辛福順，吳埼淇，張 韜，林敏瑜，林紹彬

近年來，隨著溶栓療法、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)、冠狀動脈旁路移植術(shù)等的廣泛應(yīng)用，使心肌細(xì)胞缺血后重新得到血液灌注。多數(shù)情況下，心肌缺血經(jīng)再灌注后功能可得到恢復(fù)，但有時心肌功能不僅不能恢復(fù)，反而出現(xiàn)比灌注前更嚴(yán)重的損傷和功能障礙，主要表現(xiàn)為舒縮功能降低、再灌注心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結(jié)構(gòu)變化及血管無復(fù)流等現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)永久性傷殘或死亡。這種在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，心肌組織損傷反而加重的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。心肌缺血是多因素、多基因共同參與的復(fù)雜過程，盡管臨床實(shí)踐表明西藥治療心肌缺血的近期療效尚可，但其遠(yuǎn)期療效不甚理想。近年來，大量的研究結(jié)果表明，中藥對心血管疾病具有積極的療效。前期臨床研究顯示，逸心湯治療慢性心力衰竭及穩(wěn)定型心絞痛取得良好的臨床療效，本研究通過構(gòu)建大鼠MIRI模型，從氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡角度探討逸心湯對MIRI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 30只成年雄性SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量(250±20)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK(滬)2017-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 石蠟(Sigma)，DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，中性樹膠(Sigma)、Tunel試劑盒(KGA704南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，內(nèi)源性親和素-生物素封閉試劑盒(北京雷根生物技有限公司)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，活性氧(ROS)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 逸心湯由丹參、瓜蔞、半夏、薤白、桃仁、紅花、茯苓、黃芪等 12 味藥物組成。由本實(shí)驗(yàn)中心動物技術(shù)員以每包逸心湯統(tǒng)一加水120 mL，煎煮30 min至沸騰，共計煎煮5包，湯藥560 mL，1 h后按每只4 mL、每日1劑經(jīng)胃管注入。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 小動物麻醉呼吸機(jī)(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(澳大利亞埃德公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(湘儀)，型號：H1650R；多功能酶標(biāo)分析儀(匯松)，型號：MB-530；紫外分光光度計(天普)，型號：752；切片機(jī)(浙江金華益迪試驗(yàn)器材)，型號YD-315；包埋機(jī)(常州中威電子儀器)，型號BMJ-A；顯微鏡(Motic)，型號：BA210T。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 大鼠MIRI模型制備 大鼠誘導(dǎo)吸入異氟烷，維持麻醉狀態(tài)，仰臥位固定，經(jīng)喉氣管插管，接入小動物呼吸麻醉機(jī)，進(jìn)氣量按100 g進(jìn)氣1～1.5 mL，呼吸頻率為90～100次/min。將針刺電極插入大鼠左下肢、右上肢皮下，通過Powerlab生理記錄儀記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖(ECG)。記錄15 min正常時的心電圖后，剔除心電圖異常者。在胸骨左旁開0.5 cm處做一約2 cm的縱向切口，大致位于兩前肢后緣連線至第5肋骨水平。分離皮下筋膜，鈍性分離第3肋、第4肋的胸淺肌和胸深肌，剪斷第3肋、第4肋骨，剪開心包膜，暴露心臟，確認(rèn)左前降支的位置。于左心耳下緣約2 mm處的冠狀動脈左前降支下穿6-0號帶針縫合線，從肺動脈圓錐旁出針，拉緊絲線，觀察心電圖改變和心肌顏色變化，見到結(jié)扎部位上下約2 mm范圍的心肌顏色發(fā)白，心電圖ST段抬高說明結(jié)扎成功。結(jié)扎45 min后，剪開線結(jié)進(jìn)行再灌注，心肌由蒼白變得紅潤，在開始灌注的時候會出現(xiàn)再灌注心律失常。隨后胸前切口逐層縫合，用注射器抽吸清除胸腔內(nèi)殘留氣體，關(guān)胸后予以脫機(jī)，放回籠中。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)分組 按照隨機(jī)對照原則，將30只大鼠分為空白組(假手術(shù)組)、模型組和治療組各10只。模型組和治療組分別結(jié)扎心臟左前降支45 min，空白組只穿線不結(jié)扎，其余步驟各組均相同。模型組和空白組灌胃生理鹽水4 mL，連續(xù)治療2周。治療組給予逸心湯，每只4 mL，每日1劑，每天灌胃給藥，治療2周。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 氧化應(yīng)激水平評價 治療2周后，各組大鼠均用2%戊巴比妥鈉，按100 g體重0.3 mL腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血，采用相應(yīng)試劑盒檢測各組大鼠血清SOD、MDA及ROS水平。

1.6.2 心肌細(xì)胞凋亡檢測 治療2周后，各組大鼠均用2%戊巴比妥鈉，按100 g體重0.3 mL腹腔注射麻醉后，用生理鹽水心臟灌注后，取整個心臟放在4%多聚甲醛中固定后，并取心肌組織進(jìn)行病理蘇木精-伊紅(HE)染色，采用TUNEL法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平。

1.6.3 心肌組織病理HE染色 每只動物取心臟同一部位組織，經(jīng)過烤片、切片、脫臘、浸洗、蘇木精及伊紅染色、沖洗、脫水、封片，顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 模型組MDA水平明顯高于空白組(P<0.05)，治療組MDA水平明顯低于模型組(P<0.05)，治療組MDA水平與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3組間SOD水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組ROS水平明顯高于空白組(P<0.05)，治療組ROS水平明顯低于模型組(P<0.05)，但高于空白組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較(±s)

2.2 各組細(xì)胞凋亡水平比較 治療組、模型組心肌細(xì)胞凋亡水平明顯高于空白組(P<0.05)；模型組與治療組心肌細(xì)胞凋亡水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組心肌細(xì)胞凋亡水平比較(±s)

2.3 各組心肌組織病理HE染色結(jié)果 病理組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，模型組、治療組與空白組比較，可見心肌細(xì)胞變性，心肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞間隙明顯增寬，炎細(xì)胞浸潤，而治療組與模型組比較，心肌細(xì)胞變性及炎細(xì)胞浸潤程度較輕。詳見圖 1。

圖1 各組心肌組織病理切片圖(HE，×400)

3 討 論

MIRI的發(fā)生是由多環(huán)節(jié)、多因素共同促成，其病因復(fù)雜。目前認(rèn)為氧自由基產(chǎn)生、鈣超載、凋亡基因的激活在MIRI中起著重要作用[1]。氧化應(yīng)激是MIRI的重要原因之一，由此，可以通過測定氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，來了解體內(nèi)氧化及抗氧化水平。MDA是脂質(zhì)過氧化過程的副產(chǎn)物之一，可間接地反映自由基攻擊的嚴(yán)重程度，其含量高低反映了氧自由基在細(xì)胞內(nèi)的生成水平及其對細(xì)胞的損傷程度[2]。SOD是體內(nèi)清除自由基的主要成分，其活力可反映機(jī)體清除氧自由基的能力[3]。ROS是線粒體產(chǎn)生的一種體內(nèi)代謝產(chǎn)物，過度累積的ROS可造成粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定，甚至破裂等情況，從而引起心腦血管事件[4]。因此，可以通過測定MDA、SOD、ROS的含量來評價MIRI氧化應(yīng)激水平。在本研究中，模型組及治療組MDA、ROS明顯高于空白組，說明結(jié)扎左前降支的模型組和治療組大鼠均存在MIRI，其氧自由基水平增高，且治療組MDA及ROS水平明顯低于模型組，表明逸心湯對MIRI具有一定的保護(hù)作用。但在本研究中3組間SOD比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與促氧化、抗氧化失衡有關(guān)，但不排除與樣本量小有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

本研究采用結(jié)扎大鼠心臟左前降支的方法制備急性心肌梗死模型，該造模方法成功率高，操作簡便，與臨床急性心肌梗死相似，是急性心肌梗死常用的動物造模方法[5]。在本研究中，結(jié)扎心臟左前降支的治療組與模型組心肌細(xì)胞凋亡水平均明顯高于空白組，但治療組與模型組心肌細(xì)胞凋亡水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與樣本量較小有關(guān)。

逸心湯中以丹參、瓜蔞為君藥，二藥合用有助于加強(qiáng)祛痰化瘀、改善微循環(huán)的作用，再配以半夏、薤白、桃仁、紅花、茯苓、黃芪為臣藥，諸藥合用具有益氣化痰祛瘀之功效，在前期慢性心力衰竭及穩(wěn)定型心絞痛的臨床觀察中亦取得了良好的療效[6-7]，體現(xiàn)了驗(yàn)方逸心湯“辨證論治，治病求本”的精髄，也符合當(dāng)前精準(zhǔn)化、個體化治療的理念。

現(xiàn)代研究表明，瓜蔞在抗動脈粥樣硬化的過程中具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗炎、抗氧化、抗血管內(nèi)皮損傷、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、穩(wěn)定斑塊、擴(kuò)血管、抑制血小板血栓形成，延長缺氧耐受時間，改善缺血再灌注損傷等作用[8-9]。丹參、川芎能改善心肌舒縮功能，清除氧自由基，改善MIRI，促進(jìn)心功能恢復(fù)[10]。桃仁、紅花可有效改善血小板聚集和凝血功能，擴(kuò)張冠狀動脈[11]。薤白有保護(hù)內(nèi)皮并改善其功能紊亂，改善心肌缺血，從而保護(hù)衰竭的心肌細(xì)胞的作用[12]。

綜上所述，逸心湯具有活血化瘀、祛痰通絡(luò)的功效，對MIRI有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，抗血小板聚集，改善氧化應(yīng)激損傷，從而減少心肌損害有關(guān)[6]。