盧婷婷，王曼曼，陳 實，申金鈺，周 彤，鮑國連，陳 陽,3，吳信生,3

(1.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009;2.浙江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；3.農業(yè)與農產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇揚州 225009)

毛色是皮毛動物的重要經(jīng)濟性狀之一，也是一種可利用的遺傳標記，在人以及小鼠上已有研究[1-2]。獺兔，學名力克斯兔，因毛色眾多而著名，國內引進的主要有白色、青紫藍色、花色和海貍色等14種色型，深受消費者喜愛。已知哺乳動物的毛色主要決定于黑色素細胞產(chǎn)生的真黑素和褐色素之間的轉換,而黑色素的形成是多種不同的基因以及環(huán)境因素共同決定的[3-4]。

小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia associated transcription factor, MITF)在哺乳動物皮毛的黑色素形成中發(fā)揮重要作用，其起源于一種放射性誘導的突變小鼠，后代小鼠表現(xiàn)為小眼畸形，早發(fā)性耳聾，皮毛和虹膜色素減退。根據(jù)有關小鼠等的文獻報道，編碼不同蛋白異構體的MITF基因都由9個外顯子組成，2～9號外顯子序列是一致的，1號外顯子是不相同的[5]。MITF基因在黑色素細胞特異性表達中發(fā)揮了重要作用，并且參與多種細胞發(fā)育、分化和功能調節(jié)[6-7]。但在兔上，MITF不同可變剪接體對黑色素沉積的影響如何？目前尚未見相關報道。此外，有研究表明MITF可直接調控毛色相關基因的轉錄，包括TYR、TYRP-1和TYRP-2(DCT)等酪氨酸家族[8]。MITF可調控與黑素小體成熟及運輸密切相關的基因表達，包括GPNMB、PMEL-17等[9-10]。其中，GPNMB作為細胞粘附分子、黑素體蛋白、細胞表面受體和可溶性配體發(fā)揮重要作用[11]。PMEL-17基因的正常表達是淀粉樣纖維形成的關鍵，其表達受MITF基因的調控[12-13]。因此，本研究選取TYR、GPNMB、PMEL-17基因，來分析MITF不同可變剪接體的下游信號 通路。

不同的剪接位點產(chǎn)生不同的可變剪接體，可能具有不同的基因功能和蛋白質多樣性，基于此，本研究克隆MITF6種不同可變剪接體，通過檢測下游基因mRNA表達量和黑色素細胞中黑色素的沉積量來驗證不同可變剪切體對黑色素沉積的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗樣品 試驗選用購于江蘇揚州施橋兔場的2月齡獺兔，采集皮膚和脾臟組織于 -70 ℃保存。試驗細胞選擇揚州大學動物遺傳資源評價實驗室構建的兔黑色素細胞系[14]。

1.1.2 試驗試劑 總RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。DNA Ligation Kit Ver.2.1、E.coliDH5α感受態(tài)細胞、pMD-18T vector、限制性內切酶HindⅢ、NheⅠ和SacⅡ購自TaKaRa公司。FastQuant RT Kit、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQTMSYBR qPCR Mster Mix和Exfect 2000轉染試劑盒購自諾唯贊生物科技(南京)有限公司。Melanin購自Sigma公司。Phosphate Buffered Saline購自HyClone公司。胎牛血清、DMEM和M254培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1MITF不同可變剪接體CDS區(qū)擴增 從家兔皮膚、脾臟和黑色素細胞中提取總RNA，以混合樣為模板反轉錄合成cDNA第1鏈。根據(jù)NCBI上預測的兔MITF基因可變剪接體mRNA序列，使用primer 5.0軟件進行引物設計，引物序列見表1。50 μL的反應體系為10 μL Buffer、18 μL滅菌水、1 μL cDNA、上游和下游引物各 2 μL、1 μL DNA 聚合酶，完全混勻后按照程序進行PCR擴增?；厥誔CR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體上構建重組質粒，雙酶切鑒定后，選取陽性質粒送擎科生物技術(南京)有限公司測序。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.2 生物信息學分析 運用MEGA 6.0進行系統(tǒng)進化樹的構建，Bootstrap分析重復數(shù)為 1 000。通過PSORT Ⅱ Prediction軟件( https://psort.hgc.jp/form2.html) 進行亞細胞定位預測分析。

1.2.3 pEGFP-N1-MITF 質粒構建和細胞轉染 將pEGFP-N1質粒與構建好的pMD19-T- MITF X1、X2、X5和X6質粒同時進行Hind Ⅲ和SacⅡ雙酶切；pEGFP-N1質粒與pMD19-T-MITF X3、X4質粒同時進行Nhe1和SacⅡ雙酶切。酶切體系：限制性內切酶各1 μL，10×Quick Cut Buffer 5 μL，DNA 12 μL，滅菌水31 μL。酶切程序為37 ℃、15 min。通過電泳鑒定成功后，純化回收酶切后的目的條帶。將pEGFP-N1和MITFCDS雙酶切后的產(chǎn)物進行連接。反應體系：MITFCDS產(chǎn)物加入4 μL，pEGFP-N1產(chǎn)物加入1 μL，SolutionⅠ加入5 μL。置于200 μL PCR管中混合均勻。反應程序：16 ℃、30 min。制備pEGFP-MITF無內毒素質粒DNA并進行純化。將MITF不同可變剪接體重組質粒通過Exfect轉染試劑轉入黑色素細胞中，置于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后收取細胞。

表2 熒光定量引物Table 2 List of primer used in qRT-PCR

1.2.5 黑色素細胞含量測定 收集轉染24 h后的永生化黑色素細胞，加入1 mL 1 mol/L的NaOH溶解細胞，將全部溶液移入無菌的1.5 mL 離心管中，置于金屬浴中，80 ℃、1 h。使用酶標儀在500 nm和650 nm波長處進行吸光值測定。波長在500 nm處測得黑色素細胞中的總黑色素含量，在650 nm波長處測得黑色素細胞中的真黑色素的含量。使用黑色素標準品進行標準曲線的制作。每組樣品重復3次，根據(jù)測定的標準曲線最終算出細胞中的黑色素含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行定量分析，并以“平均數(shù)±標準差”表示，采用SPSS 22統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析。試驗組和對照組兩組數(shù)據(jù)之間進行成對二樣本t檢驗分析，P< 0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 MITF不同可變剪接體基因結構比較分析

根據(jù)NCBI預測的MITF可變剪接體序列設計引物，經(jīng)擴增共發(fā)現(xiàn)MITF基因的6種可變剪接體，分別命名為MITF X1、MITF X2、MITF X3、MITF X4、MITF X5和MITF X6。由圖1可以看出，6種MITF剪接體主要存在4個可變剪接位點，分別在第1外顯子(1～40 bp)處、第2外顯子(56 bp)處、第2外顯子(221 bp)和第7外顯子(882～899 bp)處。MITFmRNA前體在開始形成mRNA成熟體的過程中，第1～10外顯子正常剪接，形成MITF X1。MITF X2在第7外顯子處，缺失18 bp，發(fā)生外顯子遺漏；MITF X3與MITF X1相比，在第1外顯子5′端處(40 bp)存在1個65 bp高變區(qū)，發(fā)生可變5′端剪接；MITF X4與MITF X1相比，在第1外顯子5′端處(40 bp)存在1個65 bp高變區(qū)，發(fā)生可變5′端剪接，在第7外顯子(882～899 bp)處存在18 bp的缺失區(qū)，發(fā)生外顯子遺漏；MITF X5與MITF X1相比，缺失第1外顯子，第2外顯子5′端處缺失56 bp，發(fā)生外顯子遺漏；MITF X6與MITF X1相比，缺第1外顯子，第2外顯子5′端處(221bp)存在1個29 bp高變區(qū)。

白色框表示缺失堿基，灰色框代表不同堿基，黑色框表示相同堿基

2.2 MITF系統(tǒng)進化樹分析

將兔MITF基因與人、豬、羊、猩猩、羊駝、馬、犬、貓和雞的MITF基因序列輸入到MEGA 6.0軟件中，進行系統(tǒng)進化樹分析。由圖2可知，構建的進化樹大體分成兩支，家禽雞作為獨立一支，剩余的10個物種構成另一個獨立分支，家兔MITFX1～X6剪接體在其中的一個分支上，與人和猩猩的分子進化距離最近，表明親緣關系最 接近。

圖2 不同物種 MITF基因序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed for MITF genes of different species

2.3 MITF不同可變剪接體的亞細胞定位預測與驗證

利用PSORT Ⅱ在線軟件對MITF蛋白進行亞細胞定位的預測，結果顯示， MITF X1和MITF X2蛋白69.6%位于細胞核，13.0%位于細胞質，8.7%位于線粒體； MITF X3和MITF X4蛋白69.6%位于細胞核，13.0%位于線粒體，8.7%位于細胞質；MITF X5蛋白56.5%位于細胞核，21.7%位于細胞質，17.4%位于線粒體； MITF X6蛋白65.2%位于細胞核，17.4%位于細胞質，8.7%位于線粒體。MITF X1和 MITF X2蛋白亞細胞定位一致，主要定位在細胞核和細胞質，MITF X3和MITF X4蛋白亞細胞定位一致，主要定位在細胞核和線粒體， MITF X5和MITF X6蛋白主要定位在細胞核和細胞質。

將構建的MITFX1～X6的真核表達載體轉染永生化黑色素細胞，利用熒光顯微鏡觀察 (圖3)，顯示基本與預測結果相一致，主要表達在細胞核。

2.4 pEGFP-N1-MITF各可變剪接體真核表達載體構建

將擴增的MITF基因PCR產(chǎn)物進行切膠回收，并連接到pEGFP-N1表達載體，重組質粒經(jīng)轉化，X1、X2、X5、X6提取后經(jīng)HindⅢ和SacⅡ雙酶切，X3、X4提取后經(jīng)NheⅠ和SacⅡ雙酶切，根據(jù)電泳鑒定得到pEGFP-N1載體片段和MITFCDS目的片段，片段大小一致，表明質粒構建正確(圖4)。

2.5 RT-qPCR檢測下游基因mRNA表達量

利用熒光定量PCR檢測MITF不同可變剪接體對TYR、GPNMB、PMEL-17表達量的影響。結果顯示MITF X1～X3對TYR、GPNMB均有顯著增加(P<0.05)，MITF X4顯著增加GPNMB表達量(P<0.05)，MITF X2顯著增加PMEL-17表達量(P<0.05)，其他MITF剪接體形式的過表達對下游基因影響不顯著(P>0.05)(圖5)。說明MITF不同剪接體形式對黑色素沉積信號通路下游基因的作用不同。

2.6 酶標儀檢測黑色素含量變化

收集轉染后的黑色素細胞，堿裂解處理細胞，使用酶標儀測定黑色素細胞中總黑色素、真黑色素和褐黑色素的含量。黑色素含量測定發(fā)現(xiàn)，MITF X1～X6剪接體顯著增加黑色素細胞中總黑色素和真黑色素含量(P<0.05)，均可影響黑色素細胞黑色素沉積(圖6)。

A.pEGFP-N1- MITF X1;B.pEGFP-N1- MITF X2;C.pEGFP-N1- MITF X3;D.pEGFP-N1- MITF X4; E.pEGFP-N1- MITF X5; F.pEGFP-N1- MITF X6;G.pEGFP-N1;1.熒光；2.明場

圖4 pEGFP-N1-MITF各剪接體雙酶切鑒定結果Fig.4 Double restriction enzyme digestion of products of plasmids of different pEGFP-N1-MITF splicing

3 討論與結論

哺乳動物毛色與黑色素密切相關，黑色素的產(chǎn)生和成熟是一個復雜的調控過程，受許多基因的影響，其中MITF基因對黑素細胞作用和黑素合成具有重要調控作用[15-16]。目前，在人、小鼠、綿羊、羊駝、大鼠、倉鼠、雞、鵪鶉和斑馬魚等動物已成功克隆出MITF基因，這些序列同源性較高，特別是MITF的bHLHZip結構區(qū)、2個活化區(qū)和MAPK靶序列(MITF的作用位點)[17]。在本研究中，成功克隆兔MITF基因的6個可變剪接體，通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，兔MITF基因與馬、綿羊和犬等哺乳動物的進化距離較近，其次與人、猩猩相近，與非哺乳動物雞的進化距離較遠。說明MITF基因在生物進化上具有保守性，同時也體現(xiàn)MITF基因在生物體上具有的重要的功能性和在不同物種的結構穩(wěn)定性。目前關于家兔MITF基因不同可變剪接體的研究較少，調控黑色素細胞以及黑色素的合成是何種可變剪接體在發(fā)揮作用仍不清楚。

A.TYR基因；B.GPNMB基因；C. PMEL-17基因；**表示P<0.01，差異極顯著；*表示P<0.05，差異顯著

**表示P<0.01，差異極顯著；*表示P<0.05，差異顯著

基于此，本試驗根據(jù)NCBI預測數(shù)據(jù)與已有文獻報道，設計MITF編碼區(qū)特異性引物，采用RT-PCR結合TA克隆測序的方法，鑒定兔MITF基因的6種可變剪接體，分別命名為MITF X1、MITF X2、MITF X3、MITF X4、MITF X5和MITF X6(GenBank登錄號：MK801776、MK825547、MK85548、MK825549、MK825550 和MK825551)。利用軟件對MITF不同可變剪接體翻譯的蛋白進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)不同可變剪接體的蛋白都主要位于細胞核，少量位于細胞質和線粒體，其中MITF X5蛋白位于細胞核的比例最小。通過構建過表達載體轉染到黑色素細胞中，發(fā)現(xiàn)MITF主要在細胞核中表達，與預測結果相一致，這也與MITF轉錄因子的特性相符，主要在細胞核中發(fā)揮作用。

為了進一步探究不同可變剪接體對黑色素沉積的作用，構建不同可變剪接體的過表達載體。已知MITF參與色素沉著過程是直接作用于基因的轉錄調節(jié)，如MITF基因可激活酪氨酸酶基因家族(TYR、TYRP1和TYRP2)，通過與它們的啟動子相結合來調控它們在黑色素細胞中特異性表達，同時能參與外界刺激對黑色素細胞中黑素生成的調控，進而來參與黑色素生成的調控[18-19]。因此，本研究利用熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)MITF X1～X3過表達顯著增加TYR、GPNMB的mRNA表達量，其他MITF剪接體的過表達對下游基因影響不顯著，提示不同剪接形式對黑色素沉積信號通路下路基因的作用并不相同；同時黑色素含量測定發(fā)現(xiàn)，MITF X1～X6剪接體顯著增加了黑色素細胞中總黑色素和真黑色素含量，表明MITFN端的剪接變化并不影響黑色素沉積功能。

綜合而言，MITFN端的剪接變化并不影響黑色素沉積功能，但不同剪接體的下游信號通路存在差異。該結果有助于清晰兔MITF不同可變剪切體對黑色素沉積的影響，為我們更科學、更精準地進行獺兔的毛色選育提供了理論依據(jù)。