時(shí)丕彪 洪立洲 王 軍 費(fèi)月躍 王偉義 呂遠(yuǎn)大 顧閩峰,*

(1鹽城市新洋農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，江蘇 鹽城 224049； 2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，江蘇 南京 210014)

土壤鹽漬化是限制農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一，已成為嚴(yán)重的世界性環(huán)境問(wèn)題[1-2]。目前，全球有8億多公頃的土地受鹽分的不利影響，嚴(yán)重危害了植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3-4]，其通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)而導(dǎo)致細(xì)胞膜功能紊亂和代謝活動(dòng)減弱，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。鹽漬土中主要的陽(yáng)離子是Na+，因此在鹽土環(huán)境中，植物必須將胞質(zhì)Na+濃度降到最低才能承受鹽脅迫[5]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物形成了三種不同的機(jī)制來(lái)阻止和適應(yīng)高濃度的Na+在細(xì)胞質(zhì)中的積累：1) 活性Na+的外排；2) 液泡內(nèi)Na+的區(qū)隔化；3) 限制Na+內(nèi)流[6]。各種離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因參與了以上生物學(xué)過(guò)程，其中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是較為重要的一類基因，在維持植物離子穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。目前，主要包括兩類Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(salt overly sensitive 1,SOS1)和NHX1(Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1)[7]，它們能將胞質(zhì)中的離子保持在適當(dāng)濃度，從而使細(xì)胞毒性最小化。NHX1位于液泡膜，通過(guò)把細(xì)胞內(nèi)的Na+泵入液泡而降低細(xì)胞內(nèi)Na+濃度[8-9]；SOS1位于質(zhì)膜，能將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+外排出細(xì)胞，也對(duì)Na+從根系到地上部的長(zhǎng)距離運(yùn)輸十分有利[10]。

目前在很多植物中都發(fā)現(xiàn)了SOS1基因，其中，擬南芥AtSOS1基因首次報(bào)道[11-12]。當(dāng)AtSOS1基因被敲除或突變失活時(shí)，擬南芥表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫極為敏感的表型[13-14]。該基因編碼的AtSOS1蛋白異常巨大，比擬南芥基因組中包含的其他陽(yáng)離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都要大，這是因?yàn)槠銫端區(qū)域占整個(gè)編碼區(qū)域的60%以上[15]。SOS1蛋白參與純化的質(zhì)膜囊泡中Na+/H+的交換活動(dòng)，說(shuō)明SOS1對(duì)植物細(xì)胞Na+和K+的平衡具有重要作用[16]。相關(guān)研究表明，過(guò)表達(dá)SOS1可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草的耐鹽性[17-19]；鹽脅迫能增加小麥TaSOS1的轉(zhuǎn)錄豐度[20]，誘導(dǎo)水稻OsSOS1基因mRNA的積累[21]，并引起擬南芥AtSOS1轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)[14]；不同植物SOS1基因的異源表達(dá)會(huì)抑制酵母突變體AXT3K的Na+敏感性，如擬南芥[22]、海神草[23]、番茄[24]等。此外，Ma等[25]對(duì)旱生植物霸王的研究表明，SOS1還控制著Na+和K+的長(zhǎng)距離運(yùn)輸和空間分布，維持著霸王體內(nèi)Na+和K+的穩(wěn)態(tài)。但關(guān)于印度南瓜(CucurbitamaximaL.)SOS1基因的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

印度南瓜起源于南美洲，為葫蘆科南瓜屬一年生草本植物，富含類胡蘿卜素、糖分、礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是南瓜屬最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一[26-27]。印度南瓜根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)，常被用作黃瓜、西瓜和甜瓜等的砧木，以增強(qiáng)其對(duì)土傳病害和非生物脅迫的耐受性[28]。然而，目前對(duì)印度南瓜耐鹽機(jī)制認(rèn)識(shí)還比較薄弱，故挖掘耐鹽基因和了解相關(guān)耐鹽機(jī)制對(duì)培育耐鹽印度南瓜品種具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)印度南瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，克隆獲得印度南瓜SOS1基因cDNA全長(zhǎng)序列，基于生物信息學(xué)方法初步分析該基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR， RT-qPCR)技術(shù)分析CmaSOS1基因在鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步揭示CmaSOS1在非生物脅迫下的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理

印度南瓜材料由浙江大學(xué)蔬菜所提供。將印度南瓜種子殺菌消毒后于發(fā)芽盒進(jìn)行催芽，待胚根突破種皮2～3 cm時(shí)進(jìn)行水培處理。三葉一心期挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，并分別用200 mmol·L-1NaCl溶液和20%聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG 6000)溶液進(jìn)行鹽脅迫和干旱脅迫處理，分別處理0、2、4、6、12、24 h后取根部組織，液氮速凍后保存于-80℃冰箱用以RNA提取。每個(gè)處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，以處理0 h的樣品為對(duì)照。

1.2 印度南瓜總RNA提取及cDNA合成

用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取各組織及材料樣品總RNA?；蚩寺『捅磉_(dá)分析所用cDNA模板分別按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)和PrimeScriptTMRT-PCRKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)說(shuō)明書合成。

1.3 CmaSOS1基因的克隆

對(duì)印度南瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)UniGene功能注釋結(jié)果獲得一條CmaSOS1全長(zhǎng)序列，并設(shè)計(jì)基因特異性引物，正向引物F：5′-TTAATCAAATCTATAATAAATGTCCTTATTCG-3′，反向引物R：5′-GACATTTAGAATAAACTTTTGGAATACGAC-3′，以印度南瓜葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積50μL，包含10×LATaqPCRbuffer5μL、dNTPmix8μL、cDNA模板2μL、正反向引物各1μL、LATaq酶0.5μL以及ddH2O32.5μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，55℃退火30s，65℃延伸3min20s，共30個(gè)循環(huán)；65℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接到pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。菌液PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性單菌落的菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 CmaSOS1基因序列的生物信息學(xué)分析

利用ORFfinder分析CmaSOS1基因的開(kāi)放閱讀框架并翻譯成氨基酸；在ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)上預(yù)測(cè)CmaSOS1蛋白的分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)；利用NCBI上的CDD分析CmaSOS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；分別在GORIV(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)上預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；CmaSOS1蛋白的親疏水性分析采用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線軟件；利用TMHMMServerv.2.0和SignalP-5.0分別進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)采用PSORT軟件。利用ClustalX2.0軟件對(duì)CmaSOS1及NCBI上下載的其他物種同源SOS1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)；使用MEGA5.05軟件，采用鄰接法(bootstrap=1000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 CmaSOS1基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析

根據(jù)CmaSOS1基因的序列設(shè)計(jì)定量PCR引物進(jìn)行表達(dá)分析，CmaSOS1-Fq：5′-CTGCTGAGATGAACAAAAGGTC-3′和CmaSOS1-Rq：5′-TGTGCAGTAGTACTTGGTGGTCTC-3′；內(nèi)參基因CmaEF1a[29]的引物為CmaEF1a-F：5′-CTGCGAGGCACCAGAGTTCC-3′和CmaEF1a-R：5′-CCCAATCGATGGTGTGTGCCA-3′。PCR反應(yīng)體系為20μL，包含10μLSYBRgreensupermix(Roche)、5.5μLddH2O、正反向引物各1μL和2.5μLcDNA。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃變性10s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CmaSOS1基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得

以印度南瓜葉片cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳獲得單一條帶(圖1)，測(cè)序后獲得印度南瓜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因全長(zhǎng)cDNA序列，命名為CmaSOS1，GenBank登錄號(hào)為NW_019272028。該基因cDNA片段全長(zhǎng)3 940 bp，包含一個(gè)3 429 bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼1 142 個(gè)氨基酸；5′非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)長(zhǎng)161 bp，3′-UTR長(zhǎng)350 bp(圖2)。

注：M：DNA marker 5 000 bp；1：RT-PCR產(chǎn)物。Note：M：DNA marker 5 000 bp. 1：RT-PCR product.圖1 CmaSOS1基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of CmaSOS1 gene

2.2 CmaSOS1基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1CmaSOS1基因的結(jié)構(gòu) 以CmaSOS1的cDNA序列為檢索對(duì)象，在NCBI BLAST上進(jìn)行比對(duì)，得到與之相對(duì)應(yīng)的DNA序列。將CmaSOS1基因的cDNA序列與DNA序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，在基因組水平上，CmaSOS1基因長(zhǎng)度較大，全長(zhǎng)46 314 bp，含有23個(gè)外顯子、22個(gè)內(nèi)含子、5′-UTR和3′-UTR(圖3)。

2.2.2 CmaSOS1蛋白的理化性質(zhì) 利用ExPASy ProtParam分析CmaSOS1蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明其分子式為C5714H9000N1510O1656S42，原子總數(shù)17 922，分子量為126.7 kDa，含有1 142個(gè)氨基酸。CmaSOS1蛋白的理論等電點(diǎn)為5.92，含有帶負(fù)電荷殘基(Asp + Glu) 120個(gè)，帶正電荷殘基(Arg + Lys) 101個(gè)，脂肪系數(shù)為101.50，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為39.08，小于40，表現(xiàn)為穩(wěn)定狀態(tài)。綜上，推測(cè)CmaSOS1為酸性穩(wěn)定蛋白。

2.2.3 CmaSOS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4-A所示，該蛋白主要有α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲和延伸鏈，無(wú)β-折疊。其中，無(wú)規(guī)卷曲所占比例最高為44.92%，其次是α-螺旋占39.23%，延伸鏈所占比例最少為15.85%。

利用SWISS-MODEL在線分析CmaSOS1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋白的空間結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主，含有少量延伸鏈，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致(圖4-B)。

2.2.4 CmaSOS1蛋白的親水性/疏水性分析 根據(jù)ProtScale工具預(yù)測(cè)，CmaSOS1的N末端有一個(gè)很強(qiáng)的疏水性結(jié)構(gòu)，在第61位具有最高分值，為3.356，疏水性最強(qiáng)；而C末端有一個(gè)很強(qiáng)的親水性結(jié)構(gòu)，在第1 016 位具有最低分值，為-3.133，親水性最強(qiáng)。該蛋白的親水系數(shù)為0.079，該數(shù)值大于零，推測(cè)CmaSOS1為疏水蛋白。

2.2.5 CmaSOS1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CmaSOS1屬于典型的跨膜蛋白，具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這與已報(bào)道的其他植物[1,14]Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目(10～12)一致。同時(shí)，用SignalP-5.0預(yù)測(cè)CmaSOS1信號(hào)肽的可能性值為0.000 3， 小于0.5，因此該蛋白不存在信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。

2.2.6 CmaSOS1的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 根據(jù)PSORT預(yù)測(cè)，CmaSOS1最可能被定位于質(zhì)膜(80.0%)，其次是葉綠體類囊體膜(50.8%)和高爾基體(40.0%)，再次是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(30.0%)。

圖2 CmaSOS1基因cDNA序列及其推測(cè)的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence of CmaSOS1 gene and its deduced amino acid sequence

圖3 CmaSOS1基因的結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of CmaSOS1

圖4 CmaSOS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)預(yù)測(cè)Fig.4 Predicted secondary structure (A) and tertiary structure (B) of CmaSOS1 protein

2.2.7 CmaSOS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示，CmaSOS1蛋白含有NhaP (Na+/H+or K+/H+antiporter) domain、Na_H_Exchanger superfamily和CAP_ED (catabolite gene activator protein-effector domain) superfamily等保守性區(qū)域，還含有一個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)(ligand binding site)和一個(gè)靈活的鉸鏈區(qū)域(flexible hinge region)。

圖5 CmaSOS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 Conserved domains of CmaSOS1 protein

2.2.8 CmaSOS1蛋白的同源性與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)BLASTP下載中國(guó)南瓜CmoSOS1 (Cucurbitamoschata，XP_022955949.1)、西葫蘆CpeSOS1 (Cucurbitapepo，XP_023525783.1)、甜瓜CmeSOS1 (Cucumismelo，XP_008466844.1)、黃瓜CsaSOS1 (Cucumissativus，KGN49745.1)、苦瓜McSOS1 (Momordicacharantia，XP_022146360.1)、月季RcSOS1 (Rosachinensis，XP_024192426.1)、毛果楊PtSOS1 (Populustrichocarpa，XP_024466547.1)、葡萄VvSOS1 (Vitisvinifera，CBI26761.3)、荷花NnSOS1 (Nelumbonucifera，XP_010276296.1)、棗ZjSOS1 (Ziziphusjujuba，XP_015894007.1)、海濱錦葵KpSOS1 (Kosteletzkyapentacarpos，AIS92905.1)和陸地棉GhSOS1 (Gossypiumhirsutum，NP_001313957.1)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，上述物種與印度南瓜CmaSOS1氨基酸序列一致性分別為98%、98%、90%、89%、89%、74%、75%、75%、72%、71%、70%和70%(圖6)，均表現(xiàn)出較高的同源性。

由圖7可知，同屬葫蘆科植物的印度南瓜、中國(guó)南瓜、西葫蘆、甜瓜、黃瓜和苦瓜的SOS1蛋白處于同一分支，具有較高的同源性，其中，中國(guó)南瓜CmoSOS1和西葫蘆CpeSOS1與印度南瓜CmaSOS1的同源性最高，親緣關(guān)系最近。印度南瓜CmaSOS1與錦葵科的海濱錦葵KpSOS1和陸地棉GhSOS1的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 印度南瓜CmaSOS1與其他植物SOS1蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.6 Amino acid sequence alignment of SOS1 proteins from Cucurbita maxima and other species

2.3 CmaSOS1基因的表達(dá)分析

2.3.1CmaSOS1在印度南瓜各組織中的表達(dá) 由圖8可知，CmaSOS1基因在印度南瓜各組織中均有表達(dá)，但具有明顯的組織表達(dá)特異性。其中，CmaSOS1基因在根和葉中的表達(dá)量相對(duì)較高，其次是花和果實(shí)，在莖中的相對(duì)表達(dá)量最低，約為根中相對(duì)表達(dá)量的0.18倍。

2.3.2CmaSOS1在非生物脅迫下的表達(dá)分析CmaSOS1在不同的脅迫處理下具有不同的表達(dá)模式。由圖9-A可知，在200 mmol·L-1NaCl脅迫下，該基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在處理2 h達(dá)到最高峰，約為對(duì)照的1.2倍，在處理4 h時(shí)下降至對(duì)照的0.65倍，在處理6 h和12 h時(shí)基本保持穩(wěn)定，在處理24 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量最低，約為對(duì)照的0.15倍。在20% PEG 6000脅迫下，CmaSOS1基因同樣被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在處理2 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，約為對(duì)照的1.4倍，之后大幅下降，在處理6 h時(shí)達(dá)到最低值，約為對(duì)照的0.13倍，之后CmaSOS1相對(duì)表達(dá)量持續(xù)上升并在處理24 h時(shí)達(dá)到高峰，約為對(duì)照的1.3倍(圖9-B)。

3 討論

SOS1基因是植物耐鹽性的關(guān)鍵基因，它所編碼的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1在調(diào)控Na+運(yùn)輸和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，AtSOS1基因的過(guò)量表達(dá)能顯著增加擬南芥植株的耐鹽性[17]，而擬南芥AtSOS1缺失突變體大大提高了其對(duì)鹽脅迫的敏感性[11, 30]。為研究SOS1基因?qū)δ望}性的作用，已在地膚[1]、擬南芥[14]和鹽角草[31]等植物中克隆了該基因并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。本研究首次克隆獲得一條印度南瓜CmaSOS1基因，其編碼蛋白為疏水蛋白，在N末端具有一個(gè)很強(qiáng)的疏水性結(jié)構(gòu)，C末端有一個(gè)很強(qiáng)的親水性結(jié)構(gòu)，這與菊花[2]SOS1蛋白結(jié)構(gòu)相似，且在擬南芥中此親水性結(jié)構(gòu)參與對(duì)Na+信號(hào)的感知[14]，因此推測(cè)CmaSOS1蛋白C末端親水性結(jié)構(gòu)可能對(duì)印度南瓜細(xì)胞內(nèi)Na+濃度具有一定的調(diào)控作用。Tang等[32]發(fā)現(xiàn)白楊SOS1蛋白定位于液泡膜，在液泡膜上發(fā)揮Na+區(qū)隔化功能。而本研究結(jié)果顯示，印度南瓜CmaSOS1定位于質(zhì)膜上，可能在調(diào)控Na+外排過(guò)程中發(fā)揮重要作用。印度南瓜CmaSOS1蛋白與中國(guó)南瓜、西葫蘆、甜瓜、黃瓜和苦瓜SOS1蛋白的同源性較高，分別為98%、98%、90%、89%和89%，說(shuō)明親緣關(guān)系越近的物種，其SOS1蛋白同源性越高。

SOS1基因在植物響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，水稻[21]、鹽角草[31]、黃花草木樨[33]、胡楊[34]、海草[35]和苔蘚[36]等植物在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)其SOS1基因的表達(dá)量均顯著升高。Xu等[20]發(fā)現(xiàn)小麥TaSOS1受鹽脅迫誘導(dǎo)呈上調(diào)表達(dá)，而PEG 6000處理下無(wú)明顯變化；而甘蔗ScSOS1受NaCl和PEG誘導(dǎo)后均呈上調(diào)表達(dá)[37]。Shi等[14]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtSOS1的轉(zhuǎn)錄水平受鹽脅迫誘導(dǎo)而升高，但不受干旱脅迫、低溫脅迫和脫落酸(abscisic acid，ABA)處理的影響；而Song等[38]對(duì)大島野路菊的研究表明，其SOS1基因表達(dá)量不僅受鹽脅迫誘導(dǎo)而顯著增加，還受干旱、低溫和ABA處理的影響發(fā)生不同程度的變化。上述研究結(jié)果說(shuō)明，不同物種SOS1基因在響應(yīng)同一非生物脅迫時(shí)可能發(fā)揮著不同的功能。本研究結(jié)果表明，CmaSOS1基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，在印度南瓜根中的表達(dá)量最高，其次是葉片，在其他組織中相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較低。該研究結(jié)果與前人在擬南芥[14]、鹽角草[31]和星星草[39]中的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度NaCl和PEG 6000脅迫下，CmaSOS1基因均受到誘導(dǎo)而呈上調(diào)表達(dá)，且都在脅迫處理2 h時(shí)達(dá)到最高峰。由此推測(cè)，CmaSOS1基因可能在印度南瓜抵御鹽分脅迫和干旱脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但關(guān)于其功能驗(yàn)證及調(diào)控機(jī)理仍需要進(jìn)一步深入研究。

圖7 不同物種SOS1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of SOS1 proteins from different species

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters mean significant differences at 0.05 level. The same as following.圖8 CmaSOS1基因在印度南瓜不同組織中的表達(dá)Fig.8 Expression level of CmaSOS1 in different tissues of Cucurbita maxima

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，印度南瓜CmaSOS1基因cDNA全長(zhǎng)3 940 bp，包含一個(gè)3 429 bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼1 142個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其編碼蛋白CmaSOS1為酸性穩(wěn)定疏水性非分泌蛋白，屬于質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，且SOS1蛋白在葫蘆科植物中具有高度同源性。同時(shí)，CmaSOS1基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，在根中相對(duì)表達(dá)量最高，還可能在印度南瓜抵御鹽分脅迫和干旱脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。后期的研究仍需利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)或RNA干擾技術(shù)對(duì)其功能做進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖9 鹽脅迫(A)和干旱脅迫(B)下CmaSOS1基因的表達(dá)分析Fig.9 Expression level of CmaSOS1 under salt stress (A) and drought stress (B)