吳麗，馮敏，尤琳烽*

1(重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院, 重慶, 400067)2(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院, 河南 鄭州, 450011) 3(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 廣東 廣州, 510642)

在國內(nèi)，由于“毒膠囊”事件的連續(xù)發(fā)生[1]，人們“談藥色變”；在國外，上世紀(jì) 90 年代英國曾爆發(fā)大規(guī)模瘋牛病事件，歐美國家一度“聞牛色變”，作為衍生物的明膠產(chǎn)業(yè)也遭受打擊，非明膠空心膠囊的開發(fā)也早已提上日程[2-4]。靶向給藥系統(tǒng)，可使藥物遞送或濃集于特定靶部位和靶器官，從而避免藥物作用于全身作用帶來的毒副反應(yīng)，是最新型的第4代藥物劑型[5]。結(jié)腸近端容易發(fā)生病變，結(jié)腸靶向給藥也是目前研究的熱點(diǎn)，但是目前市場上的結(jié)腸靶向空心膠囊還存在一些問題，pH依賴型[6]或時間依賴型[7]結(jié)腸靶向膠囊，定位不夠準(zhǔn)確；菌群/酶觸發(fā)型空心膠囊用明膠膠囊包衣而成，但是包衣所用的材料為偶氮類化合物[8]，存在一定的毒副作用；近年來多糖類化合物開始應(yīng)用，但是制備工藝復(fù)雜，甚至有3層包衣[9]。果膠-殼聚糖聚合物是近期研究的熱點(diǎn)，原料豐富，天然安全，且具有在胃中不被降解，在結(jié)腸中可被降解的特性，因此將果膠-殼聚糖聚合物作為結(jié)腸靶向空心膠囊的新材料，旨在為果膠-殼聚糖的應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卡拉膠，港陽香化集團(tuán)；淀粉，大米淀粉，江西金農(nóng)生物科技有限公司；牛血清、胰酶粉(胰蛋白酶≥4 000 U/g)、胰淀粉酶≥3 000 U/g、胰脂肪酶≥7 000 U/g，美國Sigma-Aldrich公司；胃蛋白酶≥3 000 NFU/mg，廣州齊云生物技術(shù)有限公司；實驗中所用試劑H3PO4、磷酸鹽、甘油均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6 020真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHB-3水循環(huán)式真空泵，西安儀創(chuàng)實驗室儀器設(shè)備有限公司；PS 811型外徑千分尺，德國帕斯特集團(tuán)有限公司；PHS-25酸度計，上海雷磁儀器廠；XMTD-204數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司；UV-5 100紫外分光光度計，日本Shimadzu公司；QA-HPZ-30恒溫恒濕培養(yǎng)箱，東莞捷程儀器設(shè)備有限公司；空心膠囊模具(1號)，紹興拓普機(jī)械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 果膠-殼聚糖聚合物的制備

在室溫條件下，將果膠溶于水中，制備質(zhì)量濃度為50 g/L的果膠溶液，將殼聚糖溶于0.3%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水溶液中，制備質(zhì)量濃度為10 g/L的殼聚糖乙酸溶液，然后將殼聚糖溶液緩慢加入到果膠溶液中，邊加邊攪拌，得到果膠殼聚糖質(zhì)量比為1∶3的溶液，待反應(yīng)完全以20 000 r/min的速度勻漿，室溫放置48 h，然后將反應(yīng)物離心，棄去上清液，反復(fù)水洗，離心，得果膠-殼聚糖聚合物。

1.3.2 果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向空心膠囊的制備

將淀粉溶于水中，攪拌并加熱到70～80 ℃[10]，保持5～8 min使糊化；加入卡拉膠攪拌至溶解完全，再緩慢加入果膠-殼聚糖聚合物，加水稀釋溶液調(diào)整膠液濃度，并加入甘油作為增塑劑；最后將溶液在(80±5) ℃加熱20～30 min，攪拌均勻后真空脫氣

用不銹鋼模具將果膠-殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合溶液在55～60 ℃條件下蘸膠，模具取出翻轉(zhuǎn)2圈，使膠液均勻涂抹于模具上，稍冷后將模具置于真空干燥箱中干燥12 h，脫模、切割并加蓋密封。

1.3.3 果膠-殼聚糖聚合物含量對藥物釋放度的影響

卡拉膠質(zhì)量濃度為20 g/L，膠體總固形物質(zhì)量濃度為60 g/L，調(diào)整果膠-殼聚糖聚合物和淀粉的質(zhì)量濃度，使果膠-殼聚糖占固形物比例為30%、40%、50%、60%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，見表1。按1.3.2方法制備果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向空心膠囊，考察果膠-殼聚糖聚合物占固形物的比例對膠囊藥物釋放度的影響。

表1 膠囊組成配方Table 1 Composition of capsules

1.3.4 果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向空心膠囊制備工藝優(yōu)化

(1)果膠-殼聚糖聚合物的比例對膠囊性能的影響

卡拉膠質(zhì)量濃度為20 g/L，膠體總固形物質(zhì)量濃度為60 g/L，調(diào)整加入的果膠-殼聚糖聚合物量占膠液總固形物的比例分別為40%、45%、50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，加入2%(體積分?jǐn)?shù))的甘油作為增塑劑，按1.3.2方法制備果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向空心膠囊，考察果膠-殼聚糖聚合物占膠液固形物的比例對膠囊水蒸氣透過系數(shù)的影響。

(2)甘油含量對膠囊性能的影響

卡拉膠質(zhì)量濃度20 g/L，果膠-殼聚糖聚合物質(zhì)量濃度為30 g/L，淀粉質(zhì)量濃度為10 g/L，調(diào)整甘油含量占膠液的體積分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，按1.3.2方法制備果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向空心膠囊，考察甘油含量對膠囊水蒸氣透過系數(shù)的影響。

(3)干燥溫度對膠囊性能的影響

卡拉膠質(zhì)量濃度為20 g/L，果膠-殼聚糖聚合物濃度為30 g/L，淀粉質(zhì)量濃度為10 g/L，加入2%(體積分?jǐn)?shù))的甘油作為增塑劑，按1.3.2方法制備果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向空心膠囊，考察干燥溫度40、50、60、70、80 ℃對膠囊水蒸氣透過系數(shù)的影響。

(4)果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向空心膠囊制備的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面軟件Design-Expert 6.0對果膠-殼聚糖聚合物結(jié)腸靶向空心膠囊制備條件進(jìn)行Box-Benhnken優(yōu)化，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，以空心膠囊的水蒸氣透過系數(shù)為指標(biāo)對制備條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗因素水平編碼如表2所示。

表2 空心膠囊制備工藝參數(shù)Table 2 Extraction parameter of the bioactive protein from goat placenta

1.3.5 測定方法

1.3.5.1 體外模擬藥物釋放度的測定

模擬胃液(simulated gastric fluid,SGF)的配制：1 g 胃蛋白酶溶解于100 mL HCl(0.01 mol/L)溶液中，pH 1.5；

模擬小腸液(simulated intestinal fluid,SIF)的配制：1 g胰酶粉溶于100 mL 磷酸鹽緩沖(0.05 mol/L)溶液中，pH 6.8；

模擬結(jié)腸液(simulated colonic fluid,SCF)的配制：將SD大鼠麻痹后把結(jié)腸從腹部取出，在充氮環(huán)境中收集結(jié)腸內(nèi)容物30 g溶于100 mL磷酸鹽緩沖(0.05 mol/L)溶液中，pH 7.8。

以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為模擬藥物來分析該膠囊的藥物釋放特征。每個膠囊填充25 mg BSA并密封，然后放入裝有模擬胃液的容器中2 h，取出水洗后放入模擬小腸液3 h，之后再次取出水洗后放入模擬結(jié)腸液9 h。整個過程溶液放置在37 ℃恒溫水浴鍋中并以100 r/min振蕩，每30 min吸取5 mL模擬液測定1次BSA的含量，同時補(bǔ)足對應(yīng)的新鮮模擬液5 mL。

溶液中BSA的含量采用紫外分光光度法進(jìn)行測定。分別配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL BSA溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，在280 nm條件下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定在t時刻取出的模擬液的吸光度，并根據(jù)吸光度計算出BSA的含量，BSA釋放率(RB)的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Rt，BSA在t時刻的累積釋放量；Mi,BSA的原始質(zhì)量(25 mg)。

1.3.5.2 水蒸氣透過系數(shù)(water vapor permeability,WVP)的測定

參照王靜平[11]采用的杯式法進(jìn)行測定。

1.3.5.3 膠囊規(guī)格尺寸的測定

長度的測定：用游標(biāo)卡尺測量膠囊帽和膠囊體的長度，精確到0.02 mm。

厚度的測定：用外徑千分尺于被測聚合膜上隨機(jī)選5點(diǎn)進(jìn)行測量，取平均值得膜厚度，精確到0.01 mm。

1.3.5.4 含水量的測定

根據(jù)《中國藥典》[12]2010版中含水量的測定方法進(jìn)行測定。

1.3.5.5 脆碎率的測定

根據(jù)《中國藥典》[12]2010版中脆碎率的測定方法進(jìn)行測定。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間均值比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠-殼聚糖聚合物比例對藥物釋放度的影響

根據(jù)表1中的膠囊配方制備膠囊，以BSA作為模擬藥物測定空心膠囊的藥物釋放特性，考察果膠-殼聚糖聚合物比例對藥物釋放度的影響，見圖1。

由圖1可知，在模擬胃液里，4種配方制備的膠囊藥物都沒有釋放；在模擬小腸液中，BSA以緩慢的速度釋放出來，C1樣品釋放率最高，達(dá)到53.12%，C2、C3、C4的釋放率分別達(dá)到9.89%、6.82%和2.47%，在模擬結(jié)腸液中，BSA被快速釋放出來，C1樣品內(nèi)BSA在第5小時的釋放率達(dá)到最高值，為95.08%，C2和C3樣品內(nèi)BSA在第5.5小時達(dá)到最大，釋放率分別為92.46%和93.33%，而C4內(nèi)BSA最大釋放率為90.93%，發(fā)生在第7 h，之后BSA釋放率緩慢下降。因此，果膠-殼聚糖聚合物占膠液中固形物的最佳比例為40%～50%。

圖1 BSA體外模擬釋放率Fig.1 Release of BAS from capsule in vitro

2.2 果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向空心膠囊工藝優(yōu)化

2.2.1 果膠-殼聚糖聚合物含量對膠囊水蒸氣透過系數(shù)的影響

由圖2可知，隨著果膠-殼聚糖聚合物含量的增加，膠囊的水蒸氣透過系數(shù)逐漸降低，說明果膠-殼聚糖聚合物含量與膠囊的透水氣性有著直接的關(guān)系，而卡拉膠和淀粉的的阻水性相對較差，當(dāng)果膠-殼聚糖聚合物在固形物中的比例(質(zhì)量分?jǐn)?shù))增加時，膠囊的阻水性也會增強(qiáng)。

2.2.2 甘油含量對膠囊水蒸氣透過系數(shù)的影響

由圖3可知，隨著甘油含量的增加，水蒸氣透過系數(shù)呈現(xiàn)出先減小后增加的趨勢，當(dāng)甘油含量為1%(體積分?jǐn)?shù))時，水蒸氣透過系數(shù)最小，之后隨著甘油含量的增加，水蒸氣透過系數(shù)逐漸增加。原因可能是甘油可以很容易地插入到大分子物質(zhì)之間，從而增強(qiáng)聚合物中的剛性結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了阻水性能；隨著甘油含量的逐漸增加，甘油分子的親水特性增加了聚合膜的含水量，從而使聚合膜的水蒸氣滲透性能增加[13-14]。

圖3 甘油含量對膠囊水蒸氣透過系數(shù)的影響Fig.3 Effect of glycerol on the WVP of capsule

2.2.3 干燥溫度對膠囊水蒸氣透過系數(shù)的影響

由圖4可知，隨著干燥溫度的增加，水蒸氣透過系數(shù)呈現(xiàn)出先減小后增加的趨勢，當(dāng)干燥溫度為60 ℃時，水蒸氣透過系數(shù)最小，之后隨著干燥溫度的增加，水蒸氣透過系數(shù)逐漸增加。原因可能是干燥溫度的升高加劇了膠液中大分子聚合物鏈段的運(yùn)動，從而形成致密度高的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；也可能是加熱改變了膠液中大分子的結(jié)構(gòu)，從而增加了可與其他物質(zhì)進(jìn)行作用的氫鍵，聚合膜結(jié)構(gòu)變得致密，從而WVP減小。但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，大分子聚合物內(nèi)部的鏈段運(yùn)動加速，聚合物還未形成均勻立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就已經(jīng)沉積下來，形成氣孔和裂紋從而使WVP增加[15-16]。

圖4 干燥溫度對膠囊水蒸氣透過系數(shù)的影響Fig.4 Effect of drying temperature on the WVP of capsule

2.2.4 果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向膠囊制備工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

(1)回歸模型建立及方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定影響因素及其水平，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。試驗結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合得到水蒸氣透過系數(shù)與各因素的二次方程模型。

水蒸氣透過系數(shù)與各因素的二次方程模型：

Y=3.28-0.44×A-0.11×B+0.79×C+0.14×A×B+0.50×A×C+0.29×B×C-0.21×A2+0.70 ×B2+1.48×C2

式中：Y，水蒸氣透過系數(shù)，g·mm/(m·d·kPa)；A，果膠-殼聚糖聚合物占膠液固形物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；B，甘油占膠液的體積分?jǐn)?shù),%；C，干燥溫度，℃。

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental values for the optimization of the fermentation conditions by RSM

試驗數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見表4，所得回歸方程極顯著，且失擬檢驗不顯著，說明回歸模型很理想，用方程擬合3個因素與水蒸氣透過系數(shù)之間的關(guān)系是可行的的，實驗誤差小，可以用該回歸模型代替試驗真實點(diǎn)對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。由回歸方程和方差分析數(shù)據(jù)可知，回歸方程的一次項3因素(A、B、C)對水蒸氣透過系數(shù)有不同程度的影響，因素A、因素C對水蒸氣透過系數(shù)影響極顯著(P<0.01)，因素B對產(chǎn)物的免疫活性影響顯著(P<0.05)；回歸方程的二次項A2、B2、C2以及交互項中的AC、BC也對水蒸氣透過系數(shù)影響極顯著(P<0.01)，交互項中的AB對水蒸氣透過系數(shù)影響顯著(P<0.05)。這表明各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系，且3因素之間存在顯著的交互作用。

表4 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 4 Statistic analysis for the response surface quadratic model obtained from RSM design

(2)不同獨(dú)立變量間響應(yīng)面立體圖

分別將模型中的果膠-殼聚糖聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、甘油體積分?jǐn)?shù)及干燥溫度其中1個因素固定在中間水平，得到另外2個因素交互作用對水蒸氣透過系數(shù)的子模型，并根據(jù)模型繪制三維曲面圖，水蒸氣透過系數(shù)的響應(yīng)面及等高線如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對空心膠囊水蒸氣透過系數(shù)影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of interaction of various factors on capsule WVP

利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析計算，可得到果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向空心膠囊的最佳制備條件為果膠-殼聚糖聚合物占膠液固形物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)為50%，甘油占膠液的體積分?jǐn)?shù)(B)為1%，干燥溫度(C)為46 ℃，預(yù)測制備的空心膠囊水蒸氣透過系數(shù)為2.34 g·mm/(m·d·kPa)。

(3)試驗?zāi)Ｐ万炞C

采用上述優(yōu)化后的膠囊制備工藝條件，進(jìn)行驗證試驗，測得水蒸氣透過系數(shù)達(dá)到2.39±0.12，與預(yù)測值2.34誤差在1%以內(nèi)，說明采用該方法優(yōu)化得到的膠囊制備工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，運(yùn)用試驗建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行預(yù)測在實踐中是切實可行的。

2.3 制備的結(jié)腸靶向空心膠囊及其性能

采用蘸膠法制備的膠囊如圖6所示，膠囊呈黃白色，透明，表面光滑，無薄頭、癟頭、梅花頭、皺紋等現(xiàn)象。體長，帽長，體外徑和帽外徑分別為(16.60±0.5)、(9.80±0.5)、(6.63±0.5)和(6.91±0.5) mm，含水率為(10.06±0.83)%，脆碎率為0。

圖6 空心膠囊Fig.6 Photo of capsule

3 結(jié)論

(1)通過對藥物釋放率的測定，分析了果膠-殼聚糖聚合物比例對藥物釋放度的影響，當(dāng)其含量占膠液中固形物的比例為40%～50%時，以BSA為模擬藥物，制備的膠囊在模擬胃液里藥物都不釋放，在小腸液中的藥物釋放率為(6.82±0.54)%～(9.89±0.98)%，在結(jié)腸液中的藥物總釋放率達(dá)到(92.46±1.50)%～(93.33±0.63)%，達(dá)到結(jié)腸靶向給藥膠囊的要求。

(2)以水蒸氣透過系數(shù)為響應(yīng)指標(biāo)，對果膠-殼聚糖結(jié)腸靶向膠囊的制備工藝和配方進(jìn)行單因素和響應(yīng)面分析，得到最佳制備條件為果膠-殼聚糖聚合物占膠液固形物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，甘油占膠液的體積分?jǐn)?shù)為1%，干燥溫度為46 ℃，在此條件下制備的空心膠囊水蒸氣透過系數(shù)為(2.39±0.12) g·mm/(m·d·kPa)，透氣系數(shù)差，有利于內(nèi)容物穩(wěn)定性的增加，各項指標(biāo)符合國標(biāo)要求。

(3)采用本文方法制備的結(jié)腸靶向空心膠囊工藝簡單，原料天然，脆碎度更低，但是不如現(xiàn)有膠囊光滑、堅硬，松緊度稍差，需要進(jìn)一步改進(jìn)。