孫麗穎 黃盈棹 田文 鐘文耀 殷悅涵 張楠 楊勇 郭陽 李斌 趙俊會

手部軸前性多指 ( preaxial polydactyly，PPD )，又稱橈側多指，是一種常見的先天性手部畸形，其在活產嬰兒中發(fā)生率為 0.08～1.4 / 1000，約 20% 為雙側畸形，其中最常見者為多拇畸形[1]。多數為散發(fā)病例，但也可見于家族遺傳，尤其是伴有三節(jié)指骨拇的 PPD 多有遺傳傾向[2-4]。有研究提示約有 100種基因與多指相關[5]，在非綜合征性的 PPD 中，目前研究提示 sonic hedgehog (SHH) 基因、肢體極化區(qū)增強調節(jié)序列 ( the zone of polarizing activity regulatory sequence，ZRS ) 基因、GLI 家族鋅指 3 ( GLI family zinc finger 3，GLI3 ) 等基因也與之有關[5-7]，但突變位點多樣，且具體致病機制尚不明確。另外該畸形也可為某些罕見的綜合征表型之一，如范可尼貧血( Fanconi's anemia )，Holt-Oram 綜合征和 Rubinstein-Taybi 綜合征等[1]，也多與特定基因突變有關。因此，對該類患者進行遺傳學檢查，有助于從根本上認識該類畸形的發(fā)生及發(fā)展，尤其是針對綜合征性患者，更有助于早期全面診斷、綜合治療及后續(xù)遺傳咨詢。故在獲得患者及其監(jiān)護人的充分知情同意下，對 23 個先天性 PPD 家系進行臨床表型及遺傳學分析。

資料與方法

一、臨床資料

本研究納入 23 個 PPD 家系，先證者均為 2018年 4 月至 2019 年 12 月，在我院就診者 ( 連續(xù)病例 )，年齡 1～14 歲，平均 ( 3.0±2.0 ) 歲。男 10 例，女 13 例。雙側多拇指畸形 7 例，右側 7 例，左側9 例。23 名先證者均常規(guī)查體并行雙手 X 線、胸部正位 X 線、心臟彩超及腹部彩超等術前常規(guī)檢查，并進行家系調查 ( 表1 )。

二、本研究經北京積水潭醫(yī)院倫理委員會批準；患者監(jiān)護人簽寫知情同意書。

三、全外顯子組測序

先證者及其父母的外周血樣本每人 2～3 ml，通過 Dneasy Blood & Tissue Kit ( Qiagen ) 試劑盒提取基因組 DNA。采用 Aglient V5 芯片進行外顯子組捕捉，并在 Illumina HiSeq 4000 儀器進行二代高通量測序。當測序數據滿足平均測序深度約 100X，20X序列比例＞97% 及 Q30＞85% 等質控指標后方可用于后續(xù)分析。測序片段數據通過 Burrows-Wheeler Aligner 與 GRCh 37 ( Genome Reference Consortium Human Reference 37 ) 參考基因組進行比對，比對所得變異經 VEP ( Variant Effect Predictor ) 軟件進行注釋。在進行臨床遺傳分析前，變異列表將依據 OMIM( Online Mendelian Inheritance in Man ) 和 gnomAD ( The Genome Aggregation Database ) 等遺傳性疾病數據庫及人群大規(guī)模測序數據庫，結合人類表型標準術語( Human Phenotype Ontology，HPO ) 對變異進行分類及篩選[8]，剔除與臨床表現(xiàn)明顯無關的變異及人群中常見的高頻變異 ( 等位基因頻率 3% 以上 )。針對具體變異的臨床遺傳評級參考美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會 ( The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG ) 發(fā)布的序列變異解讀標準和指南進行分類[9]。該指南綜合考量了人群頻率證據、計算機算法預測類證據、功能學研究證據、家系遺傳類證據 ( 共分類、新發(fā)變異等 ) 及其它數據庫評級信息等各類證據，并依據證據強度及類型進行權重評估，最終將不同權重的證據疊加并依據其指定的標準公式得出變異評級。本研究所納患者的測序數據中，經過初篩的變異均按照該指南進行致病性評估，并因此分別被歸入致病變異、疑似致病變異、臨床意義未明、疑似良性變異、良性變異等五個層級中。對于致病變異、疑似致病變異及臨床意義未明的變異，其報告與否將進一步結合患者的臨床表型、遺傳信息進行綜合判斷，以對臨床工作進行充分提示。所有本研究報告的臨床變異均在對應受檢者的樣本中經一代測序 ( Sanger 驗證 ) 驗證。

四、基于全外顯子組測序的拷貝數變異分析

利用 100 個獨立外顯子組測序數據作為內部控制。利用 GATK 從出 BAM 文件中讀取深度信息，并且過濾掉測序深度低于 10X 的部分。經過篩選后，利用算法分析每個樣本的測序深度信息以及Z-score?？截悢底儺愅ㄟ^ Z-score 分析并且人工分析 BAM 文件中的特定區(qū)域。

五、實時熒光定量 PCR

對家系 23 ( 圖1 ) 及一健康者血樣，進一步采用熒光聚合酶鏈式反應 ( Quantitative Real-time PCR )進行驗證。本研究使用 SYBR?Green PCR Master Mix( Applied biosystem ) 試劑。PCR 過程按照制造商提供的操作指南進行。本研究所涉及的三對引物序列如下：

ZRSin-F：CACCAGAACCAGGCCAAATA；

ZRSin-R：GAGTAGGAAGTCCAGCCTCT；

ZRSout-F：CACCAGCACAGAACTCTTCG；

ZRSout-R：CCAAACCATCCAGACATCCC；

β-actin-F：GACCTCTATGCCAACACAGT；

β-actin-R：AGTACTTGCGCTCAGGAGGA。

每個反應的 ΔΔCT 用來計算相對的拷貝數變異。

結 果

一、Temtamy-McKusick 分型

23 名先證者，共 30 側患肢，以 Temtamy-McKusick 分型，PPD I～IV 型分別為 PPD1 ( 21 /30 )、PPD2 ( 7 / 30 )、PPD3 ( 0 / 30 ) 和 PPD4 ( 2 / 30 )( 表1 )。

?

二、單純型和綜合征型

23 名先證者中，表現(xiàn)為單純性 PPD 者 18 例，合并其它畸形者 5 例，包括：3 例合并心臟畸形，其中 1 例除心臟畸形另合并血液系統(tǒng)異常；1 例合并腎臟畸形；1 例合并耳廓畸形及先天性甲狀腺功能減退 ( 表1 )。

三、家系調查結果

23 個家系中 15 個家系伴有家族史 ( 65% )，其中 11 個家系 ( 除先證者，其余患者 ) 同為復拇指畸形，包括父親 ( 3 / 11 )、母親 ( 3 / 11 )、同父母子女( 2 / 11 )、同父異母子女 ( 2 / 11 )、父系家庭二級親屬 ( 3 / 11 )、母系家庭二級親屬 ( 1 / 11 )；另有 4 例為父系或母系親屬的足部畸形，其中 3 例為足多趾畸形，1 例為第一足趾屈曲內收畸形 ( 表1 )。

四、基因檢測結果

先證者 17 ( 圖2 ) 經全外顯子測序發(fā)現(xiàn) SALL1( Spalt Like Transcription Factor 1，SALL1 ) 突變NM_002968.2:c.2712_2715 del (p.Gly906Valfs*59)為雜合突變，經 Sanger 驗證 ( 圖3 ) 該變異來源于其患者的父親，其父親臨床表型為手拇指多指畸形和耳廓發(fā)育不良。此變異在公共數據庫 gnomAD 中頻率為 0，同時此突變預測會造成 SALL1 閱讀框改變，根據美國醫(yī)學遺傳學會指南，此突變分類屬于致病變異。此患者臨床表現(xiàn)為拇指多指、皮疹、耳位低、耳廓發(fā)育不良 ( 雙側耳廓向外凸出，上耳廓過度折疊 )，甲狀腺功能減退和發(fā)育遲緩，符合Townes-Brocks 綜合征的診斷標準。

圖1 先證者 23 及其父親手部表型；先證者手部 X 線片圖2 先證者 17 體征：橈側多指、耳闊發(fā)育不良Fig.1 Phenotype of proband 23 and her father; X-ray image of the probandFig.2 Phenotype of proband 17: thumb duplication with protruding ears, over-folding of superior helices

家系 23 為一單純性 PPD 家系 ( 圖4 )，表現(xiàn)為雙側拇指多指、三節(jié)指骨拇及中環(huán)小指并指。全外顯子組測序在外顯子層面未發(fā)現(xiàn)可以解釋患者家族表型的點突變，但通過給予全外顯子組測序的拷貝數變異分析發(fā)現(xiàn)先證者 23 及其父在 7q36.3 ( Chr7:156,318,090-156,911,633 ) 存在雜合性擴增，此區(qū)域包含 ZRS。通過實時熒光定量 PCR 驗證發(fā)現(xiàn)，此擴增在患者及父親中存在，但在先證者母親及健康對照未見 ( 圖5 )。同時，既往有包含 ZRS 的雜合性擴增導致 PPD 合并并指的家系報道。因此，認為此家系中的 ZRS 雜合性擴增是導致先證者及其父親異常表型的原因。

圖3 家系 17 的 Sanger 驗證：1-先證者；2-先證者之父；3-先證者之母Fig.3 Sanger sequencing results of family 17: 1-proband;2-proband's father; 3-proband's mother

圖4 III-2 ( 先證者 )，II-3 及 III-1 為家系 23 的 3 位患者Fig.4 Pedigree of family 23. III-2 was the proband

先證者 19 除表現(xiàn)為多指畸形外，還表現(xiàn)為雙手拇指發(fā)育不良，并發(fā)有心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)異常，臨床疑診為范可尼貧血 ( Fanconi anemia )。全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)先證者攜帶有FANCI( Fanconi anemia complementation group I ) 復合雜合突變FANCI:c.3662del (p.Lys1221Argfs*3) 和FANCI: c.3006+3A>G(p.?)。此突變分別來自于先證者的母親及父親。FANCI: c.3662del (p.Lys1221Argfs*3) 為一移碼突變，預測造成蛋白質功能喪失。FANCI:c.3006+3A>G(p.?) 突變?yōu)橐豢拷鼉群油怙@子交界區(qū)域的突變，可能會影響 RNA 的剪切，進而影響蛋白質功能。通過 Human Splicing Finder (http://www.umd.be/HSF/) 進行預測 ( 圖6 )，此突變會破壞剪接供體，很大可能影響 RNA 剪接，進而影響蛋白質功能。但是，由于無直接證據證明 RNA 剪接受到影響，此突變仍然被定義為臨床意義未明突變。

另于家系 1、3、5、15 分別發(fā)現(xiàn)KCNH1( Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily H Member 1，KCNH1): c.2426 C>T (p.Pro809Leu)；BMPR1B( Bone Morphogenetic Protein Receptor Type 1B，BMPR1B): c.1503dup (p.Leu502Thrfs*8)；CITED2( Cbp/P300 Interacting Transactivator With Glu/Asp Rich Carboxy-Terminal Domain 2，CITED2): c.533G>T(p.Gly178Val) 和C2CD3( C2 Domain Containing 3 Centriole Elongation Regulator，C2CD3): c.441dup(p.Thr148Tyrfs*8)。但由于缺乏家系樣本信息或證據不足，這些突變被分類為臨床意義未明的突變。

圖5 ZRS 區(qū)域與鄰近區(qū)域的相對拷貝數。HD：健康對照。2 位患者 III-2 及 II-3 中 ZRS 區(qū)域相對拷貝數約為 1.5，而 2 位健康人中相對拷貝數約為 1Fig.5 The relative copy number of ZRS region and adjacent region.HD: healthy control. The relative copy number of ZRS region in two patients III-2 and II-3 was about 1.5, while that in two healthy people was about 1

圖6 Human splicing finder 網站針對剪切突變預測結果Fig.6 Prediction results of shear mutation on human splicing finder website

于先證者 2 和 10 分別檢測出RYR1( Ryanodine Receptor 1，RYR1): c.12242C>T (p.Thr4081Met) 及BRCA2: c.6440_ 6443del (p.His2147 Leufs*20)。RYR1: c.12242C>T (p.Thr4081Met) 突變既往在HGMD( Human Gene Mutation Database ) 數據庫中已報道。BRCA2(Breast Cancer genes 2，BRCA2): c.6440_6443del (p.His2147 Leufs*20) 為一移碼突變，預測對蛋白質功能有較大影響。但由于這兩個突變與患兒的手部畸形無關，因此這兩個突變被定義為二級發(fā)現(xiàn) ( Secondary findings ) (表2 )。

討 論

手部的 PPD 主要為拇、示指的多指、多并指及三節(jié)指骨拇指畸形，其中以拇指的多指畸形最為常見，后者臨床上多采用 Wassel 分型[10]，即根據多指出現(xiàn)的骨骼位置不同及是否合并有三節(jié)指骨拇指而細分為 7 個亞型。而從多指出現(xiàn)的病理生理機制與胚胎發(fā)育的關系等角度認識該畸形，則 Temtamy-McKusick 分型[11]更具價值。研究認為多指畸形發(fā)生于上肢前后軸 ( 橈、尺側軸 ) 分化過程中，因內外環(huán)境的影響引起信號傳導異常，進一步導致手指的形態(tài)及數量發(fā)生改變[12]，因此從胚胎發(fā)育的角度，多指畸形分為 PPD 和軸后性多指。Temtamy 和McKusick[11]將 PPD ( 趾 ) 分為 4 個亞型，PPD1 型為拇指 ( 趾 ) 的多指 ( 趾 ) 畸形；PPD2 型包括三節(jié)指骨拇指畸形 ( triphalangeal thumb，TPT ) 以及三節(jié)指骨拇指合并橈側多指、多并指 ( 以中、環(huán)、小指并指為主 ) 畸形 ( TPT-polysyndactyly syndrome，TPTPS )；PPD3 型為示指的多指畸形，此型最為少見；PPD4 型則為拇指多指畸形合并并指畸形，多以中環(huán)指并指為主。本研究 23 名先證者，共 30 側患肢，以 PPD1 型為主，其次為 PPD2 型，此兩型主要為SHH / ZRS基因異?；蛟撔盘柾烦霈F(xiàn)異常所致[12]。

SHH主要介導肢體前后軸的分化，其位于上肢芽后部，即肢體極化區(qū) ( the zone of polarizing activity，ZPA ) 內，SHH在 ZPA 內表達受 ZPA 增強調節(jié)序列，即ZRS的控制[12]。ZRS的點突變[2,4,13]和擴增[14-15]均可導致 PPD 的發(fā)生，至今已有 20 余種點突變被報道[12]，但關于ZRS雜合性擴增的報道較少[16]。本研究先證者 23 為 PPD2 型，屬于 TPTPS，該綜合征罕見。該患者與其父在 7q36.3 (Chr7:156,318,090-156,911,633) 區(qū)域存在雜合性擴增，此區(qū)域包含ZRS，本研究結果再次確認了ZRS區(qū)域異常會導致SHH信號的錯誤表達進而引起 TPT-PS。

表2 變異信息匯總Tab.2 Summary of gene variations

也有研究提示SHH的表達具有時間和劑量的依賴性[17]。異位SHH信號在枝芽發(fā)育過程中所表達的強度和持續(xù)時間將決定 PPD 的嚴重程度。Lam 等[17]通過在雞的胚胎枝芽中加入平滑激動劑( smoothened-agonist，SAG ) 和維甲酸 ( retinoic acid )使枝芽內產生異位SHH，從而出現(xiàn) PPD 以及前臂畸形，包括橈側發(fā)育不良，作者推論 PPD 和橈側發(fā)育不良的發(fā)生可能存在共同的信號通路。本組病例先證者 19，為 PPD1 型合并橈側發(fā)育不良，支持 Lam的假說。該患兒為一攜帶FANCI基因突變的復合雜合子，F(xiàn)ANCI: c.3662del (p.Lys1221Argfs*3) 來源于母親，F(xiàn)ANCI: c.3006+3A>G(p.?)** 來源于父親。突變導致的范可尼貧血為一隱性遺傳病，該突變的分布符合遺傳模式。雖然該剪接突變尚不能定為致病變異，但患兒手部、心臟畸形、生長發(fā)育滯后及血液系統(tǒng)異常等表型支持范可尼貧血診斷，同時經過軟件預測發(fā)現(xiàn)此突變很有可能影響 RNA 剪切。后續(xù)須進一步試驗驗證患兒細胞中 RNA 的剪切狀態(tài)，以明確其診斷。

先證者 17 經全外顯子測序發(fā)現(xiàn)SALL1基因突變，SALL1蛋白是細胞內轉錄因子，通過與 DNA的特定區(qū)域結合來發(fā)揮其活性[18]。SALL1基因突變可導致該蛋白異常變短，引起細胞內功能紊亂。SALL1基因突變可導致 Townes-Brocks 綜合征1 型[18-20]( Townes-Brocks Syndrome 1，TBS1，MIM:107480 )。該綜合征極為罕見，有文獻[19]報道該病發(fā)病率預計為 1 / 250000，其主要表現(xiàn)為以肛門閉鎖、耳發(fā)育不良 ( 如耳輪畸形、耳前耳贅、聽力受損等 )、拇指畸形 ( 如拇指三節(jié)指畸形、拇指多指畸形等 ) 三聯(lián)征[18]。多數患者合并至少兩種體征，其它常見次要特征包括腎功能不全 ( 伴或不伴腎臟結構異常，如輕度腎扭轉不良、異位腎、馬蹄腎、腎發(fā)育不全、多囊腎、膀胱輸尿管返流等 )、先天性心臟病、足部畸形等。少數患者還存在智力障礙、虹膜缺損以及生長發(fā)育落后等，也偶有報道合并先天性甲狀腺功能減退者[19]。本研究報告了因SALL1基因突變所致 Townes-Brocks 綜合征 1 型 1 例，為綜合征性 PPD，且該患兒合并先天性甲狀腺功能減退罕見，且該變異未曾在既往文獻中報道?；?Lam 的研究，對于綜合征性的 PPD，盡管有已知特定的致病基因，但最終是否也是因為產生異位SHH信號所致，還是通過其它信號通路誘導PPD發(fā)生，還須進行進一步的動物試驗及功能試驗研究。

本組研究中先證者 2 和 10 分別檢測出RYR1:c.12242C>T (p.Thr4081Met) 及BRCA2: 6440_ 6443del(p.His2147L eufs*20)。前者既往在患有惡性高熱的患者中已報道。惡性高熱[21]是一種具有家族遺傳性的亞臨床肌肉病，主要是由吸入麻醉藥和琥珀膽堿所觸發(fā)的骨骼肌異常高代謝狀態(tài)。臨床表現(xiàn)為全身肌肉痙攣，體溫急劇升高，酸中毒，可導致多器官功能衰竭甚至死亡，發(fā)病兇險，如果不能及時診斷及處理，可危及患者生命。該名患兒術前行基因檢查提示存在熱性高熱易感性，因此術前麻醉評估及準備充分，通過選擇不同的麻醉藥物有效的避免惡性高熱的發(fā)生。另 1 例患兒發(fā)現(xiàn)BRCA2基因突變，雖然目前患兒家庭尚無乳腺癌或其它癌癥的表現(xiàn)，但是此發(fā)現(xiàn)有助于腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早治療，極大的改善預后。

通過本組病例遺傳學檢測，發(fā)現(xiàn)ZRS雜合性擴增所致的非綜合征性 PPD 1 例及SALL1基因突變導致 Townes-Brocks 綜合征，即綜合征性 PPD 1 例。筆者認為橈側多指為手部常見畸形，臨床診斷多不復雜，但一定要全面查體，減少綜合征性多指的漏診，誤診。再者對于肢體先天畸形患者，因基因異?？赡苄源螅铱砂橛卸嘞到y(tǒng)病變，應盡早進行遺傳檢測，以便明確診斷，綜合治療，同時有利于日后遺傳咨詢。