基質(zhì)F 0.97±0.02 0.95±0.01 0.98±0.01各濃度水平均值 0.97 0.97 0.98各濃度水平RSD (%) 2.58 2.21 1.30總均值 0.97總RSD (%) 2.12

2.6.2 血漿超濾液樣品長(zhǎng)期冷凍保存的穩(wěn)定性

配制低、中、高濃度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的質(zhì)控點(diǎn)血漿超濾液樣品，每個(gè)濃度有6 個(gè)重復(fù)的樣品，在-20 ℃放置15 d 后與測(cè)定當(dāng)日配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線同批進(jìn)樣分析，考察替考拉寧血漿樣品-20 ℃下的穩(wěn)定性。結(jié)果見表5，-20 ℃下儲(chǔ)存15 d 后，樣品實(shí)測(cè)濃度與理論濃度偏差在-12.0%～-2.67%，RSD 在5.00%以內(nèi)，符合生物樣品分析要求，表明樣品在-20 ℃保存15 d 后穩(wěn)定性達(dá)標(biāo)。

2.6.3 血漿超濾液樣品的凍融穩(wěn)定性

配制低、中、高濃度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的質(zhì)控點(diǎn)血漿超濾液樣品，每個(gè)濃度有6 個(gè)重復(fù)的樣品，放置在-20 ℃的冰箱內(nèi)超過24 h，取出放置在室溫條件下完全溶解后，再放置在-20 ℃的冰箱內(nèi)，反復(fù)凍融3 次，在第3 次融化后與測(cè)定當(dāng)日配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線同批進(jìn)樣分析，以考察血漿樣品3 次凍融循環(huán)穩(wěn)定性。結(jié)果見表5，反復(fù)凍融3 次后，樣品實(shí)測(cè)濃度與理論濃度偏差在-12.0%～-4.00%，RSD 在6.50%以內(nèi)，符合生物樣品分析要求，表明樣品凍融后穩(wěn)定性仍較好。

3 總結(jié)與討論

近年來，血漿藥物游離濃度的監(jiān)測(cè)逐漸受到廣泛關(guān)注。對(duì)于臨床上提倡進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，而蛋白結(jié)合率又高于80%的藥物，建議監(jiān)測(cè)藥物游離濃度用以指導(dǎo)用藥的劑量調(diào)整。對(duì)于高蛋白結(jié)合率的藥物來說，白蛋白水平的改變可能會(huì)導(dǎo)致其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)變異性增加[12]。因此，對(duì)于低蛋白血癥（Alb＜25 g/L）[8-10]、危重癥、酸血癥、腎衰竭、肝硬化、吸煙、多種藥物合用等這類常伴有白蛋白水平降低的患者來說，替考拉寧的蛋白結(jié)合率具有一定的變異性[7,13]，即使獲得相同的替考拉寧總濃度，體內(nèi)真正發(fā)揮藥效的游離替考拉寧濃度也可能不同。此時(shí)，應(yīng)準(zhǔn)確測(cè)定替考拉寧游離濃度來調(diào)整用藥劑量，以防濃度低達(dá)不到治療目標(biāo)，或用藥過量導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。為實(shí)現(xiàn)對(duì)替考拉寧游離濃度的監(jiān)測(cè)，本研究首次建立了超濾離心結(jié)合UPLCMS/MS 的方法。該方法與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)速度快，檢測(cè)限較低，靈敏度較高，質(zhì)譜檢測(cè)可以排除患者所用的其他藥物對(duì)替考拉寧的干擾，準(zhǔn)確度較高。替考拉寧在水中易溶，在乙腈、甲醇中幾乎不溶。因此，用超純水作為儲(chǔ)備液溶劑可使對(duì)照品完全溶解。替考拉寧成分復(fù)雜，為實(shí)現(xiàn)對(duì)各組分的有效分離，本研究選用Dikma公司的EndeavorsilTMC18柱，是通用型UPLC 反相柱，具有獨(dú)特的選擇性和超高的分離性能，適合于高效、超快速分離分析，且峰形對(duì)稱性好。在流動(dòng)相選擇的前期探索中，發(fā)現(xiàn)乙腈較甲醇可以更好地提高質(zhì)譜響應(yīng)，所以，選用乙腈作為有機(jī)相。水相則選擇在0.02 mol/L 醋酸銨溶液中加入0.1%甲酸，增加離子化效率，進(jìn)一步改善峰形，使各組分完全分離。此外，采用電噴霧電離源(ESI)電離方式，發(fā)現(xiàn)替考拉寧在正離子模式下具有較高的離子化效率，且重現(xiàn)性良好。藥物游離濃度的測(cè)定具有一定的難度，難點(diǎn)在于如何快速且有效地分離游離型藥物，對(duì)血漿樣品的處理有較高的要求。目前，測(cè)定藥物游離濃度常見的樣品處理方法主要有平衡透析法、超濾離心法[14]。其中最常用的是超濾離心法，該法不需稀釋，不會(huì)改變生理pH 值、離子組成，主要是利用離心力使游離藥物通過半透膜，迅速而有效地從血液及其他生物樣本中分離游離藥物[15]。現(xiàn)國(guó)內(nèi)外常用的超濾離心裝置主要有Centrifree?和 Amicon Ultra 兩種型號(hào)。本研究選用Centrifree?超濾裝置進(jìn)行分離。Roberts 等在替考拉寧游離濃度測(cè)定的研究中，使用Amicon Ultra 超濾裝置分離蛋白[10]。但是，在實(shí)驗(yàn)前期探索中，我們發(fā)現(xiàn)Amicon Ultra 裝置所得血漿超濾液中加入乙腈后仍有沉淀析出，蛋白截留不完全；而Centrifree?裝置產(chǎn)品說明書提示Centrifree?裝置可以截留99.9%的蛋白，且使用該裝置所得血漿超濾液中加入等量乙腈后未見明顯沉淀析出。雖然兩者所用濾膜均是再生纖維素膜，但是相比Amicon Ultra 的凹槽設(shè)計(jì)、Centrifree?系列的平面設(shè)計(jì)，優(yōu)點(diǎn)在于濾面更大，死體積更小，更有利于微溶質(zhì)的濾過，是專用于從血液等生物樣本中分離蛋白結(jié)合微溶質(zhì)的，用于游離型藥物的分離更為合理[15]。其次，為保證游離藥物可以和蛋白有效分離，應(yīng)選擇合適的濾膜孔徑。由于替考拉寧主要與白蛋白結(jié)合，而白蛋白的分子量約為66 000，本研究選用截留分子量為30 000 的濾膜用以截留與白蛋白結(jié)合的藥物，獲得游離型替考拉寧。此外，確定合適的樣品處理?xiàng)l件也是至關(guān)重要的。首先，收集的血漿樣品為保持穩(wěn)定性，需要低溫保存，但溫度較低可能會(huì)影響藥物與蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致藥物游離濃度偏低，為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，樣品需在37 ℃平衡30 min 后再進(jìn)行超濾離心[10]。其次，離心力與離心時(shí)間也是影響超濾效果的重要因素[16]。離心力（1 000～2 000）×g 可以達(dá)到最佳濾過率，離心時(shí)間在15～30 min 時(shí)超濾液量與離心時(shí)間成正比[16]，再結(jié)合文獻(xiàn)[10]報(bào)道，本研究最終選用離心力1 500×g，離心時(shí)間30 min。同時(shí)，為保證樣品測(cè)定盡可能不受基質(zhì)的影響，本研究所有樣品均采用空白血漿超濾液作為基質(zhì)進(jìn)行配制。有文獻(xiàn)[17]也指出，游離藥物分析最適宜的基質(zhì)為空白血漿超濾液。方法建立后按照《中國(guó)藥典》（2015 年版）附錄《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果均符合該指導(dǎo)原則的要求。綜上，本研究建立了離心超濾結(jié)合UPLC-MS/MS 檢測(cè)替考拉寧游離濃度的方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，可以為臨床開展替考拉寧游離濃度監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

表5 不同儲(chǔ)存條件下替考拉寧樣品的穩(wěn)定性 (n=6，s)

表5 不同儲(chǔ)存條件下替考拉寧樣品的穩(wěn)定性 (n=6，s)

儲(chǔ)存條件 理論濃度（μg/ml）實(shí)測(cè)濃度（μg/ml）RSD (%)準(zhǔn)確度（%）室溫10 h 0.25 0.24±0.01 5.52 -4.00 1.50 1.48±0.03 2.16 -1.33 6.00 6.13±0.12 2.09 2.17-20 ℃ 15 d 0.25 0.22±0.01 4.76 -12.00 1.50 1.46±0.02 1.98 -2.67 6.00 5.79±0.13 2.23 -3.50凍融3次 0.25 0.22±0.01 6.43 -12.00 1.50 1.44±0.05 3.67 -4.00 6.00 5.68±0.18 3.15 -5.33