姜海濤，楊欣冉，金家樂

（1. 云南大學(xué) 建筑與規(guī)劃學(xué)院，云南 昆明 650500；2. 河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種未明病因的難治性自身免疫性疾病[1]，致殘率很高，在風(fēng)濕類患者中造成的傷害也最大。我國至少有500萬類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者，其中以女性居多[2]。常見的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物主要以非甾體類抗炎藥和糖皮質(zhì)激素為主，來氟米特是目前治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一線藥物。

來氟米特（leflunomide，LFMD）的化學(xué)名稱為N-（4-三氟甲基苯基）-5-甲基異噁唑-4-羧酰胺[3]，是一種異噁唑類的抗增殖活性免疫調(diào)節(jié)劑，其半衰期（t1/2）為15 d，該藥也可以作為解熱鎮(zhèn)痛、非甾體抗炎藥使用[4]，主要通過抑制二氫乳清酸脫氫酶活性進而影響淋巴細(xì)胞合成嘧啶[5]。來氟米特結(jié)構(gòu)中的異噁唑環(huán)在堿性條件或酶的作用下易開環(huán)，從而可增強藥物療效。1998年來氟米特由德國Hoechst Marion Roussel公司研發(fā)并獲得美國FDA批準(zhǔn)上市[6]，主要用于治療成人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。除此之外，該藥對狼瘡性腎炎、難治性腎病綜合征、難治性原發(fā)性血小板減少型紫癜（ITP）、銀屑病、干燥綜合征、大皰性類天皰瘡、Wegener肉芽腫等疾病的治療也顯示出較好的療效[7]。臨床研究顯示，口服來氟米特可能引起血小板增多、惡心、腹痛、腹瀉、胸痛、高血壓、頭暈、頭痛、骨痛、全血細(xì)胞或白細(xì)胞減少、肌肉痙攣等不良反應(yīng)[8-9]。為減少這些不良反應(yīng)擬將其制成外用凝膠制劑，同時提高局部用藥濃度[10]。來氟米特為無臭的白色粉末或結(jié)晶，難溶于水，可溶于乙醇，易溶于甲醇、冰醋酸，屬于BCS（biopharmaceutics classification system，生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)）二類藥物[11]，將其制備成卡波姆水性凝膠時會影響其外觀和均勻性。脂質(zhì)體具有容易發(fā)生藥物滲漏、聚集、融合等物理性質(zhì)的變化[12]。因此，將來氟米特制成脂質(zhì)體凝膠能提高其經(jīng)皮膚吸收的療效，同時又能顯著提高來氟米特的穩(wěn)定性。來氟米特脂質(zhì)體凝膠是將藥物包埋在球形脂質(zhì)體中[13]，可以通過局部給藥減輕藥物的不良反應(yīng)。脂質(zhì)體凝膠的類生物膜結(jié)構(gòu)特性對皮膚幾乎不產(chǎn)生刺激，而且還具有藥物貯庫效應(yīng)，從而增加藥物在皮膚上的滯留量[14]。

1 儀器與材料

儀器：Y92-HN超聲波細(xì)胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、HC-188藥檢透皮釋放試驗儀（天津市正通科技有限公司）、ME104E電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、Zetasizer Nano-ZS90激光粒度及Zeta電位分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）、UV-2000紫外-可見分光光度計（上海雙旭電子有限公司）、JB-3定時恒溫磁力攪拌器（金壇市杰瑞爾電器有限公司）等。

試藥：純度為99% 的來氟米特原料藥（湖北信康醫(yī)藥化工有限公司，批號：100571-201511）、大豆卵磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司，批號：20150701）、膽固醇（北京化學(xué)試劑公司，批號：Q/0042-93）、體積分?jǐn)?shù)為99.9% 的色譜純甲醇（天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號：534076）、974PNF卡波姆（美國諾譽化工上海有限公司，批號：CC91AAB549）、化學(xué)純Tween80（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、體積分?jǐn)?shù)為99.7% 的分析純無水乙醇（天津市進豐化工品有限公司）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5% 的分析純氯化鈉（天津市德恩化學(xué)試劑有限公司）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96%的分析純氫氧化鈉（天津石英鐘廠霸州市化工分廠）、體積分?jǐn)?shù)為99% 的分析純丙三醇（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）、醫(yī)用級水溶性月桂氮?酮（鄭州市津北化工有限公司）、實驗室自制蒸餾水等。

2 方法

2.1 脂質(zhì)體的制備與測定

2.1.1 脂質(zhì)體的制備

精密稱取一定量的來氟米特原料藥、大豆卵磷脂和膽固醇，置于250 mL茄型瓶中，加入20 mL甲醇，超聲5 min使其溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中設(shè)定不同的水浴溫度，旋蒸45 min，至瓶壁上形成一層均勻的薄膜。再用吸量管精密吸取20 mL蒸餾水，配制成水合介質(zhì)，加入到上述茄型瓶中，繼續(xù)在設(shè)定的溫度下水合45 min，形成不透明的混懸液，即為來氟米特脂質(zhì)體。

將制得的來氟米特脂質(zhì)體倒入西林瓶中，在冰浴下用超聲波細(xì)胞粉碎機進行細(xì)胞粉碎，每工作7 s暫停3 s，工作若干次，然后采用透析法將脂質(zhì)體與游離的來氟米特分離。首先用蒸餾水沖洗手套，除去金屬離子等干擾，小心扎緊透析袋的一端，將制備好的脂質(zhì)體倒入透析袋中扎緊；然后將透析袋放入盛滿蒸餾水的燒杯中，向燒杯中加入轉(zhuǎn)子，在定時恒溫磁力攪拌器上恒溫攪拌6 h，第一個小時每20 min換一次蒸餾水，3次后每1 h換水一次，使游離的來氟米特與脂質(zhì)體基本上分離。

2.1.2 測定波長的選擇

精密稱取15 mg來氟米特原料藥，置于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲溶解。在100 mL溶液中精密量取1 mL溶液置于10 mL量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，并搖勻。于紫外光譜儀200～400 nm波長進行紫外全波長掃描，得到來氟米特的吸收圖譜。

同理，分別配制大豆卵磷脂、膽固醇和Tween80的甲醇稀溶液，測得在200～400 nm波長內(nèi)的吸收圖譜，以排除輔料對于來氟米特測定的干擾。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取24 mg來氟米特原料藥，置于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲溶解。在100 mL溶液中用單道可調(diào)移液器精密吸取250、375、500、625、750、875、1 000 μL藥品溶液，分別置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。按順序編號并搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為3、4.5、6、7.5、9、10.5、12 μg·mL-1的溶液，采用紫外可見吸收光譜法在260 nm波長處測定各質(zhì)量濃度樣品的吸收圖譜[15]。以來氟米特的質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，以溶液的吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得出藥物的線性關(guān)系曲線。

2.1.4 粒徑、Zeta電位和包封率的測定

將經(jīng)細(xì)胞粉碎后的來氟米特脂質(zhì)體用激光粒度及Zeta電位分析儀測定其平均粒徑和電位。記錄脂質(zhì)體的體積，精密吸取1 mL經(jīng)透析的來氟米特脂質(zhì)體，通過0.2 μm微孔濾膜注入到10 mL量瓶中，加入甲醇破乳，并定容至10 mL。在10 mL脂質(zhì)體溶液中用吸量管精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，再加甲醇稀釋定容，并搖勻。稀釋后測定吸光度，根據(jù)原脂質(zhì)體體積換算出該脂質(zhì)體包封的原藥物含量，與稱量時的加入量對比，得出被包封的來氟米特所占的比例。

2.2 脂質(zhì)體處方工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素考察處方因素

固定處方中大豆卵磷脂用量為200 mg，通過變動其與膽固醇、來氟米特原料藥用量（質(zhì)量）比或水合介質(zhì)種類制備不同處方的來氟米特脂質(zhì)體，均在45 ℃ 下旋蒸和水合，且超聲細(xì)胞粉碎均工作40次，以薄膜分散?透析法制得5組來氟米特脂質(zhì)體。測定不同處方的脂質(zhì)體的粒徑、電位和包封率，綜合考察各處方因素對粒徑、電位和包封率的影響[16]。

2.2.2 單因素考察工藝因素

先固定來氟米特脂質(zhì)體的處方組成和用量（大豆卵磷脂200 mg、膽固醇20 mg、來氟米特原料藥20 mg），分別在不同溫度下或不同的水合介質(zhì)中成膜和水合。測定5組不同處方的來氟米特脂質(zhì)體的粒徑、電位和包封率，綜合考察同一處方不同工藝因素對粒徑、電位和包封率的影響[17]。

2.2.3 正交設(shè)計處方工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素考察的結(jié)果，篩選出大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比（A）、大豆卵磷脂和來氟米特的質(zhì)量比（B）和成膜溫度（C）這3個因素對脂質(zhì)體制備的影響相對較大。根據(jù)這些因素各設(shè)計三個水平進行處方工藝正交設(shè)計篩選。

2.3 脂質(zhì)體凝膠制劑的體外試驗

2.3.1 脂質(zhì)體凝膠劑的制備

稱取974PNF卡波姆0.4 g，加入到100 mL蒸餾水中充分溶脹約5 h。精密稱取0.1 g來氟米特原料藥，將其溶于20 mL乙醇中，記為Ⅰ組。將按上述最優(yōu)處方和工藝制備的來氟米特脂質(zhì)體100 mL記為Ⅱ組。向制備的來氟米特脂質(zhì)體中分別加入2 mL水性氮酮、8 mL丙三醇和20 mL氫氧化鈉溶液（4 g·L-1）[18]，并與溶脹的卡波姆凝膠混合。為防止產(chǎn)生大量氣泡，沿逆時針方向緩緩攪拌，分別得到來氟米特卡波姆水性凝膠和脂質(zhì)體凝膠。

2.3.2 透皮給藥試驗

取體質(zhì)量適中的成年健康大鼠，拉斷頸椎致死，用于制備游離鼠皮。剪開并剝離腹部皮膚，并剔除其皮下脂肪組織，用剪刀小心剪除鼠皮的毛，不得劃傷其皮膚。將處理好的鼠皮在生理鹽水中洗凈，在密封小袋中倒入生理鹽水，將鼠皮浸入其中，密封，置于冰箱中冷藏備用[19]。

剪出兩塊適當(dāng)面積的鼠皮，分別固定在Frans池中[20]。在甲、乙供給池中分別涂抹來氟米特普通凝膠和脂質(zhì)體凝膠，在接收池中倒?jié)M生理鹽水，加入轉(zhuǎn)子勻速攪拌，并采用（32.2 ± 0.5）℃（大鼠體溫）的循環(huán)水浴進行恒溫，分別在1、2、4、6、8、12、24 h吸取5 mL，并補充同體積的生理鹽水，測定各試驗樣品的吸光度，通過線性關(guān)系方程計算藥物濃度，更換鼠皮重復(fù)試驗5組求均值。

3 結(jié)果

3.1 藥物的紫外測定波長與標(biāo)準(zhǔn)曲線

來氟米特紫外全波長掃描圖譜見圖1，圖中1號波峰處的波長為260 nm，2號波谷處的波長為233 nm，且輔料峰對來氟米特的測定不構(gòu)成干擾。故選擇最大吸收波長260 nm作為樣品質(zhì)量濃度的測定波長。來氟米特的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍：3～12 μg·mL-1，所得線性方程：A= 0.073ρ－0.099 4，相關(guān)系數(shù)R為0.999 4，表明線性關(guān)系較為良好。

Fig. 1 Ultraviolet absorption wavelength scanning of leflunomide圖 1 來氟米特紫外全波長掃描

Fig. 2 Standard curve of leflunomide圖2 來氟米特的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素考察試驗結(jié)果

單因素考察結(jié)果見表1，各因素均通過方差檢驗，有顯著差異。由表1的結(jié)果可知，藥物濃度對包封率有較大影響，膽固醇用量對電位有較大影響，水合介質(zhì)的種類對粒徑有較大影響，對包封率和電位影響不大，可能是加入表面活性劑后水合更加完全，提高了脂質(zhì)體的濃度。成膜溫度的高低對包封率（encapsulation rate，ER）、粒徑（d）和Zeta電位（ξ）都有較大影響，而超聲波細(xì)胞粉碎時間對平均粒徑有較大影響。

Table 1 Optimization and comparison of formulation process factors表 1 處方工藝因素優(yōu)化對比

3.3 正交設(shè)計試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2、3、4。包封率主要受大豆卵磷脂和藥物的用量比（B）、成膜溫度（C）這兩個因素的影響（B > C > A）；平均粒徑主要受成膜溫度的影響較大（C > B > A）；Zeta電位也主要受成膜溫度的影響（C > B > A）。篩選得到的最優(yōu)組合為A3B2C3、A3B1C3、A3B2C3，僅第二組略有不同，然而在測定平均粒徑時，藥脂比僅作為次要的影響因素，且適當(dāng)提高投藥量可以提高其包封率，增加含藥量。綜上，該正交試驗的最優(yōu)組合為A3B2C3，確定的最佳處方為大豆卵磷脂200 mg、膽固醇30 mg、來氟米特原料藥20 mg，用體積分?jǐn)?shù)為0.5% 的Tween80溶液作為水合介質(zhì)；最優(yōu)工藝為55 ℃ 旋蒸和水合，超聲波細(xì)胞粉碎設(shè)置工作次數(shù)為40次，每工作7 s，暫停3 s。鏡下對比檢驗結(jié)果顯示，該處方工藝制備的脂質(zhì)體其變形、泄露和集聚的比例均低于平均水平。

Table 2 Orthogonal factor level table表 2 因素水平表

Table 3 The result of the orthogonal experiment表 3 正交試驗結(jié)果

Table 4 Orthogonal design range analysis表 4 正交設(shè)計極差分析

3.4 最優(yōu)處方工藝驗證

按上述處方工藝，采用薄膜分散-透析法制備10批來氟米特脂質(zhì)體，并測定其粒徑、電位和包封率，結(jié)果見表5。制得脂質(zhì)體的粒徑、電位和包封率的RSD均小于3%，說明此工藝處方穩(wěn)定可靠。處方中由于膽固醇用量較大，使得負(fù)電性相對較強，因此使來氟米特脂質(zhì)體更加穩(wěn)定。雖然脂質(zhì)體濃度增大會引起平均粒徑增大，但處方中各組分的用量不能過少，使載藥量適中，可確保來氟米特脂質(zhì)體的質(zhì)量。

Table 5 Optimal formulation and process verification表 5 最優(yōu)處方工藝驗證

3.5 透皮給藥試驗結(jié)果

透皮給藥后藥物溶出量（Q）與時間曲線見圖3所示，重復(fù)試驗數(shù)據(jù)通過t檢驗，服從正態(tài)分布。由圖3可知，普通凝膠藥物吸收開始時基本能呈線性，2 h后吸收速率逐漸減慢；而脂質(zhì)體凝膠藥物吸收基本保持線性，在較長時間后的透皮擴散也只是略有減慢。開始時2 h，脂質(zhì)體凝膠透皮效果僅略強于普通凝膠，之后隨著普通凝膠的透皮吸收減慢，與脂質(zhì)體凝膠的差距漸漸拉開。脂質(zhì)體的磷脂膜具有提高藥物溶解度的作用，較藥物在乙醇中的溶解度要高，且與皮膚的脂質(zhì)雙層類似，具有很好的生物相容性和生物穩(wěn)定性，很容易透過皮膚[21]。同時，脂質(zhì)體凝膠還具有藥物貯庫效果，使來氟米特能以相對均勻的速率釋放。

Fig. 3 The dissolution curve of transdermal absorption圖 3 透皮給藥溶出曲線

4 討論

a. 經(jīng)攪拌制備的脂質(zhì)體凝膠的透明度和均勻度要好于普通凝膠，在鏡下多數(shù)呈現(xiàn)球形，且滲漏比例通過樣方計數(shù)，約為40%，而脂質(zhì)體乙醇溶液滲漏率高達70% 以上。該脂質(zhì)體凝膠在多數(shù)物理性質(zhì)方面得到了優(yōu)化。

b. 由于來氟米特本身的理化性質(zhì)，普通口服制劑的溶出成為限速步驟，且不良反應(yīng)較多，對于多數(shù)需要長期治療的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病的效用很差。將其制成脂質(zhì)體凝膠制劑，脂質(zhì)體各處方工藝因素對其各個性狀的影響程度不同，整體來看，主要受投料比和成膜溫度的影響較大。但脂質(zhì)體的綜合評價指標(biāo)較難確定，一般含藥量較多的脂質(zhì)體平均粒徑較大，而過分稀釋會使得包封藥量過少，實用性不強。如果通過增加細(xì)胞粉碎時間來減小粒徑，則會引起被包封藥物的泄露，從而降低包封率。Zeta電位是由膽固醇的加入而產(chǎn)生的，較高的電位會使來氟米特脂質(zhì)體更加穩(wěn)定，但是加入大量膽固醇會引起脂質(zhì)體剛性過強，進而使柔性的磷脂難以包封藥物。鑒于此，需要對不同性質(zhì)的脂質(zhì)體開展體外試驗，研究其與透皮吸收速率的相關(guān)性。

c. 脂質(zhì)體凝膠選擇了能較好被皮膚吸收且涂抹舒適的卡波姆水性凝膠，酸性的卡波姆與氫氧化鈉中和、增稠形成了透明均勻的凝膠劑。借助凝膠對脂質(zhì)體的包埋作用，使凝膠分布于脂質(zhì)體的四周，脂質(zhì)體以擴散和溶蝕的方式釋放藥物，其不僅僅在釋放速率上優(yōu)于普通凝膠，而且在緩釋、控釋方面也具有優(yōu)勢，在12 h內(nèi)釋藥基本呈線性，能大大減少用藥頻率，且維持在一定藥物濃度水平，防止釋藥過程由快到慢，避免體內(nèi)藥物濃度出現(xiàn)時高時低的情況。

d. 脂質(zhì)體凝膠的不足之處：對于脂質(zhì)體的影響因素尚不能完全考慮，例如：水合介質(zhì)的種類、旋蒸的轉(zhuǎn)速和時間、水合的轉(zhuǎn)速和時間、超聲細(xì)胞粉碎機的工作頻率、透析的溫度與時間等。脂質(zhì)體凝膠在實際應(yīng)用中很受限制，脂質(zhì)體需要在低溫條件下保存，大大增加了其在實際運輸、儲存中的成本。