汪方圓，張耀鴻，饒旭東，謝晴，賈仲君

（1.南京信息工程大學(xué)氣象災(zāi)害預(yù)報(bào)預(yù)警與評(píng)估協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省農(nóng)業(yè)氣象重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210044；2.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210008）

氧化亞氮（N2O）是三大溫室氣體之一，根據(jù)IPCC的評(píng)估報(bào)告，單位質(zhì)量N2O 的百年尺度增溫潛勢(shì)是單位質(zhì)量CO2的265 倍，對(duì)全球變暖的貢獻(xiàn)約為6%[1]。目前大氣中N2O 濃度為324 μg·L-1，并在過去30 a 中以0.73 μg·L-1·a-1的速度穩(wěn)定增長(zhǎng)，對(duì)全球氣候和大氣環(huán)境造成嚴(yán)重威脅，引起了人們對(duì)其源和匯的高度關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)業(yè)土壤是全球范圍內(nèi)最主要的N2O 來源，占人類活動(dòng)排放量的44%[2]。迄今，有關(guān)不同地域、不同作物類型及不同農(nóng)藝措施下的農(nóng)田土壤N2O 排放通量方面已有大量研究報(bào)道[3]。然而，排放通量中的N2O 是土壤中N2O 產(chǎn)生過程和還原過程綜合作用的動(dòng)態(tài)凈變量，反映不出土壤的N2O 還原潛力。因此，充分了解農(nóng)田土壤N2O 最大還原潛力及影響因素對(duì)于全球N2O的減排具有重要意義。

N2O的生物合成途徑以硝化和反硝化過程為主，而N2O的還原消耗過程卻只有一個(gè)，即土壤微生物在氧化亞氮還原酶基因（nosZ）的催化下將N2O還原為N2的生物過程[4]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，完全反硝化細(xì)菌具有將NO-3還原為N2的全部基因，包括nosZ基因，其呼吸過程是N2O消耗的主要原因。近來的研究顯示，一些非反硝化細(xì)菌和古菌具有以N2O為唯一電子受體而生長(zhǎng)的能力，表明具有N2O還原能力的微生物不局限于反硝化細(xì)菌范圍，遠(yuǎn)比人們預(yù)期要豐富得多[5]。Sanford 等[6]和Jones 等[7]報(bào)道，除了存在于完全反硝化細(xì)菌的典型nosZ 基因（簡(jiǎn)稱為nosZ Ⅰ）之外，還存在一種新型的非典型nosZ 基因（簡(jiǎn)稱為nosZ Ⅱ），普遍存在于各種生態(tài)系統(tǒng)土壤生境中。與攜帶nosZ Ⅰ的完全反硝化微生物相比，具有nosZ Ⅱ基因的微生物在分類學(xué)上更加多樣化，且絕大部分為非完全反硝化微生物，即只具有N2O還原能力而缺失N2O 產(chǎn)生功能[6-7]，表明它們是一個(gè)更為廣泛的微生物類群，這些微生物可能在全球N2O還原過程中發(fā)揮著重要作用。

圍墾是一種重要的土地利用方式，將濱海灘涂圍墾改為農(nóng)田是解決我國(guó)土地問題的有效途徑之一。根據(jù)中國(guó)國(guó)家海洋局的海洋功能區(qū)劃報(bào)告，2011—2020 年間中國(guó)東部沿海地區(qū)圍墾面積達(dá)到2 469 km2。崇明東灘濕地是我國(guó)長(zhǎng)江口發(fā)育最完善的河口型灘涂濕地；自解放初至今，開展了多次圍墾造田工程，形成了一系列不同圍墾年限的圍墾稻田。圍墾后的濕地不再受潮汐的影響，與近海間的物質(zhì)能量交換基本消失。其后的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)使圍墾區(qū)生境發(fā)生顯著變化[8-9]。這種土地利用方式改變了土壤生物地球化學(xué)過程，對(duì)土壤N2O 還原潛力可能會(huì)產(chǎn)生深刻影響。盡管有關(guān)該濱海濕地的反硝化過程研究已有大量報(bào)道，但是從N2O 凈還原潛力角度研究濱海土壤N2O“源”或“匯”的報(bào)道十分鮮見。圍墾改稻田后土壤中攜帶nosZ Ⅰ或nosZ Ⅱ基因的兩類微生物如何變化？其對(duì)N2O 還原潛力有何影響？這些科學(xué)問題的探索對(duì)于深入了解圍墾工程的生態(tài)效應(yīng)至關(guān)重要。

基于此，本試驗(yàn)選取崇明東灘區(qū)域不同圍墾年限的稻田為研究對(duì)象，以空間替代時(shí)間變化的方法，研究不同圍墾年限條件下土壤N2O 還原潛力的空間變異特征，分析功能基因的數(shù)量特征，探明其與N2O 還原潛力的相關(guān)性，為合理評(píng)估我國(guó)沿海地區(qū)圍墾造田的生態(tài)效應(yīng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土樣采自上海市崇明島東灘濕地和圍墾區(qū)稻田（121.80° E，31.60° N），所屬氣候是典型的亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫為15.3 ℃，降水量為1 004 mm。崇明島東灘濕地位于崇明島最東端，保護(hù)區(qū)內(nèi)為自然濕地，保護(hù)區(qū)以西為一系列不同圍墾種稻年限的稻田。本研究選取保護(hù)區(qū)內(nèi)低位光灘自然濕地，作為圍墾0 a 的原生態(tài)樣點(diǎn)，以WK0 表示。在圍墾區(qū)選取4處不同圍墾年限，即圍墾種稻19 a（WK19）、27 a（WK27）、51 a（WK51）、86 a（WK86）的稻田進(jìn)行研究。不同圍墾年限樣點(diǎn)根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)選取[10]。該區(qū)域農(nóng)田為稻麥輪作方式，農(nóng)田管理措施基本一致。2017年7月中旬采集樣品，在每個(gè)圍墾稻田樣區(qū)中先選取50 m×50 m 的采樣區(qū)，然后在采樣區(qū)內(nèi)以S形走線，沿線按照10～15 m 的間隔在水稻行間確定6個(gè)采樣點(diǎn)，以提高樣品的代表性。用土鉆取0～20 cm耕層鮮土，將該6 個(gè)采樣點(diǎn)的土壤均勻混合成1 個(gè)樣本，重復(fù)3 次。土樣裝入冰盒內(nèi)迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。

1.2 土樣理化性質(zhì)測(cè)定

土壤總有機(jī)碳采用濃硫酸-重鉻酸鉀消煮-硫酸亞鐵滴定法測(cè)定；土壤全氮含量采用半微量凱氏定氮法測(cè)定；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮用2 mol·L-1KCl溶液浸提后，采用AA3 流動(dòng)分析儀測(cè)定；土壤pH 采用水土比為2.5∶1提取后，用數(shù)字酸度計(jì)測(cè)定；土壤硫酸根含量采用離子色譜法測(cè)定；土壤可溶性鹽度（EC）采用電導(dǎo)法用EC計(jì)測(cè)定。

1.3 N2O還原速率測(cè)定

采用厭氧培養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。稱取2.00 g 鮮土放入12 mL 的Labco 頂空瓶后加入2 mL 過0.45 m 濾膜的滅菌去離子水，用高密橡膠塞密閉瓶口，振蕩5 min 形成均勻泥漿。用真空泵抽真空后置換高純氬氣，反復(fù)操作3 次以達(dá)到嚴(yán)格厭氧狀態(tài)。預(yù)培養(yǎng)3 d，以盡可能去除瓶?jī)?nèi)殘余氧的影響。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，再進(jìn)行抽真空-充氬氣3 次，然后在頂空氣體中置換500 μL N2O，室溫25 ℃避光條件下厭氧培養(yǎng)6 d，期間從0時(shí)刻開始每24 h用100 μL微量采樣器采氣，氣體樣品采集后立即補(bǔ)入相同量的高純氬氣以保證瓶?jī)?nèi)氣壓平衡。采集的氣體用裝有電子捕獲檢測(cè)器（ECD）的氣相色譜儀（Agilent 7890）分析N2O 濃度。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的瓶?jī)?nèi)頂空N2O 濃度值進(jìn)行線性回歸，計(jì)算出厭氧培養(yǎng)期間的平均N2O還原速率。

1.4 相關(guān)基因豐度測(cè)定

將野外采集的原狀鮮土冷凍干燥后，采用FastDNA Spin Kit for Soil 試劑盒（MP Biomedicals，美國(guó)）提取土壤微生物基因組DNA。稱取0.5 g土樣，按照說明書的步驟提取土壤微生物總DNA，溶解于100 μL 無菌TE 緩沖液（10 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0）。通過微量紫外分光光度計(jì)（Nano?Drop ND-1000，美國(guó)）測(cè)定DNA 濃度和純度，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，滿足條件后用于qPCR分析。

實(shí)時(shí)PCR 擴(kuò)增所用儀器為CFX96 Real-Time PCR System（Bio-Rad 公司）。標(biāo)準(zhǔn)曲線分別用含16S rRNA 、nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ基因的質(zhì)粒為模板，并將其連續(xù)稀釋8 個(gè)數(shù)量級(jí)配制。定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，包括：10 μL 的SYBR Premix EX TaqTM，1.0 μL 土壤總DNA 模板，上、下游引物（10 pmol·μL-1）各0.5 μL，加滅菌水至20 μL。16S rRNA 基因和nosZ 基因PCR 引物及qPCR 的循環(huán)條件見表1。所有樣品重復(fù)3次，并采用滅菌雙蒸水代替DNA作為反應(yīng)模板設(shè)置陰性對(duì)照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。N2O還原速率、基因拷貝數(shù)的差異性比較采用單向方差分析和最小差值法。N2O 還原速率與功能基因豐度、土壤理化性質(zhì)的關(guān)系采用線性回歸分析擬合。圖形制作采用Excel 2016和Origin 9.5軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)變化特征

圍墾稻田土壤總有機(jī)碳含量（TOC）在9.54～18.34 g·kg-1，顯著高于未圍墾的光灘濕地，且隨圍墾年限增加而顯著增加（表2）。圍墾19.51 a，稻田與光灘濕地的土壤總氮含量（TN）沒有達(dá)到顯著差異。圍墾27、51 a 和86 a 的稻田土壤含量顯著高于圍墾19 a的稻田和光灘濕地（P＜0.05）。圍墾稻田土壤含量在8.86～18.67 mg·kg-1，隨圍墾年限增加而顯著增加（P＜0.05）。光灘濕地土壤pH 值濃度和EC 值均顯著高于圍墾稻田（P＜0.05），且在圍墾稻田中這些指標(biāo)均隨圍墾年限增加而呈逐漸下降的趨勢(shì)。

表1 qPCR引物及循環(huán)條件Table 1 List of primers and thermal cycling conditions used for16S rRNA and nosZ clade Ⅰand Ⅱgenes

2.2 土壤N2O還原速率

本培養(yǎng)試驗(yàn)中，培養(yǎng)瓶密閉氣體中N2O 的起始濃度約為6×104μmol·mol-1，如此高濃度的氣體底物可以反映出土壤的最大N2O 還原潛力。隨后，水稻土上層密閉空間中的N2O 濃度隨著厭氧培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。將氣體濃度變化與培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行回歸分析，可計(jì)算出培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的平均N2O 還原速率。結(jié)果顯示，土樣WK0、WK19、WK27、WK51和WK86 的N2O 消耗速率分別為16.08、21.16、23.08、22.46 μg N2O·g-1·d-1和25.47 μg N2O·g-1·d-1（圖1）。與光灘濕地（WK0）相比，圍墾植稻86 a 的稻田土壤N2O 消耗速率增加了58.4%，顯著高于光灘濕地（P＜0.05）。圍墾19、27、51 a 的稻田N2O 消耗速率無顯著差異，但均顯著高于光灘濕地（P＜0.05），分別比光灘濕地N2O消耗速率高出31.6%、43.5%和39.6%。

表2 不同圍墾年限土壤的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of soils with different reclamation years

2.3 功能基因nosZ及細(xì)菌16S rRNA豐度變化

圖2 顯示，N2O 還原功能基因nosZ Ⅰ拷貝數(shù)隨圍墾年限增加而顯著增加（P＜0.05），其中圍墾86 a的稻田土壤nosZ Ⅰ拷貝數(shù)為1.72×108copies·g-1，比光灘濕地（WK0）和圍墾19 a 的稻田（WK19）高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。nosZ Ⅱ基因拷貝數(shù)在光灘濕地和圍墾19 a土樣之間差異不顯著，且均顯著低于圍墾27、51 a和86 a稻田土壤（P＜0.05），其中圍墾86 a的稻田土壤nosZ Ⅱ拷貝數(shù)為4.36×108copies·g-1，比WK0和WK19土壤高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，5 個(gè)土樣的nosZ Ⅰ/nosZ Ⅱ比值范圍為0.39～3.03，表明兩種類型的功能基因在各個(gè)土樣中所占比例各異，但基本處于同一個(gè)數(shù)量級(jí)。不同圍墾年限水稻土的細(xì)菌16S rRNA 基因豐度均存在顯著差異，表現(xiàn)出隨圍墾年限增加而增加的趨勢(shì)，其中圍墾86 a 的稻田土壤16S rRNA 基因拷貝數(shù)最高，為7.88×1010copies·g-1。

圖1 不同采樣點(diǎn)土壤N2O還原速率Figure 1 N2O reduction rate of different treatments

圖2 不同土樣中nosZ Ⅰ、nosZ Ⅱ和16S rRNA的基因豐度差異Figure 2 nosZ Ⅰ，nosZ Ⅱand 16S rRNA gene abundance in different soil samples

2.4 功能基因nosZ與N2O還原速率的相關(guān)性分析

對(duì)功能基因nosZ Ⅰ、nosZ Ⅱ與N2O 還原速率進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明，N2O 消耗速率與這兩種基因拷貝數(shù)均呈正相關(guān)關(guān)系（圖3），說明相關(guān)微生物的功能基因豐度很大程度上決定了土壤N2O 消耗能力。其中功能基因nosZ Ⅰ拷貝數(shù)與N2O 消耗速率的相關(guān)性達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明功能基因nosZ Ⅰ的豐度可能是土壤N2O 消耗能力的決定性因素。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，功能基因nosZ Ⅰ、nosZ Ⅱ拷貝數(shù)隨圍墾年限增加而明顯增加，其增加速率分別為1.6×106copies·g-1·a-1和4.4×106copies·g-1·a-1，功能基因nosZⅡ表現(xiàn)出更高的增長(zhǎng)速率。

2.5 土壤N2O還原速率與土壤性質(zhì)的回歸分析

土壤N2O 還原速率與土壤TOC 的回歸方程達(dá)到顯著水平，說明土壤TOC是影響N2O還原速率非常重要的環(huán)境要素（表3）。相反，土壤TN、卻與N2O還原速率沒有達(dá)到顯著水平，可能與本試驗(yàn)中提供高濃度的N2O 底物，進(jìn)而不再受土壤本底N 水平影響有關(guān)。值得注意的是，土壤pH、EC與N2O還原速率呈負(fù)相關(guān)，且回歸方程均達(dá)到了極顯著水平。這3 項(xiàng)土壤指標(biāo)均為海洋性特征指標(biāo)，隨圍墾植稻年限增加而明顯下降，而N2O還原速率卻顯著增加，說明圍墾植稻生態(tài)工程極大促進(jìn)了圍墾土壤的N2O還原潛力。

2.6 冗余分析

采用冗余分析（RDA）反映基因豐度與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系。排序圖前兩軸分別解釋了基因豐度變異程度的51.4%和13.2%（圖4）。5 個(gè)土樣處于不同的位點(diǎn)，土壤pH、EC、SO2-4均與TN 呈負(fù)相關(guān)。nosZ Ⅰ、nosZ Ⅱ和16S rRNA基因豐度與土壤TN表現(xiàn)為正相關(guān)，其中nosZ Ⅱ基因豐度與土壤TN 的相關(guān)性最高。這3 個(gè)基因的豐度均與土壤pH、EC、SO2-4呈負(fù)相關(guān)，表明這些功能基因隨著土壤海洋性特征指標(biāo)逐漸減小，隨圍墾植稻年限增加而明顯增加。

圖3 N2O還原速率與功能基因豐度的關(guān)系Figure 3 Relationship between N2O reduction and gene abundance

圖4 環(huán)境因子對(duì)基因豐度影響的冗余分析Figure 4 Redundancy analysis between soil properties and gene abundance

表3 土壤N2O還原速率與土壤理化性質(zhì)的回歸方程Table 3 Regression relationship between N2O reduction rate（y）and soil characteristics（x）

3 討論

圍墾造田的土地利用方式對(duì)濱海表層土壤的理化性質(zhì)產(chǎn)生了深刻的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，表層土壤的pH 值、濃度和EC 值均表現(xiàn)為濱海自然濕地顯著高于圍墾稻田（P＜0.05），且隨圍墾年限增加而呈逐漸下降趨勢(shì)。圍墾之后圍墾區(qū)土壤不再受到海水潮汐的影響，其脫鹽化過程加速，這種現(xiàn)象在本試驗(yàn)區(qū)和杭州灣濱海區(qū)均有報(bào)道[10-11]；而且受到農(nóng)業(yè)施肥的影響，圍墾區(qū)土壤pH 值下降明顯。Chen 等[12]報(bào)道杭州灣濱海濕地被圍墾造田700 a 后土壤pH 值下降至6.3，與本研究結(jié)果的變化趨勢(shì)一致。另一方面，圍墾區(qū)土壤TOC 顯著高于光灘濕地，且隨圍墾年限增加而顯著增加。Davidson 等[13]認(rèn)為濱海濕地土壤的有機(jī)碳不易被土壤礦物質(zhì)所固定，導(dǎo)致在干濕交替過程中被快速分解。相反，圍墾之后的農(nóng)田土壤，土壤孔隙水動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，且有大量農(nóng)作物有機(jī)碳輸入土壤中，易形成土壤團(tuán)聚體或有機(jī)-礦物交聯(lián)體，可通過物理保護(hù)、化學(xué)固定方式提高土壤有機(jī)碳的固持作用[14]。在此過程中，土壤的全N 和活性N 也會(huì)相應(yīng)增加。這種圍墾造田進(jìn)程中土壤理化性質(zhì)的變化可能會(huì)顯著影響該區(qū)域濕地土壤的N2O還原過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)瓶頂空氣體中N2O 濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而出現(xiàn)明顯的下降，表明所試土樣都具備還原消耗N2O 的能力，與王玲等[15]的報(bào)道一致。本試驗(yàn)的培養(yǎng)條件為淹水厭氧培養(yǎng)，厭氧反硝化作用可能是調(diào)控土壤N2O 還原消耗的重要過程。在此過程中，活性碳源供應(yīng)可促進(jìn)反硝化微生物的呼吸作用，進(jìn)而促進(jìn)土壤N2O 的還原消耗過程[16-17]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤N2O 還原潛力與土壤pH、EC 值和濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），而與土壤TOC呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明圍墾引起的土壤理化性質(zhì)的改變可能是導(dǎo)致N2O 還原潛力發(fā)生演替性變化的重要原因。而且，土壤N2O 還原潛力隨圍墾年限增加而顯著增強(qiáng)，表明圍墾造田提高了濱海濕地土壤的N2O 還原潛力，可能成為大氣N2O的匯。

參與N 循環(huán)的微生物類群中能夠產(chǎn)生N2O 的途徑有很多，然而只有nosZ 基因編碼的氧化亞氮還原酶才能催化將N2O 還原成N2的過程[18]。典型的nosZ基因（nosZ Ⅰ）主要存在于完全反硝化菌類群中，以變形細(xì)菌為主，它們的反硝化基因鏈完整，具有產(chǎn)生N2O 的基因（nirS/nirK）[19]。而新近發(fā)現(xiàn)的非典型nosZ基因（nosZ Ⅱ）存在于更為多樣的微生物類群中，如Firmicutes、Bacteroidetes、Chloroflexi門和變形細(xì)菌等，絕大多數(shù)為非完全反硝化微生物，缺少nirS/nirK 基因，目前被普遍認(rèn)為是消耗N2O 的更為廣泛的貢獻(xiàn)者[4]。本試驗(yàn)定量PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，還原N2O 的功能基因nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ拷貝數(shù)為2.2×107～4.36×108copies·g-1，隨著圍墾年限增加而明顯增加，說明功能基因nosZ 數(shù)量增加是土壤N2O 還原潛力增大的微生物學(xué)機(jī)理之一。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，功能基因nosZ Ⅰ豐度與土壤N2O 還原速率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明功能基因nosZ Ⅰ對(duì)N2O 消耗還原能力演替性變化的貢獻(xiàn)可能高于nosZ Ⅱ。Francisco 等[20]對(duì)荷蘭Schiermonnikoog 島上一系列不同發(fā)育時(shí)間的濱海濕地土壤進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)nosZ Ⅰ基因的豐度比nosZⅡ高出10 倍左右，是消耗N2O 的主要貢獻(xiàn)者。他們還發(fā)現(xiàn)nosZ Ⅰ基因豐度變化與濱海濕地土壤的化學(xué)性質(zhì)（SOC、TN、）高度相關(guān)，而nosZ Ⅱ基因豐度則與土壤物理性質(zhì)（砂粒、粉粒、黏粒）顯著相關(guān)。本試驗(yàn)中，nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ基因豐度均表現(xiàn)為與土壤pH、EC、呈負(fù)相關(guān)，而與土壤TN 呈正相關(guān)且相關(guān)度最大。推測(cè)TN可能是調(diào)控其空間變異的最主要因素，說明在濱海濕地N 水平相對(duì)匱乏的環(huán)境中，土壤N 庫(kù)及活性N 供應(yīng)可能是導(dǎo)致N2O 還原微生物數(shù)量發(fā)生演替變化的決定性因素。Kearns 等[21]對(duì)長(zhǎng)期遭受N 負(fù)荷的Sippewissett 濱海濕地進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)外源N 高輸入?yún)^(qū)的nosZ Ⅰ基因拷貝數(shù)比對(duì)照區(qū)高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，且nosZ Ⅰ基因的多樣性指數(shù)（Shannon Index）和豐富度指數(shù)（Chao 1 Richness）隨著N 供應(yīng)的增加而顯著增加。而且有研究認(rèn)為，攜帶nosZ Ⅰ基因的完全反硝化菌更偏好于定殖在植物根區(qū)微域[22]。這暗示了本試驗(yàn)中圍墾區(qū)水稻生長(zhǎng)可促進(jìn)nosZ Ⅰ型反硝化微生物的定殖生長(zhǎng)，從而促使nosZ Ⅰ基因在圍墾區(qū)稻田N2O還原過程中發(fā)揮更重要的作用。

也有研究發(fā)現(xiàn)nosZ Ⅱ基因在濱海濕地環(huán)境中分布廣泛，且豐度遠(yuǎn)高于nosZ Ⅰ基因[23]，在N 轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮更重要的作用。而且，nosZ Ⅱ型微生物的N2O半飽和常數(shù)（Ks）明顯低于nosZ Ⅰ微生物，表現(xiàn)出對(duì)N2O 更強(qiáng)的還原能力，在控制N2O 排放方面可能更為突出[24]。Domeignoz-Horta 等[25]發(fā)現(xiàn)，與nosZ Ⅰ種群相比，nosZ Ⅱ群落豐度及N2O轉(zhuǎn)化率更容易受到農(nóng)田耕作制度和管理措施的影響。本試驗(yàn)中，圍墾植稻背景下，nosZ Ⅱ功能基因豐度的年增長(zhǎng)率為nosZ Ⅰ功能基因的2.8 倍，說明nosZ Ⅱ功能基因?qū)鷫ㄖ驳镜捻憫?yīng)度更高，在圍墾區(qū)稻田土壤的N2O 還原消耗過程中可能也發(fā)揮著重要作用。值得注意的是，DNA 水平上的nosZ 基因數(shù)量并不能完全代表土壤微生物的N2O 還原活性，為探明nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ兩類基因?qū)ν寥繬2O 消耗能力的貢獻(xiàn)，可以從mRNA 水平上進(jìn)行深入研究。

需要指出的是，稻田土壤N轉(zhuǎn)化過程及相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)受到許多因素的影響，如耕作制度、施肥量及種類、水稻發(fā)育期、秸稈還田等。本研究結(jié)果僅能代表特定稻區(qū)內(nèi)特定生長(zhǎng)發(fā)育期的耕層土壤N2O 還原潛勢(shì)與功能菌群變化。在此基礎(chǔ)上，需要通過設(shè)置更加細(xì)化的田間試驗(yàn)和室內(nèi)模擬培養(yǎng)，進(jìn)行深入研究圍墾區(qū)典型稻田土壤N轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵過程，為科學(xué)評(píng)估濱海圍墾造田的生態(tài)效應(yīng)和我國(guó)稻田溫室氣體減排提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）潮灘濕地圍墾造田的土地利用方式，顯著增加了耕層土壤TOC和含量，降低了土壤pH值、EC值和含量，促進(jìn)了土壤的N2O還原潛力。

（2）隨著圍墾植稻年限的增長(zhǎng)，土壤N2O 還原的功能基因nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ數(shù)量大幅度增加；其中，功能基因nosZ Ⅰ是耕層土壤N2O 還原速率發(fā)生演替性變異的主要貢獻(xiàn)者。

致謝：在本試驗(yàn)的野外采樣過程中，上海崇明東灘濕地自然保護(hù)區(qū)給予了大力支持和協(xié)助，在此表示衷心感謝！