王輝 ，李思思，吳志新，3，許荔立，田丁，陳孝煊，3

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070； 2.湖北省水生動物病害防控工程技術(shù)研究中心，武漢 430070；3.水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實驗教學(xué)示范中心(華中農(nóng)業(yè)大學(xué))，武漢 430070

朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells,LCs)是存在于哺乳動物表皮復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞之間唯一的抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC)，能夠有效捕獲抗原并將其傳遞給T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，在特異性免疫反應(yīng)的發(fā)生以及免疫耐受的維持方面發(fā)揮重要作用[1-2]。

LCs生物學(xué)功能的發(fā)揮是由眾多基因共同調(diào)控的。研究表明，LCs能夠表達(dá)CD207、CD1a、Toll-樣受體(TLRs)、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子(MHC-Ⅱ)以及共刺激分子CD80和CD86等抗原呈遞相關(guān)基因[3-4]。局部高表達(dá)的IL-1β能夠?qū)Cs招募到炎癥發(fā)生的位置，吞噬侵入的病原菌[5]。CD207和CD1a不僅被認(rèn)為是LCs相對特異性的分子標(biāo)記，更是呈遞非多肽抗原的關(guān)鍵分子[6-7]。此外，LCs表面的TLRs能夠識別不同類型的抗原，抗原經(jīng)過加工、處理后與細(xì)胞表面的MHC-II分子結(jié)合形成MHC-II-抗原肽復(fù)合物，并在趨化因子及其受體的共同作用下遷移到淋巴器官；之后，與高表達(dá)的共刺激分子CD80和CD86共同作用，活化幼稚T淋巴細(xì)胞[8]。

迄今為止，免疫組化和透射電鏡技術(shù)是研究硬骨魚類朗格漢斯細(xì)胞的主要方法[9-10]。Langerin/CD207主要表達(dá)于朗格漢斯細(xì)胞表面，是其生長和發(fā)育過程中不可或缺的重要分子[11]。因此，常以CD207抗體用于朗格漢斯細(xì)胞的鑒定。但至今還未在硬骨魚類中找到哺乳動物CD207分子同系物。因此，一直以人CD207多克隆抗體用于硬骨魚類朗格漢斯細(xì)胞的鑒定。目前，已經(jīng)通過人CD207多克隆抗體在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鮭(Atlanticsalmon)和斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)等多種硬骨魚類的免疫器官中發(fā)現(xiàn)朗格漢斯細(xì)胞的存在[12-13]。此外，伯貝克顆粒(Birbeck granule)是朗格漢斯細(xì)胞特異性的形態(tài)學(xué)標(biāo)記，其通常呈網(wǎng)球拍狀或者桿狀并圍繞中心粒呈放射狀排列[11]。有研究者通過這一形態(tài)特征在大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鮭(Atlanticsalmon)和斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)等多種硬骨魚類的免疫器官中發(fā)現(xiàn)朗格漢斯細(xì)胞的存在[10,12-15]。但關(guān)于黃顙魚朗格漢斯細(xì)胞的研究尚未見報道。本研究中，我們通過免疫組化和透射電鏡技術(shù)觀察到黃顙魚朗格漢斯細(xì)胞的形態(tài)特點、HE染色分析鯰愛德華氏菌對黃顙魚鰓和腸道的病理損傷，并采用熒光定量PCR分析了鯰愛德華氏菌感染后黃顙魚免疫相關(guān)組織內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞功能相關(guān)基因的表達(dá)情況，以期為黃顙魚細(xì)胞免疫及抗菌感染機(jī)制的研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚、菌株與樣品采集

本試驗中所用黃顙魚購自湖北省武漢市黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司，養(yǎng)殖在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地循環(huán)水系統(tǒng)中，規(guī)格為體長(15±3) cm、體質(zhì)量(40±5) g。試驗開始前，暫養(yǎng)2周以適應(yīng)實驗室環(huán)境：水溫23～25 ℃，溶解氧5～7 mg/L，光周期為光照∶黑暗=12 h∶12 h。分別于每天09:00和16:00投喂商業(yè)飼料，投喂量約為黃顙魚總體質(zhì)量的2%～3%。

鯰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)由中國科學(xué)院水生生物研究所李愛華先生饋贈。菌種經(jīng)劃線活化后，挑選單菌落接種到液體BHI培養(yǎng)基(Hopebio，青島)中，于28 ℃搖床中培養(yǎng)17 h。通過離心收集所有細(xì)菌，并用滅菌的PBS沖洗2次以去除多余的培養(yǎng)基。獲得的細(xì)菌經(jīng)過梯度稀釋調(diào)整其濃度為1.0×106CFU/mL，備用。

暫養(yǎng)結(jié)束后，選擇100尾健康黃顙魚，分為感染組和對照組(每組50尾)，分別腹腔注射0.1 mL(1.0×106CFU/mL)的鯰愛德華氏菌菌液和滅菌PBS。分別在感染后3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d時，從每組中隨機(jī)取6尾黃顙魚，經(jīng)MS-222麻醉后，取頭腎、脾臟、鰓和腸道組織迅速放入Trizol(TaKaRa，大連)中，-20 ℃保存，用于熒光定量PCR。此外，為了更加直觀地研究鯰愛德華氏菌對黃顙魚的鰓和腸道組織的損傷，分別在感染后第1、4和第7 天時，從感染組中隨機(jī)選3尾黃顙魚，經(jīng)過MS-222麻醉后，取鰓和腸道固定于4%的多聚甲醛中，用于HE染色。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

取健康黃顙魚頭腎、脾臟、皮膚、鰓和腸道組織迅速轉(zhuǎn)移到4% 多聚甲醛中固定24 h。固定后的組織依次通過60%、75%、85%、90%、95%乙醇及無水乙醇溶液進(jìn)行脫水。之后，將脫水后的組織浸入二甲苯中使其達(dá)到透明狀態(tài)，并經(jīng)過浸蠟和包埋等步驟將組織完全地包埋在石蠟中。用切片機(jī)將包埋好的組織切成5 μm的切片。

切片依次經(jīng)過二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇和自來水漂洗后脫去石蠟并使切片水化。將切片依次經(jīng)過抗原修復(fù)(0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(Servicebio，武漢))、血清封閉(10%的BSA封閉液(Servicebio，武漢))、人CD207多克隆抗體(Bioss，北京)孵育、HRP標(biāo)記的山羊抗兔鼠通用二抗(Protein Tech，美國)孵育以及DAB顯色液(Sangon Biotech，上海)顯色等步驟。對照組中以同濃度的兔源IgG多克隆抗體(Servicebio，武漢)代替人CD207多克隆抗體。最后，經(jīng)過蘇木素溶液復(fù)染以及一系列濃度的無水乙醇脫水后以中性樹膠封片。顯微鏡觀察并采集圖像。

1.3 透射電鏡觀察

取新鮮的黃顙魚頭腎和脾臟組織，迅速投入2.5%的戊二醛溶液(Servicebio，武漢)中4 ℃固定4 h。固定后的樣品放于1%四氧化鋨-0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.4)中浸泡固定2 h后，依次經(jīng)過50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液、100%丙酮Ⅰ、100%丙酮Ⅱ脫水，每次15 min。脫水后的組織經(jīng)過滲透、Epon812樹脂包埋、切片、鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和乙醇溶液和枸櫞酸鉛溶液各染色15 min)。切片在室溫環(huán)境下過夜干燥，通過透射電子顯微鏡(HT7700)觀察結(jié)果，并采集圖像。

1.4 蘇木精-伊紅染色

將黃顙魚鰓和腸道組織的石蠟切片經(jīng)過脫蠟水化后，分別用蘇木精染料和伊紅染料對細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色。最后以中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.5 熒光定量PCR

采用Trizol法提取組織中總RNA，通過微量分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的質(zhì)量和完整性。將完整的樣品調(diào)整質(zhì)量濃度為300 ng/μL，按照諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme，南京)操作指南去除殘留基因組污染，在Random primers/Oligo (dT)23VN 混合引物 和HiScript II 反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20 ℃。

根據(jù)NCBI中公布的黃顙魚IL-1β、TNF-α、IL-10、TLR-4和β-actin基因的編碼區(qū)設(shè)計熒光定量PCR特異性引物，并由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成(表1)。PCR體系包括：10 μL 的2×SYBR qPCR Mix(Aidlab，北京)，2 μL的模板cDNA，7 μL的ddH2O，上下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃，2 min；(94 ℃，10 s；56 ℃，15 s；72 ℃，20 s)×40。每個樣品重復(fù)3次。以β-actin基因作為內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后，通過熔解曲線和測序分析確定反應(yīng)體系中無非特異性擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的表達(dá)水平。

表1 熒光定量PCR所使用的引物序列 Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

所有試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)的形式表示，并通過SPSS 21.0對其進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗分析試驗組和對照組中目的基因表達(dá)差異的顯著性。P<0.05，被認(rèn)為在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著性差異，以*表示；P<0.01，被認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)上存在極顯著差異，以**表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃顙魚頭腎和脾臟中CD207陽性細(xì)胞的鑒定

通過免疫組化技術(shù)，在黃顙魚頭腎和脾臟中均發(fā)現(xiàn)CD207陽性細(xì)胞的存在(圖 1)，但是鰓、皮膚和腸道中并未發(fā)現(xiàn)CD207陽性細(xì)胞。此外，細(xì)胞膜上CD207蛋白的表達(dá)量高于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2 黃顙魚朗格漢斯細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

在透射電鏡下，黃顙魚頭腎和脾臟中均發(fā)現(xiàn)朗格漢斯細(xì)胞。黃顙魚朗格漢斯細(xì)胞與其他脊椎動物朗格漢斯細(xì)胞類似，細(xì)胞質(zhì)中的伯貝克顆粒圍繞著中心粒呈放射狀排列，并且這些顆粒的形態(tài)多呈現(xiàn)為圓形(圖2A，B)。

圖中箭頭所示為CD207陽性細(xì)胞。The CD207 positive cells are showed with arrows.

N代表細(xì)胞核，箭頭所示為伯貝克顆粒。The nucleus and the Birbeck granule are denoted with “N” and arrows,respectively.

圓形的伯貝克顆粒內(nèi)存在由高密度物質(zhì)組成的圓形致密顆粒，而有的伯貝克顆粒內(nèi)沒有致密顆粒(圖 3A)；有的伯貝克顆粒內(nèi)僅有一個致密顆粒，分布于中心或偏向一側(cè)(圖 3B、C)，此外，還有的伯貝克顆粒內(nèi)含有2個致密顆粒，均分布于中心或各居一側(cè)(圖 3D、E)。而且，這些致密顆粒在不規(guī)則的桿狀伯貝克顆粒中的數(shù)量較多，高達(dá)5個(圖 3J)。除此之外，在圓形的伯貝克顆粒內(nèi)還觀察到有管狀結(jié)構(gòu)(圖 3F、G)。同時，多泡小體類似的結(jié)構(gòu)也存在于黃顙魚朗格漢斯細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖 3H、I)。

2.3 鯰愛德華氏菌感染對黃顙魚鰓和腸道的病理損傷

根據(jù)HE染色結(jié)果，鯰愛德華氏菌感染后，黃顙魚鰓和腸道出現(xiàn)不同程度的病理損傷，并且隨著感染時間的增加，損傷程度不斷加劇(圖 4)。例如，鰓絲上皮細(xì)胞壞死、脫落、鰓絲變短等；腸道中，腸上皮細(xì)胞之間的杯狀細(xì)胞數(shù)量增多。

圖3 黃顙魚伯貝克顆粒的結(jié)構(gòu)特點

箭頭所示為鰓上皮細(xì)胞壞死、脫落，三角所示為鰓絲組織增生；框內(nèi)的部分表示為腸道中的杯狀細(xì)胞。 The necrosis and exfoliation of epithelial cells are denoted with arrows,and the hyperplasia of gill filament is showed by triangle. The goblet cells in the intestine is represented by box.

2.4 鯰愛德華氏菌感染對朗格漢斯細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

q-PCR的結(jié)果顯示，鯰愛德華氏菌能夠誘導(dǎo)黃顙魚免疫器官中朗格漢斯細(xì)胞功能相關(guān)基因發(fā)生不同程度的表達(dá)上調(diào)(圖 5)。在頭腎、鰓和腸道中，IL-1β在感染后3 h時表達(dá)量最高，之后下降，在12 h至7 d內(nèi)表達(dá)量上調(diào)的變化不明顯；而在脾臟中，感染后6 h時的表達(dá)量最高，12 h時迅速下調(diào)并顯著低于對照組，在1～7 d內(nèi)緩慢上調(diào)。TLR-4在頭腎、脾臟、鰓和腸道中均顯著上調(diào)，并且在2 d時表達(dá)量最高。頭腎和脾臟中，IL-10僅在感染后3 h時的表達(dá)量顯著高于對照組，鰓中大部分時間點的表達(dá)量顯著低于對照組，腸道中的表達(dá)量變化不明顯。TNF-α基因在頭腎中的表達(dá)量在3 h到3 d內(nèi)逐漸上調(diào)并且第3 天時達(dá)到峰值，在腸道中的表達(dá)量從3 h到5 d內(nèi)逐漸上調(diào)，并且在第5天時達(dá)到最大值。在鰓中，TNF-α基因僅在3 h和2 d時的表達(dá)量顯著高于對照組，而脾臟中TNF-α基因在1 d、3 d、5 d時的表達(dá)量顯著低于對照組，其他時間點與對照組沒有顯著性差異。

差異顯著(P<0.05)以 “*”表示，差異極顯著(P<0.01)以“**”表示。圖中虛線代表對照組。The statistically significant difference and extremely significant difference are denoted with “*” and “**” , respectivelly. The dotted line in these figures represennts the control group.”

3 討 論

樹突狀細(xì)胞作為連接固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的橋梁，在免疫反應(yīng)的發(fā)生以及維持免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用。目前已經(jīng)在虹鱒[16]、斑馬魚[17]和草魚[18]等眾多硬骨魚類中分離出樹突狀細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)硬骨魚類樹突狀細(xì)胞與哺乳動物類似，都具有吞噬、運(yùn)動以及刺激幼稚T淋巴細(xì)胞增殖的能力。作為樹突狀細(xì)胞亞型之一，朗格漢斯細(xì)胞在免疫反應(yīng)過程中同樣發(fā)揮重要作用。本研究采用免疫組化和透射電鏡技術(shù)，首次從形態(tài)學(xué)上證實黃顙魚朗格漢斯細(xì)胞的存在，并采用熒光定量PCR，從mRNA水平上分析了鯰愛德華氏菌感染后，IL-1β、TNF-α、IL-10和TLR-4等朗格漢斯細(xì)胞功能相關(guān)基因在黃顙魚免疫相關(guān)組織中的表達(dá)情況。

免疫組化顯示，與其他硬骨魚類類似，人CD207多克隆抗體能夠識別黃顙魚頭腎和脾臟中表達(dá)的CD207蛋白，并且脾臟中CD207陽性細(xì)胞的數(shù)量高于頭腎，與斑點叉尾鮰中的結(jié)果相反[13]。此結(jié)果可能是因為人CD207分子與黃顙魚CD207分子核酸序列的保守度不高，人CD207多克隆抗體不能完全特異性結(jié)合黃顙魚CD207蛋白[19]。由于缺乏可用的黃顙魚CD207序列信息以及相應(yīng)抗體，具體原因有待于進(jìn)一步研究。除此之外，在這些陽性細(xì)胞中，黃顙魚CD207蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平高于細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平。此結(jié)果符合CD207蛋白的特性并且與斑點叉尾鮰中觀察到的結(jié)果類似[9,13]。透射電鏡可直觀地觀察到黃顙魚朗格漢斯細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，黃顙魚朗格漢斯細(xì)胞與哺乳動物或者其他硬骨魚類朗格漢斯細(xì)胞相似，也是多個伯貝克顆粒圍繞著中心粒呈放射狀排列[20]。此外，相比于鮭科魚類等其他脊椎動物，黃顙魚伯貝克顆粒的形態(tài)與斑點叉尾鮰伯貝克顆粒的形態(tài)更為接近，而與其他脊椎動物卻有明顯差異，這可能與黃顙魚和斑點叉尾鮰同屬于鯰形目有關(guān)。

鯰愛德華氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，主要感染黃顙魚等鯰形目魚類。鯰愛德華氏菌感染后，黃顙魚的鰓和腸道均發(fā)生不同程度的病理損傷。為了更詳細(xì)了解朗格漢斯細(xì)胞在細(xì)菌感染過程中的調(diào)控機(jī)制，通過熒光定量PCR檢測了細(xì)菌感染后黃顙魚免疫器官內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞功能相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，鯰愛德華氏菌感染后，黃顙魚頭腎、脾臟、鰓和腸道中IL-1β基因的表達(dá)量在感染前期顯著上調(diào)，此結(jié)果說明大量的朗格漢斯細(xì)胞可能通過高表達(dá)的IL-1β被招募到病原菌的入侵位點，吞噬侵入的病原菌[5]。TNF-α基因僅在頭腎、鰓和腸道中顯著上調(diào)，并且與IL-1β基因的表達(dá)模式不同，表明這2個基因可能是通過不同的信號通路招募朗格漢斯細(xì)胞遷移的[4]。與此不同，IL-10作為一種抑炎因子，其表達(dá)量僅在脾臟和頭腎中顯著上調(diào)，說明IL-10主要是由頭腎和脾臟中的免疫細(xì)胞合成并釋放出來，調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)[21]。Toll樣受體作為模式識別受體的一種，主要識別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的脂多糖[22]。我們發(fā)現(xiàn)，鯰愛德華氏菌感染后，TLR-4基因在黃顙魚頭腎、脾臟、鰓和腸道中均顯著上調(diào)，說明鯰愛德華氏菌感染魚體之后，可能通過合成脂多糖引起機(jī)體炎癥[23]。上述結(jié)果表明，朗格漢斯細(xì)胞可能參與了魚體抗鯰愛德華氏菌感染的免疫反應(yīng)。

本試驗通過免疫組化技術(shù)證實了黃顙魚頭腎、脾臟等免疫器官中具有能與人CD207多克隆抗體結(jié)合的朗格漢斯細(xì)胞分子標(biāo)記CD207蛋白，用透射電鏡觀察了黃顙魚朗格漢斯細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。通過熒光定量PCR，從mRNA水平上研究了細(xì)菌感染后黃顙魚免疫器官內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞功能相關(guān)基因的表達(dá)。對黃顙魚朗格漢斯細(xì)胞的研究，將有助于我們更好地了解朗格漢斯細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的作用，可為細(xì)菌性疾病的防控提供理論基礎(chǔ)。