朱世文，王 剛，羅文娟，王麗雯，王 倩

惡性黑素瘤（malignant melanoma，MM）是一種源自黑素細(xì)胞的惡性腫瘤，患病人數(shù)全球每年大約有30 萬人[1]。雖然近年來MM 的治療方法進(jìn)展迅速，但是癌癥患者的病死率仍然較高。研究發(fā)現(xiàn)microRNA（miRNA）在MM 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2,3]。miR-508-3p 已經(jīng)在多種癌癥中作為抑癌基因被報(bào)道過，如腎癌、三陰性乳腺癌等[4,5]。但miR-508-3p 在MM 細(xì)胞中的表達(dá)及其作用報(bào)道甚少。本研究以MM 細(xì)胞系A(chǔ)375 為對(duì)象，探討miR-508-3p與叉頭框轉(zhuǎn)錄因子C1（Forkhead box C1，F(xiàn)OXC1）的關(guān)系及其在MM 中的表達(dá)和作用機(jī)制，為尋找MM 的分子治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

HEM 正常黑素細(xì)胞及A375 MM 細(xì)胞（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基（美 國Gibco 公 司）。LipofectamineTM2000（美國Thermo Fisher 公司）。二甲基亞砜（DMSO）、3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]、Trizol 試劑、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒（上海生工生物科技有限公司）。miR-508-3p、U6、FOXC1 和GAPDH 引物均由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。熒光素酶檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)試劑盒（美國Promega 公司）。miR-508-3p mimics、miR-508-3p inhibitor 及各自陰性對(duì)照（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。Transwell 小室（美國Corning 公司），matrigel 膠（美國B＆D 公司）。蛋白雙染marker、顯影液、5%脫脂奶粉、小鼠抗FOXC1 單克隆抗體、小鼠抗GAPDH 單克隆抗體及山羊抗鼠IgG 二抗（上海生工生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-508-3p 和FOXC1 mRNA 的表達(dá) 收集生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期A375 細(xì)胞和正常黑素HEM 細(xì)胞，分別加入TRIzol 提取RNA，再參照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒檢測(cè)miR-508-3p 的表 達(dá)。miR-508-3p 正向：5'-CCACCTTCAGCTGAG TGTAGTG-3'，反向：5'-CCACCAAATATGCGTTACG TGAT-3'；U6 正 向：5'-GCTTCG GCAGCA CA-3'， 反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3'。FOXC1 正向5'-CGGGAGATGTTCGAGTCACA-3'， 反向：5'-TGTTCGCTGGTGTGGTGAAT-3' ；GAPDH 正 向：5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3'，GAPDH 反 向：5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期A375細(xì)胞按照每孔2×105個(gè)接種至6孔細(xì)胞板上，置于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜。制備終濃度為80 nmol/L miR-508-3p mimics或80 nmol/L miR-508-3p LipofectamineTM2000脂質(zhì)體復(fù)合物，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)置對(duì)應(yīng)的對(duì)照組分別為mimcs NC組、inhibitor NC組。

1.2.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力 收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的A375細(xì)胞，每孔2×104個(gè)接種于96孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO振蕩15 min，用酶標(biāo)儀于490 nm檢測(cè)各孔的A值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組－A本底組)÷(A對(duì)照組－A本底組)×100%。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)各組遷移和侵襲的能力 收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的A375細(xì)胞，每孔2×104個(gè)接種于matrigel膠包被/未包被的Transwell小室中，下室中加入600 μl含血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定30 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫溶液染色，用棉簽擦掉小室的上層細(xì)胞，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)各組miR-508-3p和FOXC1 mRNA的表達(dá) 收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的A375細(xì)胞，按照1.2步驟進(jìn)行操作。

1.2.6 Western blot 實(shí)驗(yàn)各組FOXC1 蛋白的表達(dá) 收集各組轉(zhuǎn)染48 h 后的A375 細(xì)胞，分別加入RIPA 裂解液并在冰上放置20 min，4℃ 13 000 r/min 離心20 min，采用BCA 試劑盒測(cè)定上清的蛋白含量。取35 μg 總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)PVDF 膜，用2%BSA 封閉液封閉，分別加入FOXC1 一抗4℃過夜，以GAPDH 抗體為參照，再加入二抗室溫孵育1 h。ECL 曝光成像，采用Alpha Imager HP 凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)FOXC1 和miR-508-3p結(jié)合 建野生型（FOXC1-W）和突變型（FOXC1-M）的FOXC1 3'-UTR 雙熒光報(bào)告質(zhì)粒。將對(duì)數(shù)生長期的A375 細(xì)胞以每孔105個(gè)接種至12 孔細(xì)胞板上，將FOXC1-W、FOXC1-M 與miR-508-3p mimics 或mimics NC 陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至A375 細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置6 個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h 后，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組之間的比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-508-3p和FOXC1在HEM正常黑素細(xì)胞及A375 MM細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明，A375 MM 細(xì)胞中miR-508-3p 的相對(duì)表達(dá)量為9.84±0.46，與HEM 正常黑素細(xì)胞26.30±0.43 比較，明顯降低（t=48.67，P＜0.001）。A375 MM 細(xì)胞中FOXC1 的相對(duì)表達(dá)量為18.00±0.87，與HEM 正常黑素細(xì)胞11.30±0.31比較，明顯升高（t=7.22，P＜0.001）（圖1）。

2.2 過表達(dá)/降低miR-508-3p對(duì)MM A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

MTT 和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與inhibitor NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-508-3p inhibitors 組的A375 細(xì)胞的增殖（t=9.552，P＜0.001）、侵襲（t=4.25，P=0.01）及遷移（t=7.31，P=0.002）能力明顯增強(qiáng)；與mimics NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-508-3p mimics 的A375 細(xì)胞的增殖（t=26.56，P＜0.001）、侵襲（t=7.29，P=0.002）及遷移（t=3.31，P=0.03）能力明顯降低（圖2）。

圖1 miR-508-3p和FOXC1在HEM正常黑素細(xì)胞及A375 MM細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 過表達(dá)/降低miR-508-3p對(duì)MM A375細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

2.3 過表達(dá)/降低miR-508-3p對(duì)MM A375細(xì)胞中miR-508-3p和FOXC1表達(dá)的影響

RT-PCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與inhibitor NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-508-3p inhibitor 組的A375 細(xì)胞中miR-508-3p 的表達(dá)明顯下調(diào)（t=24.82，P＜0.001），F(xiàn)OXC1 mRNA（t=66.11，P＜0.001）和蛋白（t=10.73，P＜0.001）的表達(dá)明顯升高；與mimics NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-508-3p mimics 組的A375 細(xì)胞中miR-508-3p 的表達(dá)明顯升高（t=43.49，P＜0.001），F(xiàn)OXC1 mRNA（t=101.1，P＜0.001）和蛋白（t=9.52，P=0.001）的表達(dá)明顯降低（圖3）。

2.4 FOXC1是miR-508-3p的靶基因

應(yīng)用Starbase 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)FOXC1 3'-UTR 上存在miR-508-3p 的結(jié)合位點(diǎn)（圖4A）。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在FOXC1-W 組中，與NC mimics 組相比，miR-508-3p mimics 組熒光素酶的活力值明顯降低（t=19.60，P＜0.001）。但在FOXC1-M 組中，熒光素酶的活性無明顯變化（圖4B），證明miR-508-3p 靶向結(jié)合FOXC1 的3'-UTR。

圖3 過表達(dá)/降低miR-508-3p對(duì)MM A375細(xì)胞中miR-508-3p和FOXC1表達(dá)的影響

圖4 miR-508-3p與FOXC1的靶向關(guān)系

3 討論

國內(nèi)黑素瘤新發(fā)病例每年約有2 萬例，特點(diǎn)為快速發(fā)生，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，嚴(yán)重影響人民健康[6]。目前對(duì)于黑素瘤診斷包括全身檢查、組織病理學(xué)檢查、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查等，但仍無特異性的生物學(xué)標(biāo)志，因此在MM 中對(duì)于生物學(xué)標(biāo)志的選擇以及潛在機(jī)制的研究顯得尤為重要[7]。

miRNA 是一類非編碼的含有20 ～25 個(gè)核苷酸內(nèi)源性小RNA，可以結(jié)合在靶基因mRNA 3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)，從而降解靶基因的mRNA，抑制蛋白的翻譯。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在MM 的發(fā)生和發(fā)展過程中的作用不可忽視[8,9]。miR-508-3p 屬于miR-506 家族，在多種腫瘤中異常表達(dá)，扮演抑癌基因角色[4,5,10]。在骨肉瘤組織中，miR-508-5p 表達(dá)降低且與Enneking 分期和堿性磷酸酶水平有關(guān)[10]。在腎癌中，miR-508-3p 在組織和患者血漿中顯著下調(diào)，且在體外過表達(dá)miR-508-3p 可抑制786-0 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移[4]。在三陰性乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)，miR-508-3p 在三陰性乳腺癌組織和細(xì)胞株(BT-549 and MDA-MB-231)中的表達(dá)明顯下降，且miR-508-3p 通過靶向作用鋅指轉(zhuǎn)錄因子（zinc finger transcription factor，ZEB1），進(jìn)而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而可以抑制三陰性乳腺癌侵襲性[5]。本研究采用miR-508-3p mimics 轉(zhuǎn)染的A375 細(xì)胞，其增殖、遷移、侵襲能力均降低，采用miR-508-3p inhibitors 轉(zhuǎn)染的A375 細(xì)胞，其增殖、遷移、侵襲能力均升高。以上結(jié)果表明miR-508-3p 在MM 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用。值得注意的是，Liu 等[11]研究表明，下調(diào)miR-508-3p 可以通過調(diào)節(jié)SRY（sex-determining region Y）-box6基因的表達(dá)促進(jìn)黑素細(xì)胞中黑素生成，這說明在MM 患者中，miR-508-3p 的表達(dá)下降，不但可能促進(jìn)癌癥的發(fā)展，而且可能會(huì)促進(jìn)黑素的生成。

FOXC1 是FOX 蛋白家族成員之一，也被命名為FKHL7 553 個(gè)氨基酸編碼，相對(duì)分子質(zhì)量57 000。目前越來越多的研究表明，F(xiàn)OXCl 在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及耐藥中亦扮演著重要的角色[12]。研究證實(shí)在肝癌[13]、MM[14]、胃癌[15]、肺癌[16]、乳腺癌[17]等癌組織中FOXC1 的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且高表達(dá)的FOXCl 可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性。另外，Gao 等[18]研究表明在喉鱗狀細(xì)胞癌降低FOXC1，細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為受到抑制。本研究應(yīng)用Starbase 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)FOXCl 存在miR-508-3p 的潛在的結(jié)合位點(diǎn)。本研究通過熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)證實(shí)了miR-508-3p 和FOXCl 的靶向關(guān)系。結(jié)合上述內(nèi)容，筆者推測(cè)miR-508-3p 可以通過靶向FOXCl 抑制A375 細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-508-3p 在MM 中低表達(dá)，在MM 細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著抑癌作用，這種抑癌作用的機(jī)制可能與抑制FOXCl 的表達(dá)有關(guān)。本研究為miR-508-3p 有可能成為MM 分子診斷的靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。