王晨驕，陳穎，李蕾，郭嘉航，唐光美，官會林，黃晶心

（云南師范大學(xué)高原特色中藥材種植土壤質(zhì)量演變退化與修復(fù)云南省野外科學(xué)觀測研究站，昆明650500）

苯酚是石油化工、塑料生產(chǎn)、醫(yī)藥合成等行業(yè)的原料，具有長效性和生物積累性，是工業(yè)生產(chǎn)中的主要污染物之一，目前世界范圍內(nèi)均普遍存在農(nóng)田苯酚污染的情況[1]。苯酚等土壤有機污染物可以被植物的根系吸收并由蒸騰拉力輸送到作物地上部位，影響農(nóng)作物的生長和品質(zhì)[2]，例如：土壤污染可導(dǎo)致甘薯中苯酚含量增加48%以上[3]，高濃度苯酚將嚴(yán)重限制植物的生長[2]。禾谷鐮刀菌是多種糧食作物的致病菌，導(dǎo)致農(nóng)作物的根腐、莖腐、萎蔫等，造成玉米、水稻大量減產(chǎn)，有些年份甚至導(dǎo)致減產(chǎn)70%以上[4]。并且隨著污染的持續(xù)增加，土壤苯酚污染和鐮刀菌病害同時發(fā)生的概率必然增加。

多數(shù)傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法例如淋洗法、熱脫附法、化學(xué)氧化法雖能修復(fù)苯酚污染土壤，但此類方法破壞土壤質(zhì)地，影響農(nóng)業(yè)土壤的可耕作性，并且修復(fù)費用高昂，不適于農(nóng)田土壤苯酚污染的修復(fù)[5-6]?；瘜W(xué)農(nóng)藥雖可有效控制禾谷鐮刀菌病害的發(fā)生，但化學(xué)農(nóng)藥的生產(chǎn)、存儲、使用等環(huán)節(jié)存在明顯的環(huán)境、健康風(fēng)險，目前部分歐美國家已加大對化學(xué)農(nóng)藥使用的管控，禁用部分風(fēng)險較大、難降解化學(xué)農(nóng)藥的使用[7]。微 生 物 如 紅 球 菌（Rhodococcussp.）[8]、假 單 胞 菌（Pseudmonassp.）[9]等具有動植物所不具備的代謝途徑，可快速降解土壤中的苯酚，部分種類的紅球菌屬微生物其苯酚的降解效率最高可達80%～100%[8]。苯酚降解菌可以苯酚作為碳源進行生命活動，在降解苯酚的同時避免對環(huán)境形成二次污染，具有綠色環(huán)保的特點[10]。微生物可通過競爭抑制、分泌抗生素等方式抑制其他微生物的生長，目前被廣泛研究用于制備生物防治藥劑、提取活性物質(zhì)等[11]，生防菌可有效防控糧食作物如馬鈴薯和玉米[12]的鐮刀菌病害。由于代謝的復(fù)雜性，部分微生物可同時具備多種生物學(xué)功能，例如紅球菌屬微生物同時具有降解單環(huán)和雙環(huán)芳烴化合物的功能[13]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）不僅能降解苯酚，也可促進植物生長[14]。據(jù)上述背景推測存在可同時降解苯酚和抑制其他微生物生長的微生物，但目前該方面的研究報道較少。

本研究擬通過微生物學(xué)方法，從高濃度苯酚污染土壤中富集、篩選高活性苯酚降解菌，并從得到的苯酚降解菌中篩選具備抑制禾谷鐮刀菌的“多功能菌”，通過分子生物學(xué)法對其進行初步鑒定，進一步通過溫室栽培試驗驗證其降解苯酚、防治禾谷鐮刀菌病害功能，為苯酚污染修復(fù)、禾谷鐮刀菌病害防治提供有潛力的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 苯酚降解菌的篩選

1.1.1 土壤樣品的采集及處理

采集昆明市郊某紙品廠排污渠中的10 個黑色沉積物樣品100 g，仔細(xì)清除樣品中的雜物后混合均勻，帶回實驗室常溫保存并盡快用于后續(xù)研究。

1.1.2 苯酚降解菌的富集培養(yǎng)

本研究通過往LB液體培養(yǎng)基中添加苯酚制備富集培養(yǎng)基，LB 培養(yǎng)基的基本成分為：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母浸出粉5 g·L-1、NaCl 5 g·L-1，pH 值7.0。進一步通過在LB 培養(yǎng)基中添加不同量的苯酚形成100、200、400、800 mg·L-1苯酚濃度梯度，采用該培養(yǎng)基通過逐級富集方法富集土壤樣品中的苯酚降解菌。具體做法為：取上述土壤樣品1 g 接種于苯酚含量為100 mg·L-1的培養(yǎng)基200 mL 中，25 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d后取1 mL培養(yǎng)液接種于200 mg·L-1苯酚培養(yǎng)基中，后續(xù)培養(yǎng)過程所用方法與上述過程相同。于800 mg·L-1苯酚培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)的菌液用于后續(xù)篩選過程。

1.1.3 苯酚降解菌的篩選、純化、優(yōu)選

使用苯酚篩選培養(yǎng)基篩選上述富集培養(yǎng)基中的苯酚降解菌，苯酚篩選培養(yǎng)基成分如下：K2HPO40.40 g·L-1、KH2PO40.20 g·L-1、NaCl 0.10 g·L-1、MgSO40.10 g·L-1、MnSO4·H2O 0.01 g·L-1、（NH4）2SO40.40 g·L-1、苯酚0.50 g·L-1。苯酚降解菌的篩選方法具體步驟為：將上述富集培養(yǎng)液通過梯度稀釋法稀釋為10-4，通過平板涂布法將稀釋液均勻地涂布到苯酚篩選培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)5 d后挑取菌落較大、生長旺盛的菌落進行2 次純化，純化得到的菌株在苯酚培養(yǎng)固體基中通過相同培養(yǎng)方法優(yōu)選生長旺盛的9 種菌株用于后續(xù)生防效果研究。

1.1.4 同時具備苯酚降解和生防功能的“多功能菌”篩選

本研究針對幾種糧食作物主要的致病菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），通過平板對峙法篩選能夠抑制該種致病菌的菌株。具體步驟為：將浸有生防菌液的濾紙放在平板上靜置30 min，用5 mm 直徑打孔器將鐮刀菌菌餅置換入平板中央，培養(yǎng)5 d 后測量抑菌圈的大小。將其中抑菌活性最高的3 種菌分別命名為PBC01、PBC02、PBC03 用于后續(xù)研究。本研究按照以下方法計算上述3種菌株的抑菌率：

抑菌率=（對照組指示菌菌落直徑-處理組指示菌菌落直徑）/（對照組生防菌菌落直徑-濾紙直徑）×100%。

將上述具有生防功能的3 種菌接種于200 mL 苯酚濃度為500 mg·L-1的苯酚培養(yǎng)基中，菌種的接種量約為2.0×106cfu·mL-1，每種菌株平行培養(yǎng)3 次。接種后的搖瓶置于恒溫?fù)u床中25 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)，通過連續(xù)取樣的方式測定培養(yǎng)液中苯酚的含量，取樣的時間間隔為10 h，每次取樣盡快完成，以減少苯酚的揮發(fā)性損失。為減少培養(yǎng)過程中苯酚的損失，本研究的培養(yǎng)瓶采用橡膠塞密封，外用牛皮紙包裹。溶液中殘留的苯酚經(jīng)過離心、取上清液，按照何小麗等[15]的方法采用改進的4-氨基安替吡林法測定苯酚含量。

1.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將篩選出的生防作用較強的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h后離心，用于提取菌株的DNA。使用正向引物27f（5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），按照參考方法擴增[16]菌株的16s rRNA 基因，擴增后的DNA 片段純化后交生物公司測序。

采用BioEdit 軟件（BioEdit v7.2.6.1）對測序結(jié)果和參比序列進行分析，使用MEGA 軟件（MEGA 7.0.26）制作序列的N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Bootstrap 法對系統(tǒng)發(fā)育樹進行評估。

1.3 溫室栽培試驗

為驗證“多功能菌”在田間降解苯酚及同時防止禾谷鐮刀菌病害的功能，本研究在溫室中設(shè)置對比試驗。溫室試驗土壤采自云南師范大學(xué)植物園拋荒地，土壤的采集深度為0～20 cm，將采集的栽培土壤去除雜物、風(fēng)干、破碎、過5目篩備用。本研究所有處理均設(shè)置4個重復(fù)，每個重復(fù)均使用上述土壤1 kg裝于10 cm×8 cm×8 cm（上徑×下徑×高）的塑料花盆中。

為探究“多功能菌”降解土壤苯酚的功能，本研究設(shè)置植物+苯酚+禾谷鐮刀菌+“多功能菌”處理組（PPFP）：盆內(nèi)種植3 株玉米，土壤中的苯酚濃度為500 mg·kg-1，添加禾谷鐮刀菌孢子的數(shù)量約為5×106cfu·kg-1，“多功能菌”的添加量約為1×107cfu·kg-1；植物+苯酚+鐮刀菌+水處理組（PPFW）：該組除未添加“多功能菌”外其他均與PPFP組相同；苯酚+禾谷鐮刀菌+“多功能菌”處理組（PFP）：該組除未種植玉米外，其他處理均與PPFP 組相同；為探究“多功能菌”對禾谷鐮刀菌病害的生防功能，本研究另外設(shè)置對照處理組（CK）：除不添加苯酚、禾谷鐮刀菌、“多功能菌”，其他均與PPFP處理相同。本研究為控制培養(yǎng)基營養(yǎng)對試驗結(jié)果的影響，添加禾谷鐮刀菌孢子、“多功能菌”之前均進行3 次“離心-水洗”過程，通過無菌水重懸后均勻倒入栽培土壤中。為減少試驗過程中土壤苯酚的揮發(fā)，盆口使用多層保鮮膜密封，植物通過保鮮膜上的孔長出后再使用保鮮膜加密孔上的縫隙。土壤殘留苯酚通過乙酸乙酯萃取、濃縮后，采用氣相色譜法測定含量，進而求出土壤中苯酚的濃度（HJ 703—2014）。

分別于玉米種植第10、20、30、40 d 測定玉米的株高。于收獲前使用SPAD-502 Plus（KONICA MINOLTA，Japan）測定第3 伸展葉葉綠素含量。種植40 d后收獲整株玉米，仔細(xì)清洗收獲后玉米植株上的泥沙，而后置于恒溫干燥箱72 ℃烘干48 h，稱量玉米的單株質(zhì)量。株高、葉綠素含量、單株生物量均按照每盆內(nèi)3株玉米的均值作為1個重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

應(yīng)用Excel 軟件（Excel 2016）對數(shù)據(jù)進行分析和制圖，應(yīng)用R 軟件（R x64 3.5.0）通過單因素方差分析法檢驗不同菌株苯酚降解速率、抑菌率和不同處理間玉米株高、葉綠素含量、單株生物量的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1“多功能菌”的活性及鑒定

在禾谷鐮刀菌長滿整個平板的5 d 時間里，優(yōu)選得到的9株菌種中有3種能夠明顯抑制禾谷鐮刀菌的活性，均能夠在平板對峙試驗開始5 d 后形成明顯的抑菌現(xiàn)象。其中PBC01 菌株的抑菌率為79.38%，顯著高于PBC02 菌株的47.05%（P＜0.05），高于PBC03菌株的61.85%（圖1）。

圖1 不同菌株對禾谷鐮刀菌的抑菌率Figure 1 Inhibition rate of different strains to F.graminearum

在密閉培養(yǎng)瓶中，上述3 種菌株在濃度為500 mg·L-1的苯酚培養(yǎng)基中具有明顯的降解苯酚活性，溶液中苯酚的濃度均呈下降趨勢，經(jīng)過70 h 的培養(yǎng)PBC01、PBC02、PBC03 分別將苯酚濃度降解至2.16、148.97、107.96 mg·L-1，PBC01菌株具有更顯著的苯酚降解活性（P＜0.01），PBC01 菌株在整個培養(yǎng)過程中，其降解苯酚的速率均明顯高于PBC02、PBC03 菌株（圖2）。表明PBC01 菌株同時具有相對較高的苯酚降解活性和對禾谷鐮刀菌的生防功能，本研究選擇該菌株進行后續(xù)溫室試驗。

PBC01 菌株16s rDNA 測序結(jié)果上傳至NCBI 后獲得的序列登陸號為MT012079，經(jīng)序列比對，選擇同源性較近的菌株作為參比菌株構(gòu)建進化樹，該菌株被鑒定為Rhodococcussp.，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

2.2 溫室試驗“多功能菌”降解土壤苯酚活性

經(jīng)過40 d 的種植PPFP、PPFW、PFP 處理土壤中苯酚含量均明顯降低，其中PPFP 處理土壤中苯酚濃度最低為79 mg·kg-1，PFP 處理組的濃度為105.33 mg·kg-1，均顯著低于PPFW 處理的262.67 mg·kg-1（P＜0.01）。這說明PBC01 菌株施入土壤后能明顯提高土壤中苯酚的降解速率，顯著增加土壤對苯酚的自凈能力。植物的種植在一定程度上增加了土壤中苯酚降解菌的活性，但對PBC01降解苯酚的活性并無顯著的促進作用，降解苯酚的作用主要來自于PBC01 菌株（圖4）。

圖2 不同菌株降解苯酚速率Figure 2 Degradation rate of phenol by different strains

圖3 基于16s rRNA基因“多功能菌”的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of"multifunctional bacteria"based on 16S rRNA gene

圖4 不同處理土壤中苯酚含量變化Figure 4 Change of phenol content in soil of different treatments

圖5 不同處理植物株高變化Figure 5 Changes of plant height under different treatments

2.3 溫室試驗“多功能菌”生防性能

圖5 表明，在40 d 的栽培過程中PPFP 和CK 處理玉米的株高均明顯高于PPFW 處理，在40 d 時這2 個處理組的株高分別為58.37 cm 和61.70 cm，顯著高于PPFW 處理組的37.63 cm（P＜0.05）。這說明PBC01菌株可顯著降低苯酚、禾谷鐮刀菌對玉米株高的影響。

圖6 表明，盆培40 d 時PPFP 和CK 處理組玉米的葉綠素含量無顯著差異，分別為33.50 和33.33，均顯著 高 于PPFW 處 理 組 的22.93（P＜0.05）。這 說 明PBC01菌株的使用可顯著降低苯酚、禾谷鐮刀菌對玉米葉綠素含量的影響。

栽培40 d 時PPFP 和CK 處理組玉米的單株生物量分別為1.79 g 和1.92 g，二者無顯著差異，但均顯著高于PPFW 處理組的0.97 g（P＜0.05）。這說明PBC01菌株的施用可顯著降低苯酚、禾谷鐮刀菌對玉米單株生物量的影響（圖7）。

圖6 不同處理植物葉綠素含量Figure 6 Chlorophyll content of plants under different treatments

圖7 不同處理植物單株生物量Figure 7 Single biomass of plant under different treatments

3 討論

土壤苯酚污染通過植物的根系吸收、擴散等方式進入植物體內(nèi)[2]，破壞植物的酶系統(tǒng)，影響植物的正常新陳代謝[17]。本研究分離獲得的PBC01 菌株在苯酚培養(yǎng)基中70 h 內(nèi)能夠?qū)⑷芤褐械谋椒咏到?9.57%，在40 d 內(nèi)能夠?qū)⑼寥乐懈邼舛缺椒咏到?4.20%，這與其他研究結(jié)果類似[18]。微生物具有多種苯酚代謝通路，例如可通過苯酚羥化酶將苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，然后由鄰苯二酚2，3-雙加氧酶通過中間途徑將其轉(zhuǎn)化為2-羥基黏液半醛方式分解環(huán)境中的苯酚，利用分解苯酚獲得的能量進行新陳代謝[19]。目前研究發(fā)現(xiàn)的苯酚降解菌種類較多，包括部分假單胞菌屬（Pseudmonas）[9]、不動桿菌屬（Acinetobacter）[19]等，這說明環(huán)境中有大量能夠降解苯酚的微生物。本研究中PPFW 處理組苯酚含量也明顯降低，說明土壤對苯酚具有一定的自凈能力，這或許是由于土壤中存在一定量具有降解苯酚功能的微生物[14]。本研究篩選獲得的苯酚降解菌為Rhodococcussp.，目前已有一些研究表明Rhodococcussp.能夠降解苯酚，并且該菌屬具有較高的苯酚降解速率，可在短時間內(nèi)降解溶液中的大部分苯酚[8，18]。由于苯酚污染物對植物的新陳代謝具有顯著的抑制作用，對其去除可顯著降低土壤中苯酚對植物生長的負(fù)效應(yīng)[17]，PBC01 菌株的施用顯著降低了土壤中苯酚的含量（圖4），進而降低了苯酚對玉米的株高、葉綠素含量、生物量的抑制（圖5～圖7）。

PBC01菌株具有明顯的生防功能，在平板對峙試驗中能抑制禾谷鐮刀菌生長（圖1），在土壤中仍能夠顯著限制禾谷鐮刀菌對玉米生長的影響（圖5～圖7）。生防菌通過對營養(yǎng)、生存空間的競爭、分泌抗生素等方式限制致病微生物的生長[11]，在土壤顆粒、植物根際、植物根內(nèi)生存，限制致病微生物在土壤中的生長、繁殖，在植物根部形成“防火墻”從而限制土傳致病微生物對植物的侵染[7，20]。本研究發(fā)現(xiàn)的PBC01菌株具有較快的生長速率，5 d 內(nèi)在培養(yǎng)平板上形成了較大直徑的菌落，或許該種菌株能通過快速生長限制禾谷鐮刀菌的生長。平板對峙試驗中PBC01 菌株在培養(yǎng)平板上形成了明顯的抑菌圈，該種菌株可能通過向胞外分泌抗生素的方式致畸、裂解禾谷鐮刀菌的菌絲，從而限制禾谷鐮刀菌的生長[7]。施入土壤后，PBC01菌株顯著限制了禾谷鐮刀菌對玉米生長的影響，這或許由于該種菌能夠在土壤顆粒、植物根際較好地定殖，利用土壤中的苯酚、植物根部分泌的營養(yǎng)生存，限制禾谷鐮刀菌的生長，從而減少其對植物生長的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)的PBC01 菌株同時具有良好的降解苯酚和對禾谷鐮刀菌的生防功能，雖然此類研究結(jié)果較少，但同時具有多種生理功能的“多功能菌”的研究較多。Wang 等[14]的研究分離獲得的“多功能菌”同時具備分解土壤中苯酚和促進植物生長的功能，一種紅球菌能同時降解苯酚和吡啶，同時對Cr6+具有還原作用[13]，鳳尾蕨根際微生物萬古霉素假單胞菌（Pseudomonas vancouverensis）可通過分泌生長素、鐵載體的方式促進鳳尾蕨的生長，同時具有促進砷轉(zhuǎn)化的功能[21]，從堆肥中分離出的100種微生物中25種同時具有促進植物生長、生防或促進堆肥腐解的功能[22]，這說明同時具有多種功能的微生物在自然界普遍存在。自然界微生物的多樣性據(jù)估計超過50萬種，微生物具有有別于動植物的獨特代謝通路，并且微生物之間普遍存在基因的水平轉(zhuǎn)移，這可能是導(dǎo)致上述微生物同時具備多種環(huán)境生物學(xué)、生理生態(tài)學(xué)功能的原因[23-24]。

4 結(jié)論

本研究分離獲得了能同時降解苯酚和生物防治禾谷鐮刀菌病害的多功能菌株Rhodococcus zopfiisp.PBC01，該種微生物在實驗室內(nèi)70 h 能降解培養(yǎng)液中99.57%的苯酚，同時對禾谷鐮刀菌的抑制率達到79.38%。該種菌株在溫室栽培試驗中也具有良好的效果，可顯著降低禾谷鐮刀菌對玉米生長的影響，將土壤苯酚濃度由500 mg·kg-1降低至79 mg·kg-1，這或許是由于該種菌株同時具有苯酚代謝途徑和分泌抗生素的功能，具體原因仍需要進一步研究。自然界中或許普遍存在具有多種生理生態(tài)功能的微生物，本研究可為土壤苯酚污染、農(nóng)業(yè)病害綜合問題的解決提供一種思路。