李佩艷 尹 飛 黨東陽 甘瑞卿 李鑫玲 梁 華

(1河南科技大學食品與生物工程學院/河南省食品原料工程技術研究中心，河南 洛陽 471023；2河南科技大學農(nóng)學院，河南 洛陽 471023)

芒果(MangiferaindicaL.)是典型的冷敏型果實，貯藏溫度低于13℃就會出現(xiàn)冷害現(xiàn)象[1]，主要表現(xiàn)為出現(xiàn)凹陷斑、果皮和果肉褐變、果肉硬度較高、不能正常后熟等[2-3]。冷害的發(fā)生會大大降低芒果食用價值和商品價值，造成嚴重的經(jīng)濟損失，因此研究控制芒果冷害技術及其冷害機理已成為芒果低溫貯藏中亟待解決的關鍵問題。

諸多研究表明草酸不僅可用于采后果實貯藏保鮮以延緩果實成熟衰老過程[4-5]，而且還能提高采后果實抗冷性，減輕冷害的發(fā)生[6-8]。果膠、纖維素、半纖維素等細胞壁物質(zhì)含量決定了采后果實的質(zhì)地，這些細胞壁物質(zhì)在果膠甲酯酶(pectin methyl enzyme，PME)、β-半乳糖苷酶(β-galactose glucoside enzyme，β-Gal)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)、纖維素酶(cellulase，Cx)等細胞壁代謝酶作用下會使細胞壁物質(zhì)發(fā)生降解，引起細胞壁結構破壞，導致果實軟化[9]。已有研究表明，通過調(diào)控細胞壁代謝能提高采后果實抗冷性，減輕冷害程度[10]。芒果受冷害嚴重時，硬度會增加，后不能正常后熟和軟化，表明芒果冷害的發(fā)生與其細胞壁代謝有關。

先前研究表明草酸處理能降低采后芒果果實冷害的發(fā)生[1,11]，然而，低溫脅迫下草酸處理對采后芒果細胞壁代謝方面的研究尚不清楚，尤其是草酸處理后芒果冷害與細胞壁代謝之間的關系更鮮見報道。因此，本試驗以桂七芒果為試材，探究草酸處理對桂七芒果低溫貯藏期間冷害、細胞壁組分、細胞壁水解酶活性的影響，旨在進一步揭示草酸減輕芒果冷害的機制，同時為草酸在桂七芒果果實低溫貯藏保鮮中的應用提供理論基礎，為其他冷敏型果蔬的低溫貯藏保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桂七芒果果實于2018年7月上旬采摘于廣西省百色市，約八成熟，空運至實驗室。

1.2 主要儀器與試劑

MIR-553恒溫恒濕箱，日本SANYO公司；FHM-5硬度計，日本竹村電機制作所；UV-1800紫外可見分光光度計，日本島津公司；3-30K高速冷凍離心機，德國SIGMA公司；DDSJ-308A電導率儀，上海精密科學儀器有限公司。

草酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、咔唑、半乳糖醛酸、蒽酮、葡萄糖、多聚半乳糖醛酸、Tris-HCl、氯化鈉(Nall)、乙二胺四乙酸、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、果膠、溴麝香草酚藍、巰基乙醇、乙酸、乙酸鈉、對硝基-β-D-半乳糖苷、碳酸鈉、羧甲基纖維素鈉、3，5-二硝基水楊酸、乙醇等均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計 選擇果形端正、大小均勻、無病蟲斑和機械損傷的果實，用5 mmol L-1草酸溶液浸泡10 min，以浸清水為對照。果實于陰涼處(25℃)風干4 h，按每筐20個裝入塑料筐，筐外套厚度0.05 mm聚乙烯薄膜袋，袋不封口，置于4℃低溫貯藏28 d，常溫后熟4 d。貯藏期間分別于0、7、14、21、28、28+4 d，測定相關生理生化指標，試驗重復3次。其中，28+4 d為后熟階段。

1.3.2 冷害指數(shù) 參照Li等[11]的方法。芒果冷害指數(shù)統(tǒng)計按果實表面的凹陷及冷害斑的面積分為5級：0級，芒果果實表面未出現(xiàn)凹陷及冷害斑；1級，芒果果實表面發(fā)病面積小于果實總面積的10%；2級，芒果果實表面發(fā)病總面積為果實總表面積的10%～20%；3級，芒果果實表面發(fā)病面積為果實總表面積的20%～30%；4級，芒果果實表面發(fā)病面積大于果實總表面積的30%。每組選擇30個芒果果實。按照公式計算冷害指數(shù)：

冷害指數(shù)=Σ(病級果數(shù)×該級代表數(shù)值)/(調(diào)查總果數(shù)×最高級代表數(shù)值)×100%。

1.3.3 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定 參考曹建康等[12]的硫代巴比妥酸法進行測定。

1.3.4 相對電導率測定 參照Li等[1]的方法。每處理分別取5個芒果果實，均取赤道部位果肉，將其切成小圓片(直徑10 mm，厚3 mm)，取10個果實圓片放入小燒杯中加入30 mL水，測定煮沸前后溶液的電導率值，計算相對電導率。

1.3.5 硬度測定 參照Li等[11]的方法，每組選取10個芒果果實，選赤道處3個部位分別用硬度計進行測定，取平均值，試驗重復3次。

1.3.6 原果膠和水溶性果膠含量測定 參考曹建康等[12]的咔唑比色法測定，原果膠和水溶性果膠含量均以生成的半乳糖醛酸占樣品質(zhì)量的百分數(shù)表示。

1.3.7 纖維素含量測定 采用酸堿醇醚法測定[12]，以樣品經(jīng)處理后殘余物質(zhì)量占原樣品質(zhì)量的百分數(shù)表示。

1.3.8 細胞壁水解酶測定 PG活性參考何俊瑜等[13]的方法測定。稱取2 g芒果果肉加入6 mL Tris-HCl溶液(50 mmol·L-1，pH值7.0，內(nèi)含2 mol·L-1NaCl，10 mmol·L-1乙二胺四乙酸，5 g·L-1交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)，冰浴研磨，12 000 r·min-1離心20 min，上清液即為酶液。以每小時每克鮮樣37℃分解多聚半乳糖醛酸產(chǎn)生的游離半乳糖醛酸量表示，單位為mg·h-1·g-1FW。

PME活性參考徐曉波[14]的方法測定，略有改動。稱取10 g芒果果肉加入10 mL NaCl研磨勻漿，12 000 r·min-1離心20 min，上清液即為酶提取液，加入2 mL 0.5%果膠、0.15 mL 0.01%溴麝香草酚藍溶液、0.1 mL酶液混合，測定620 nm波長處的吸光度值，計算PME活性，單位為△620 nm·g-1·min-1。

β-Gal活性參考葉玲[15]的方法測定。稱取2 g芒果果肉加入8 mL含有NaCl、巰基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮的乙酸-乙酸鈉緩沖液(50 mmol·L-1，pH值5.5)研磨成勻漿，12 000 r·min-1離心20 min，上清液即為酶提取液。試管中加入1 mL對硝基苯-β-D-半乳糖苷(3 mmol·L-1)，再加入0.1 mL酶提取液，37℃條件下水浴30 min，立即加入2 mL碳酸鈉溶液(1 mol·L-1)終止反應，在400 nm波長處測定吸光度值。以每分鐘每克鮮樣37℃分解對硝基苯-β-D-半乳糖苷產(chǎn)生的對硝基酚量計算酶活性，單位為μmol·h-1·g-1FW。

Cx活性參考曹建康等[12]的方法測定。稱取10 g芒果果肉，加入20 mL預冷的95%乙醇，冰浴研磨，4℃ 12 000 r·min-1離心20 min，棄上清，沉淀加入5 mL預冷的乙酸-乙酸鈉緩沖液提取20 min，再次離心，上清液即為酶提取液。取0.5 mL酶液加入1.5 mL 10 g·L-1羧甲基纖維素鈉，37℃水浴60 min，加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，沸水浴5 min終止反應，測定540 nm波長處的吸光度值，單位為mg·h-1·g-1FW。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有測定均重復3次，結果表示為平均值±標準偏差。采用SPSS 17.0軟件進行Duncan多重比較和Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 草酸處理對桂七芒果果實冷害指數(shù)的影響

由圖1可知，桂七芒果冷害指數(shù)均隨著貯藏時間的延長逐漸增加，對照組果實在貯藏14 d時出現(xiàn)冷害癥狀，而草酸處理組果實則在貯藏21 d時出現(xiàn)冷害癥狀。整個貯藏期間草酸處理組芒果冷害指數(shù)均顯著低于對照組，后熟結束時，草酸處理組芒果冷害指數(shù)比對照組降低了22.50個百分點。由此可見，草酸處理能夠提高低溫脅迫下桂七芒果的抗冷性，減輕其貯藏期間冷害的發(fā)生。

注：不同小寫字母表示同一貯藏時間兩組間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different louercase letters indicate significant difference between different treatments at the same storage time at 0.05 level.圖1 草酸處理對桂七芒果果實貯藏期間冷害指數(shù)的影響Fig.1 Effects of oxalic acid treatments on chilling injury index in Guiqi mango fruit during storage

2.2 草酸處理對桂七芒果果實MDA含量和相對電導率的影響

由圖2-A、B可知，桂七芒果果實MDA含量和相對電導率均隨著貯藏時間的延長逐漸上升。對照組果實MDA含量和相對電導率在整個貯藏過程中均高于草酸處理組，且在貯藏14～28+4 d期間，兩處理具有顯著差異。

2.3 草酸處理對桂七芒果果實硬度的影響

由圖3可知，貯藏前14 d，對照組和草酸處理組之間的芒果實硬度變化不大；貯藏21 d后，隨著貯藏時間的延長，對照組和草酸處理組果實硬度均急劇下降，貯藏末期及后熟期(28～28+4 d)對照組果實硬度顯著高于草酸處理組。經(jīng)貯藏后熟后，草酸處理組芒果果實硬度較對照組低21.03%。

圖2 草酸處理對桂七芒果果實貯藏期間MDA含量(A)和相對電導率(B)的影響Fig.2 Effects of oxalic acid treatments on MDA content(A) and relative conductivity(B) in Guiqi mango fruit during storage

2.4 草酸處理對桂七芒果果實細胞壁組分含量的影響

原果膠是芒果果實細胞壁的主要成分之一，能保持果實組織堅硬，但隨著果實成熟和衰老，原果膠會逐漸發(fā)生水解，細胞壁結構破壞，導致果實組織變得松弛、軟化，硬度下降。由圖4-A可知，貯藏前21 d，兩組芒果果實原果膠含量變化不大，隨著貯藏時間延長，兩組果實中原果膠含量均呈急劇下降。但是，在整個貯藏過程中，草酸處理組果實中原果膠含量始終低于對照組，說明草酸處理可以維持低溫脅迫下桂七芒果原果膠的正常降解，而對照組果實原果膠的降解受到了一定阻礙。

對照組和草酸處理組芒果水溶性果膠含量均呈逐漸上升趨勢(圖4-B)，這可能是由桂七芒果中原果膠轉變?yōu)樗苄怨z引起的。草酸處理組貯藏前21 d芒果水溶性果膠上升緩慢，貯藏21 d后急劇上升；對照組芒果水溶性果膠貯藏前21 d期間變化不大，貯藏21 d后急劇上升。在整個貯藏和后熟期間，草酸處理組果實中水溶性果膠含量顯著高于對照組。后熟結束后，草酸處理組芒果水溶性果膠較對照組提高了17.08%，且芒果水溶性果膠增加的趨勢與原果膠降低的趨勢基本一致，說明草酸處理能維持桂七芒果原果膠的水解程度，水溶性果膠含量不斷增加。

圖3 草酸處理對桂七芒果果實貯藏期間硬度的影響Fig.3 Effects of oxalic acid treatments on firmness in Guiqi mango fruit during storage

由圖4-C可知，無論是草酸處理組還是對照組，桂七芒果果實中纖維素含量均隨著貯藏時間的延長呈逐漸下降的趨勢。草酸處理組纖維素含量在貯藏0～14 d期間急劇降低，之后緩慢下降，而對照組果實纖維素含量在貯藏0～21 d期間迅速下降，之后呈緩慢降低趨勢，在整個貯藏期間草酸處理組芒果中纖維素含量均顯著低于對照組。貯藏第28+4天時，草酸處理組桂七芒果中纖維素含量較對照組降低了1.47個百分點。

圖4 草酸處理對桂七芒果果實貯藏期間原果膠、水溶性果膠和纖維素含量的影響Fig.4 Effects of oxalic acid treatments on content of original pectin, water soluble pectin and cellulose in Guiqi mango fruit during storage

2.5 草酸處理對桂七芒果果實細胞壁代謝關鍵酶的影響

PG能夠切斷果膠分子中α-1,4-糖苷鍵而將果膠分子降解為小分子物質(zhì)。由圖5-A可知，低溫貯藏階段桂七芒果果實PG活性較低，且隨著貯藏時間的延長呈逐漸上升趨勢；后熟階段，PG活性急劇上升，并達到最大值，此時草酸處理組PG活性是對照組的1.50倍。同時，兩組芒果果實PME活性也隨著貯藏時間的延長均呈逐漸增加趨勢(圖5-B)，整個貯藏過程中，草酸處理組PME活性顯著高于對照組。β-Gal通過去除果膠多聚醛酸側鏈的半乳糖殘基使果膠解聚或溶解。由圖5-C可知，對照組和草酸處理組桂七芒果果實β-Gal活性在貯藏前14 d差異不大，隨著貯藏時間延長兩者差值逐漸增大，后熟結束時，草酸處理組β-Gal活性是對照組的1.39倍。纖維素酶通過降解纖維素和半纖維素中的木葡聚糖，使細胞壁果膠-纖維素-半纖維素結構破壞。由圖5-D可知，貯藏過程中桂七芒果纖維素酶活性呈逐漸上升趨勢，且草酸處理組纖維素酶活性始終高于對照組，后熟結束時，草酸處理組纖維素酶活性較對照組提高了45.89%。

圖5 草酸處理對桂七芒果果實貯藏期間PG、PME、β-Gal和Cx活性的影響Fig.5 Effects of oxalic acid treatment on activities of PG, PME, β-Gal and Cx in Guiqi mango fruits during storage

3 討論

桂七芒果的冷害癥狀主要表現(xiàn)為果皮出現(xiàn)凹陷、水漬狀斑點，果皮變暗失去光澤，果實硬度較高、不能正常軟化后熟。本試驗結果表明，貯藏14 d后，低溫脅迫下草酸處理組芒果冷害指數(shù)、MDA含量、相對電導率顯著低于對照組，貯藏28 d后對照組果實硬度顯著高于草酸處理組。說明草酸處理組果實冷害程度及癥狀較輕，果實能正常后熟軟化，果實硬度較低，而對照組芒果果實受冷害程度嚴重，冷害癥狀明顯，果實不能正常后熟軟化，果實硬度較高。這也表明草酸處理減輕桂七芒果冷害與其維持桂七芒果果實細胞膜完整性，減少胞內(nèi)物質(zhì)滲出有關。

果實細胞壁主要由果膠、纖維素等物質(zhì)構成，它們在PG、PME、Cx、β-Gal等作用下發(fā)生降解，導致細胞壁結構解體、果實軟化[16-17]。魏建梅等[18]認為京白梨果實軟化與細胞壁組分密切相關，β-Gal促進了果實早期軟化，PME、PG促進了果實后期軟化，而Gx作用不大。梁潔玉等[19]研究發(fā)現(xiàn)細胞壁酶活性變化對半邊紅李子果膠降解及果實軟化影響較大，低溫能夠在一定程度上抑制細胞壁酶活性，降低果膠的代謝速率。陳克明等[20]認為引起水蜜桃果實冷害的重要原因是低溫冷藏期間果膠類物質(zhì)代謝異常。本試驗結果表明，貯藏過程中，草酸處理組桂七芒果中原果膠和纖維素含量總體顯著低于對照組，且草酸處理能顯著促進原果膠在貯藏后期的降解，加速了纖維素在貯藏前期的降解，這表明原果膠和纖維素等含量降低是導致桂七芒果硬度下降的主要原因。

果實冷害的發(fā)生還與細胞壁代謝密切相關，這在黃瓜[10]、桃[21-23]、枇杷[24]和橄欖[25]等果蔬中已得到證實。低溫脅迫會造成果實細胞壁纖維素和果膠質(zhì)降解過程受阻[22-25]，冷害果實和正常果實中纖維素和果膠質(zhì)降解過程受阻程度不同。果實細胞壁代謝酶PME、PG等活性不平衡會抑制果實正常的中膠層水解進程，導致果實出現(xiàn)木質(zhì)化、細胞壁代謝異常，從而引起果實冷害的發(fā)生。采用熱處理[26-28]、γ-氨基丁酸處理[22]等能調(diào)控低溫貯藏果實細胞壁代謝酶活性，促進細胞壁物質(zhì)水解，維持果膠物質(zhì)正常降解，從而減輕采后果實冷害的發(fā)生。本研究表明，草酸處理降低了桂七芒果原果膠含量，提高了水溶性果膠含量，提高了PG、β-Gal、Cx、PME等細胞壁降解酶活性，說明草酸處理能提高果實細胞壁代謝關鍵酶，活性維持正常的細胞壁代謝。草酸處理降低桂七芒果冷害發(fā)生與其維持低溫脅迫下果膠物質(zhì)正常降解、提高可溶性果膠含量有關，這可能是草酸減輕桂七芒果冷害的原因之一。

4 結論

本研究結果表明，草酸處理能顯著促進低溫貯藏14 d后桂七芒果中原果膠和纖維素的降解，顯著提高貯藏14 d后芒果果實中水溶性果膠、PG、PME、Cx活性，顯著提高貯藏21 d后β-Gal活性、通過維持采后果實細胞壁降解酶較高活性和水溶性果膠含量，從而減輕冷害的發(fā)生。本研究結果不僅為進一步揭示草酸減輕芒果果實冷害機制提供了理論依據(jù)，而且對指導芒果果實低溫貯藏保鮮具有一定的實際意義，同時也為草酸應用于其他冷敏型果實的貯藏保鮮提供了理論參考。