劉曉靜，林楊，呂卓，石玲，李亞玲，李玲，何歡，朱璇*，張志東*

1(新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所,新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室，新疆 烏魯木齊，830091) 2(新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)

桃作為五果之首[1]，含有多種功能性的糖、酸、蛋白質(zhì)、粗纖維、維生素及無機鹽、胡蘿卜素、尼克酸等營養(yǎng)物質(zhì)，易于人體的消化吸收，具有美膚、清胃、潤肺、祛痰等功效[2-3]。同時，桃果中的含鐵量為蘋果和梨的4～6倍，能夠有效預防缺鐵性貧血[4-5]。桃起源于中國，且種植面積及產(chǎn)量均居世界首位。新疆因特殊的地理條件，日照充足，晝夜溫差大，利于瓜果糖分的累積，是久負盛名的“瓜果之鄉(xiāng)”。桃作為新疆的特色水果，在南北疆廣泛種植。常見的種類有水蜜桃、油桃、蟠桃等，不僅是鮮食的佳品，也可加工成桃干、罐頭、果汁等產(chǎn)品，具有極高的食用和經(jīng)濟價值，是當?shù)氐奶厣止娃r(nóng)民增收的手段[6-7]。目前，國內(nèi)外相關研究主要集中于其采后生理生化變化、保鮮技術方法等方面[8-9]。近年來，植物內(nèi)生菌因具有促生、固氮、抑菌防病、提高宿主抗逆能力等多種生物學作用被作為研究的熱點，且在已開展的植物研究中均發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生菌的存在[10-11]。然而，暫未見桃果內(nèi)生菌的相關研究，對其內(nèi)生菌的組成與分布規(guī)律，是否存在與人體健康相關的潛在功能微生物等相關研究，更是鮮有報道。

因此，本研究以新疆特色油桃、水蜜桃、蟠桃為試驗對象，采用高通量測序技術，對3類桃果采后內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性進行較為全面的解析，并對其中存在的與人體健康潛在相關的微生物進行了分析。本文的開展，為揭示桃果實內(nèi)生細菌的多樣性，進一步研究桃果內(nèi)生細菌群落與人體健康潛在的相互關系，深度挖掘與利用內(nèi)生細菌資源研究提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

油桃(YT)、水蜜桃(SMT)、蟠桃(PT)樣品，分別采自吐魯番市托克遜鎮(zhèn)、阿克蘇市阿瓦提縣和石河子市農(nóng)八師143團果園中。采用隨機采樣法，選擇自然成熟、表皮有光澤且無損傷、顏色大小一致的桃果，經(jīng)發(fā)泡網(wǎng)包裹裝筐后，12 h內(nèi)運回實驗研究室，于4 ℃下貯藏。

1.2 實驗方法

1.2.1 預處理

各樣品流水沖洗10 min，無菌紙吸干水分；75%無水乙醇處理5 min，無菌水洗滌；3.3% NaClO浸泡3 min，無菌水沖洗；75%無水乙醇浸泡1 min后，無菌水沖洗，吸干水分，并對洗滌液涂板檢測確認表面消毒完全[12]。

1.2.2 DNA抽提

采用十六烷基三甲基溴化銨法對樣本的基因組DNA進行大量提取，超微量分光光度計檢測DNA純度和濃度；1%瓊脂糖凝膠，5V/cm電壓，時間20 min檢測DNA完整性[13]。

1.2.3 PCR擴增

采用引物為515F和806R，PCR參數(shù)：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 、10 min。每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后取3 μL上樣2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行高通量測序[14]。

1.2.4 生物信息學分析

所得序列經(jīng)Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)去嵌合體，排除宿主葉綠體序列數(shù)據(jù)的干擾后，以相似性97%水平以上的序列視為一個操作分類單元(operational taxonmic units，OTU)，進行聚類處理，利用數(shù)據(jù)庫注釋物種，開展相關微生物豐度、多樣性等方面的分析處理，以此來確定出微生物群落結(jié)構(gòu)特征信息[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果及序列深度驗證

樣品共測得原始序列238 740條，過濾掉低質(zhì)量序列后，總數(shù)為211 633條。在上述序列進行去冗余處理后，有效序列數(shù)170 886條，并在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs，并去除植物體內(nèi)的線粒體、葉綠體相關序列后，共獲得106個OTUs，其中油桃的內(nèi)生細菌所得OTUs最高，共測得98個OTUs。統(tǒng)計得到所有樣品在不同OTUs中的豐度信息，各樣品測序信息結(jié)果如表1所示。

稀釋曲線反映了測序的深度，也可以用來評價測序量是否足以覆蓋樣品所有種群。由圖1可知，油桃、水蜜桃、蟠桃的稀釋曲線均基本趨于平緩，但仍未達到飽和，說明此次所得序列可基本反映出桃果中真實的內(nèi)生細菌菌落結(jié)構(gòu)。

表1 不同品種桃果內(nèi)生細菌測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Statistics of sequencing data of endophytic bacteria in different peaches

圖1 桃果內(nèi)生細菌的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of endophytic bacteria communities in different peaches

2.2 樣品間多樣性分析

以各樣品中分布的OTUs數(shù)為計算依據(jù)，對各樣品中群落梯狀性進行分析，并構(gòu)建韋恩圖。韋恩圖能夠直觀反映樣品當前重疊情況下的共有單元和非重疊情況下的特有分類單元數(shù)目。如圖2所示，3類桃果實中共包含106個OTUs，其中以油桃的OTUs最多，包含98個OTUs，而水蜜桃中含89個OTUs，蟠桃中含有83個OTUs。在所有的106個OTUs中73個OTUs均同時出現(xiàn)在油桃、蟠桃和水蜜桃果實中，說明在實驗選取的3類桃果中，存在極為相似的內(nèi)生細菌組成。

圖2 三類桃果內(nèi)生細菌群落相關性分析Fig.2 Correlation analysis of endophytic bacteria communities in three kinds of peaches

采用Alpha多樣性指標中的香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)和辛普森指數(shù)反映桃果內(nèi)生細菌的豐富程度。由表2可知，3類樣品的Alpha多樣性指數(shù)明顯不同，油桃、蟠桃的Chao1數(shù)值與水蜜桃相比差異較大，說明油桃、蟠桃的分化較為明顯；香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)表明，水蜜桃與油桃、蟠桃微生物群落多樣性存在明顯的差異。綜上所述，盡管3類桃果中內(nèi)生細菌群落組成較為相似，但多樣性仍存在明顯差異。

表2 不同品種桃果樣品多樣性數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Statistics of sequencing data of endophytic bacteria communities in different peaches

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析

將OTU注釋到各分類水平，結(jié)果如圖3所示，實驗所得的106個OTUs共涉及細菌的9個門，31個目，59個屬。3類桃果樣本中均包含變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、柔膜菌門(Tenericutes)、熱微菌門(Thermomicrobia)、奇古菌門(Thaumarchaeota)共9個門。且均以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門4個菌門為主，共占樣品菌群的95%以上。

圖3 各樣品門水平上主要的內(nèi)生細菌群落組成Fig.3 Major phylums of endophytic bacteria communities in different peaches

目水平分析結(jié)果如圖4所示，3類桃果樣品中假單胞菌目(Pseudomonadales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)均為優(yōu)勢菌群，二者總計占油桃、蟠桃、水蜜桃菌群的29.35%、54.82%和45.37%，但二者在不同桃果樣品中的所占比例存在一定差異。蟠桃中腸桿菌目菌群相對含量最高，占總菌群數(shù)的36.67%，單胞菌目菌群僅占18.14%；水蜜桃中假單胞菌目菌群相對含量最高，占總菌群數(shù)的34.32%，腸桿菌目菌群僅占11.05%；而油桃中假單胞菌目、腸桿菌目相對含量均占總菌群數(shù)的15%左右。此外，芽孢桿菌目(Bacillales)菌群在油桃和蟠桃中的相對含量均約為16%左右，而在水蜜桃中僅占7.66%。

圖4 各樣品目水平上主要的內(nèi)生細菌群落組成Fig.4 Major orders of endophytic bacteria communities in different peaches

進一步對其屬水平進行分析發(fā)現(xiàn)(表3)，3類桃果內(nèi)生細菌共涉及59個屬。其中，22個為主要優(yōu)勢菌屬，約共占總菌群的83%以上，但其所占比例在不同品種的桃果中呈現(xiàn)出顯著差異。如表3所示，芽孢桿菌屬(Bacillus)和未分類菌群高度富集于油桃果實中，分別占15.63%和15.15%；而在水蜜桃中主要菌群為泛菌屬(Pantoea)和芽孢桿菌屬，其中泛菌屬菌群數(shù)占到總計的1/3以上；蟠桃中則為假單胞菌屬(Pseudomonas)和未分類菌屬菌群，分別占19.83%和16.57%。此外，不動桿菌屬(Acinetobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)也均為3類桃果的優(yōu)勢菌群，其所占比例均大于4%。需要指出的是，在3類桃果中均存在大量未分類菌屬，表明桃果中存在大量未知的微生物資源，有待進一步發(fā)掘。

表3 各樣品屬水平上主要的內(nèi)生細菌群落組成Table 3 Major genera of endophytic bacteria communities in different peaches

同時，研究發(fā)現(xiàn)，桃果中存在大量與人體健康相關的菌群。主要以芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、布勞特氏菌屬、毛螺菌屬等腸胃代謝相關的有益菌群為主。以上所述菌群能夠直接參與宿主的消化、吸收、代謝、營養(yǎng)和免疫等生理過程。此外，桃果中也存在著如淺黃假單胞菌屬、銅綠假單胞菌屬等潛在的條件致病菌株，但其在桃果實的含量極少，均在0.9%以下，具體情況如表4、表5所示。

表4 各樣品中與人體健康有關的潛在有益菌Table 4 Potentially beneficial bacteria on human health in different peaches

表5 各樣品中與人體健康有關的條件致病菌Table 5 Conditional pathogenic bacteria on human health in different peaches

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)生菌在長期的系統(tǒng)演化過程中，與宿主形成了高度協(xié)同進化關系。植物可為內(nèi)生菌提供生長所需要的能量及營養(yǎng)，內(nèi)生菌可通過相關的信號傳導作用和自身的代謝產(chǎn)物對植物生長產(chǎn)生影響[16]。蔡學清等[17-18]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌能在荔枝葉片、花、幼果及采后果皮上定殖，可在花和幼果間傳導，且對果實中的營養(yǎng)成分產(chǎn)生一定影響。如內(nèi)生細菌能夠降低荔枝果實的可溶性糖、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸含量，提高還原性VC及游離有機酸和氨基酸含量。許日升等[19]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌為花生的主要類群，具有固氮、抗病、分泌植物激素、促進花生吸收營養(yǎng)元素等多方面的有益作用。目前也有少量研究表明，一些食品功能因子可以通過影響腸道微生物，間接地影響人體健康[20]。如KRAUTKRAMER等[21-22]發(fā)現(xiàn)勞特氏菌、糞球菌、瘤胃球菌、柯林斯氏菌等與體重指數(shù)和血脂代謝密切相關，可被認為是腸道微生物群與肥胖之間的中介。郭虹雯等[23-24]發(fā)現(xiàn)通過改善腸道中擬桿菌門與厚壁菌門的相對豐度，降低厚壁菌門與擬桿菌門比例，可達到減肥降脂的效果。

本文采用高通量測序技術，對新疆特色油桃、蟠桃、水蜜桃果內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性進行了分析。結(jié)果表明，桃果中存在著豐富的內(nèi)生細菌資源，3類實驗桃果內(nèi)生細菌共涉及9個門的59個屬，其中以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門4個菌門為主。但不同品種間的桃果內(nèi)生細菌群落組成存在顯著差異。如芽孢桿菌屬菌群高度富集于油桃果實組織內(nèi)部，而在水蜜桃中則為泛菌屬類，蟠桃中為假單胞菌屬類。此外，通過對3類桃果內(nèi)生細菌群落組成的分析發(fā)現(xiàn)，桃果中存在著大量利于人體健康的有益菌群，可能與人體腸胃代謝相關。如雙歧桿菌可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸，幫助消化吸收，酸化腸內(nèi)環(huán)境，阻止有害菌在腸上皮的黏附[25]。阿克曼氏菌能夠分解細胞泌的黏蛋白，改善肥胖，降低血糖[26]。一些芽孢桿菌和酵母菌可參與和調(diào)節(jié)宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的正常消化和吸收，同時維持腸道內(nèi)微生物菌群的平衡等，降低肥胖、炎癥性腸炎、糖尿病和免疫缺陷疾病等的發(fā)生概率[27-28]。同時，實驗也發(fā)現(xiàn)在桃果中存在一定數(shù)量的條件致病菌，其是否會在食用過程中定植并導致相關疾病，有待進一步研究和驗證。

上述研究結(jié)果，初步揭示了新疆3類桃果采后內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性，為進一步分析桃果內(nèi)生細菌群落與人體健康的相互關系，深度挖掘與利用內(nèi)生細菌資源等研究提供了科學依據(jù)。