侍雯婧，田逸君，黃才國，朱玉平，嚴(yán) 朗，鄭怡文 （海軍軍醫(yī)大學(xué)：. 海軍醫(yī)學(xué)系衛(wèi)生毒理學(xué)教研室；. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433）

Wentilactone A（WA）是從海洋微生物中分離得到的去甲二萜類小分子化合物，對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H460 和NCI-H446 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，可誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCIH446 和NCT-H1688 細(xì)胞凋亡[1]。對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCT-H1688 細(xì)胞的細(xì)胞遷移和集落形成具有抑制作用[2]。WA 作為一種有效抗腫瘤候選物，已從制備工藝、理化性質(zhì)、急性毒性、生殖毒性等方面證明其良好的成藥性[3]。遺傳毒性安全性實(shí)驗(yàn)更是對其臨床前研究全面性的補(bǔ)充，為提高臨床用藥的安全性，為了驗(yàn)證其是否具有遺傳毒性，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用微生物回復(fù)突變試驗(yàn)（Ames 試驗(yàn)）、體外培養(yǎng)CHO 細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)和小鼠骨髓微核試驗(yàn)方法對WA 的遺傳毒性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為WA 的臨床前毒性評價(jià)提供資料[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化合物WA

Ames 試驗(yàn)用 WA（含量：99.9%，批號：20121115，黃色粉末）、體外培養(yǎng)CHO 細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)用（規(guī)格：10 ml，含量：50.8 mg/ml，批號：20130506，黃色澄明溶液）、小鼠骨髓微核試驗(yàn)用WA（規(guī)格：10 ml/支：100mg，含量：10.2 mg/ml，批號：20130407，黃色澄明溶液），均由海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室提供。WA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 WentilactoneA 的結(jié)構(gòu)式

1.1.2 菌株

組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌（S. typhimurium）TA97、TA98、TA100、TA102 和 TA1535 共 5 支菌株，復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室贈予。實(shí)驗(yàn)前對其進(jìn)行鑒定（R 因子和自發(fā)回變數(shù)鑒定），均符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 細(xì)胞

中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理教研室贈予。

1.1.4 動物

ICR 小鼠（SPF 級）共 60 只，每組 10 只，雌雄各半，5～6 周齡，購入時(shí)體重 16.5～20.8 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號：2008001629237。自購入起3 天進(jìn)行檢疫，給藥時(shí)體重20.3～23.6 g。

1.2 試驗(yàn)方法

按《新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》[5-6]的設(shè)計(jì)要求，分別應(yīng)用Ames 試驗(yàn)[7]、體外培養(yǎng)CHO 細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)[8]和小鼠骨髓微核試驗(yàn)[9]檢測WA 的遺傳毒性。檢測終點(diǎn)覆蓋了基因突變、染色體畸變和細(xì)胞有絲分裂異常。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 Ames 實(shí)驗(yàn)

根據(jù)《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，應(yīng)用S. typhimurium TA97、TA98、TA100、TA102和 TA1535 共 5 支菌株，設(shè)每皿 5 000、500、50、5、0.5 μg 5 個(gè)劑量組。此外，設(shè)空白對照、溶劑對照和陽性對照組（具體劑量見表1）。采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法，使細(xì)菌在加和不加代謝活化系統(tǒng)S9 的條件下接觸受試物，每皿均加入供試品或溶劑對照DMSO 0.1 ml，每個(gè)劑量組及對照組均設(shè)3 個(gè)平行皿。并用最低極限的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后，先用顯微鏡觀察平皿上的菌苔生長情況，確定受試物無明顯的抑菌或殺菌作用，再人工計(jì)數(shù)每皿回復(fù)突變的菌落數(shù)，記錄原始數(shù)據(jù)，并計(jì)算每組的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，與溶劑對照組進(jìn)行比較，重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次。

表1 陽性對照品名稱及濃度

1.3.2 染色體畸變試驗(yàn)

在加和不加代謝活化系統(tǒng)S9 的條件下，體外培養(yǎng)的CHO 細(xì)胞中加入相應(yīng)濃度的供試品或?qū)φ掌罚磻?yīng)體系總體積為10 ml。低、中、高劑量組供試品終濃度分別為 23.74、47.48 和 94.96 μg/ml，陽性對照組絲裂霉素C 和環(huán)磷酰胺的終濃度分別為0.5 μg/ml、60 μg/ml，另設(shè)溶劑對照組分別作用于細(xì)胞4 h 后換液繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，和藥物作用細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。收獲細(xì)胞前4 h，加入終濃度0.2 μg/ml秋水仙素，培養(yǎng)結(jié)束收集細(xì)胞，經(jīng)離心、低滲處理、固定、離心、制片和Giemsa 染色，每個(gè)劑量組制備2～3 張玻片標(biāo)本。

鏡檢時(shí)每組觀察200 個(gè)染色體中分散良好、數(shù)目完整的中期分裂相細(xì)胞（若觀察到大量染色體畸變細(xì)胞，如陽性對照組，分析細(xì)胞數(shù)可相應(yīng)減少為至少100 個(gè)細(xì)胞）。計(jì)數(shù)染色體或染色單體的斷裂、缺失及其他類型結(jié)構(gòu)異常的數(shù)目（裂隙和核內(nèi)復(fù)制一般不作為畸變類型），記錄原始數(shù)據(jù)計(jì)算畸變率。

1.3.3 小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)

檢疫期結(jié)束后分別按低、中、高組小鼠給藥，分別予100、200、400 mg/kg 劑量給藥，其中高劑量組設(shè)兩組分別在藥物作用24 h 和48 h 后處死，并設(shè)陽性對照組和溶劑對照組。分別在藥物作用24 h和48 h 后處死小鼠，取股骨骨髓制成骨髓涂片，每只動物制2 張涂片，經(jīng)甲醇固定后用pH6.8 的Giemsa 染液染色。

每只動物鏡檢約2000 個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE），計(jì)數(shù)含微核的 PCE 數(shù)（MNPCE），計(jì)算微核發(fā)生率，同時(shí)記錄200 個(gè)PCE 計(jì)數(shù)過程中觀察到的正染紅細(xì)胞（NCE）的數(shù)目，并計(jì)算PCE/NCE 值。

1.4 劑量設(shè)計(jì)

對于易溶無毒的化合物，細(xì)菌實(shí)驗(yàn)最高濃度應(yīng)達(dá)到 5 mg/皿[10]。Ames 試驗(yàn)設(shè)每皿 5 000、500、50、5、0.5 μg 5 個(gè)劑量組，每皿均加入相應(yīng)濃度的供試品溶液0.1 ml，另設(shè)空白對照、溶劑對照和陽性對照。在哺乳動物細(xì)胞體外遺傳實(shí)驗(yàn)中，毒性水平應(yīng)高于50%細(xì)胞抑制率或細(xì)胞融合率[11]。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定供試品的IC50為94.96 μg/ml。染色體畸變試驗(yàn)的低、中、高劑量組為23.74、47.48 和94.96 μg/ml，試驗(yàn)時(shí)在 10 ml 的試驗(yàn)體系中分別加入0.1 ml 各劑量組的應(yīng)用液，另設(shè)陽性對照組和溶劑對照。ICR 小鼠的微核試驗(yàn)采用小鼠經(jīng)尾靜脈注射給藥，總劑量分別為100、200、400 mg/kg（單次給藥劑量分別為50、100、200 mg/kg，分上、下午兩次經(jīng)尾靜脈注射給藥），給藥容積為20 ml/kg 體重；同時(shí)設(shè)陽性對照組和溶劑對照組。陽性對照組以40 mg/kg 體重的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，給藥容量為10 ml/kg 體重；溶劑對照組給藥方式與受試物組相同，以20 ml/kg 體重的容積經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

Ames 試驗(yàn)結(jié)果的評價(jià)是以溶劑對照組的回復(fù)突變菌落數(shù)為基礎(chǔ)，與受試物各劑量組相比較。若某劑量組回復(fù)突變菌落數(shù)為溶劑對照組的2 倍以上，呈現(xiàn)可重復(fù)性，并在一定的劑量范圍內(nèi)存在著劑量-反應(yīng)關(guān)系，則判斷為陽性[12]。染色體畸變試驗(yàn)和小鼠骨髓微核試驗(yàn)均采用卡方檢驗(yàn)或方差分析方法研究給藥組與對照組之間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ames 試驗(yàn)結(jié)果

受試物各劑量組和對照組的平皿均可見背景菌苔生長。5 支菌株的自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)以及陽性對照品誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均在歷史參考范圍內(nèi)，并且各菌株陽性對照組的回復(fù)突變菌落與空白對照組相比數(shù)目顯著增加，提示本試驗(yàn)系統(tǒng)符合要求。在最高劑量已達(dá)到5 000 μg/皿的受試條件下，未觀察到受試物的抑菌現(xiàn)象。各劑量組受試物 在 加 或 不 加S9 時(shí) 對TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均與自發(fā)的突變菌落數(shù)相近，未觀察到明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果見表2 和表3。

2.2 染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果

染色體分析結(jié)果顯示，陽性對照組能夠誘發(fā)受試細(xì)胞染色體的畸變率明顯增高，24 h 在+ S9 和－S9 的情況下染色體畸變率分別為11% 和11%，與溶劑對照組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；23.74、47.48 和 94.96 μg/ml 受試物在 24 h、+S9 條件下染色體畸變率分別為1%、1% 和0.5%，24 h、－S9 條件下染色體畸變率分別為0%、0.5%和0%；4 h、－S9 條件下染色體畸變率分別為0%、0%和0%。綜上，受試物各劑量組細(xì)胞染色體畸變率均小于5%，與溶劑對照組結(jié)果相比，其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表 4～6。

表2 WA 對 5 支菌株的回變菌落數(shù)試驗(yàn)結(jié)果 (個(gè)/皿，s)（第 1 次）

表2 WA 對 5 支菌株的回變菌落數(shù)試驗(yàn)結(jié)果 (個(gè)/皿，s)（第 1 次）

組別(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 5 000 36±5 40±4 21±3 21±2 131±26 93±17 177±21 185±25 25±3 14±2 500 36±5 39±8 17±4 20±3 114±22 90±23 195±8 207±7 23±1 19±1 50 39±10 35±5 21±7 21±3 115±21 97±8 196±33 179±18 19±8 16±4 5 41±6 40±3 21±5 22±4 114±15 87±19 195±21 193±8 19±2 14±1 0.5 37±6 39±3 20±3 19±3 128±15 91±12 201±14 205±14 20±6 16±4空白對照組 40±7 36±5 17±2 19±4 99±17 89±9 213±30 197±34 21±7 19±4溶劑對照組 40±6 34±1 22±5 26±2 95±8 89±9 193±8 199±29 23±3 14±1陽性對照組 839±24 841±47 936±56 1 077±55 968±27 1 111±66 1 101±17 1 024±53 342±44 345±13

2.3 小鼠骨髓微核試驗(yàn)的結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，WA 在100、200、400 mg/kg 劑量下未觀察到對小鼠骨髓的抑制作用，溶媒對照組和陽性對照組雌、雄性小鼠骨髓PCE 微核發(fā)生率分別為2.10‰和21.36‰、1.90‰和20.88‰，兩組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），驗(yàn)證了本次試驗(yàn)系統(tǒng)的有效性。WA 100 和2 000 mg/kg 劑量24 h 采樣組雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分別為1.60‰和1.80‰、1.90‰和1.60‰；400 mg/kg 劑量24 h 和48 h 采樣組雌、雄小鼠骨髓PCE 微核率分別為2.10‰和2.80‰、2.40‰和1.29‰，與溶媒對照組相比均無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果見表7。

3 討論

沙門菌回復(fù)突變試驗(yàn)（Ames 試驗(yàn)）被研究者廣為采用，該法的特點(diǎn)是快速、簡便、敏感、經(jīng)濟(jì)，是經(jīng)典的測試化學(xué)物質(zhì)或藥物致突變性實(shí)驗(yàn)[10]。染色體畸變分析是采用中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法進(jìn)行的。CHO 細(xì)胞在加或不加代謝活化系統(tǒng)的條件下，與受試物接觸一定時(shí)間后再于收集染色體4 h 前用秋水仙堿處理，使細(xì)胞的有絲分裂停止在中期相。然后收集細(xì)胞，經(jīng)低滲、固定、涂片和染色后，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的改變，檢測受試物的誘變性[7]。微核試驗(yàn)是檢測化合物對染色體損傷作用的重要方法。凡能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷的化合物，微核試驗(yàn)都可檢測[8]。

表3 WA 對 5 支菌株的回變菌落數(shù)試驗(yàn)結(jié)果 (個(gè)/皿，s)（第 2 次）

表3 WA 對 5 支菌株的回變菌落數(shù)試驗(yàn)結(jié)果 (個(gè)/皿，s)（第 2 次）

組別(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 5 000 38±5 34±5 20±5 21±5 128±24 105±26 179±21 189±19 20±4 20±3 500 39±7 34±3 21±2 20±7 108±13 92±28 192±16 187±30 16±3 19±4 50 38±9 30±3 19±3 18±1 117±14 102±5 197±5 196±22 17±3 18±1 5 37±8 29±4 18±2 17±1 111±5 98±33 206±24 191±21 16±1 20±2 0.5 35±6 33±8 24±2 23±3 107±7 97±8 203±6 193±10 15±4 15±4空白對照組 38±3 41±4 22±3 23±4 96±12 93±8 205±17 186±19 18±2 18±4溶劑對照組 38±3 37±8 22±3 23±4 98±7 100±12 202±15 197±10 18±2 19±4陽性對照組 881±18 876±35 900±11 1 077±111 964±113 996±8 1 024±37 1 011±8 392±8 392±22

表4 WA 對 24h 體外培養(yǎng) CHO 細(xì)胞的染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果 (+S9)

表5 WA 對 24h 體外培養(yǎng) CHO 細(xì)胞的染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果 (－S9)

表6 WA 對 4h 體外培養(yǎng) CHO 細(xì)胞的染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果 (－S9/4h)

表7 WA 對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

本研究采用遺傳毒性研究經(jīng)典組合的方法，分別從原核系統(tǒng)到真核系統(tǒng)，從體外試驗(yàn)系統(tǒng)到體內(nèi)試驗(yàn)系統(tǒng)，體外試驗(yàn)中包含了加與不加代謝活化系統(tǒng)，能檢測基因突變、染色體畸變等多個(gè)遺傳學(xué)終點(diǎn)，符合國際標(biāo)準(zhǔn)化的要求[5-6]。

本研究結(jié)果顯示，本試驗(yàn)條件下，采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法，WA 在每皿 5 000、500、50、5、0.5 μg 的受試劑量下，加或不加S9 時(shí)對組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌均無致突變性；對CHO 細(xì)胞，在23.74、47.48、94.96 μg/ml 3 個(gè)劑量組，加或不加 S9，于 24 h和48 h 誘發(fā)的細(xì)胞染色體畸變率均小于5%，與溶劑對照組結(jié)果相比較其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明 WA 在受試劑量下無致 CHO 細(xì)胞染色體畸變效應(yīng)；WA 在 100、200、400 mg/kg 3 個(gè)劑量下，對ICR小鼠的微核誘發(fā)率與溶劑對照組比較均無顯著差異，表明其在受試劑量下對ICR 小鼠無致微核效應(yīng)[14]。上述結(jié)果提示W(wǎng)A 沒有遺傳毒性和潛在致癌性。

此前有文獻(xiàn)表明WA 對小細(xì)胞肺癌的增殖有抑制作用，但對于遺傳毒性未見報(bào)道。本研究對降低WA 在研發(fā)過程中用于臨床試驗(yàn)和疾病治療的用藥風(fēng)險(xiǎn)發(fā)揮重要作用。