郝宇娉 陸 琳 楊志紅

(湖州師范學院生命科學學院，浙江 湖州 313000)

轉基因植物疫苗是利用分子生物學與基因工程技術將抗原編碼基因通過構建植物表達載體導入受體植物，利用植物的全能性使其在體內表達出具有免疫活性的蛋白質，得到能使機體具有免疫原性的基因重組疫苗，機體通過注射或食用含目標抗原的轉基因植物蛋白，激發(fā)免疫系統(tǒng)產生免疫應答，從而產生特異性的抗病能力[1]。1987年第38屆組織培養(yǎng)協會(The Tissue Cutural Association)年會提到了轉基因植物的研究，Curtiss等[2]于1990年率先獲得含鏈球菌變異株(Streptococcusmutants)表面抗原A(spaA)的轉基因煙草。

轉基因植物疫苗以植物作為生物反應器，可以在植物內對抗原進行表達，同時對蛋白進行準確的加工修飾，相較于傳統(tǒng)疫苗，具有生產成本低、生產周期短、成功率高，易形成規(guī)?；a等優(yōu)勢。盡管轉基因植物疫苗的研究還處于起步階段，但已報道的轉基因植物生物試驗取得了很大進展。截止目前，常見轉基因植物疫苗的目標抗原(附表1)包含細菌類[如霍亂毒素B亞單位(CholeratoxinB subunit，CTB)、大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(Escherichiacoliheat-labiletoxinB subunit，LTB)、結核桿菌素(Mycobacteriumtuberculosis)、幽門螺旋桿菌細胞毒素相關蛋白(HelicobacterpyloriCytotoxin associated protein)等]、病毒類[如乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus)、口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus，FMDV)、輪狀病毒(Rotavirus，RV)、諾沃克病毒(NorwalkVirus，NV)等]、寄生蟲類[如瘧原蟲(Plasmodium)、吸血蟲(Schistosoma)、肝片吸蟲(Fasciolahepatica)等]、避孕類[如透明帶(ZonaPellucida，ZP)]及糖尿病類[如胰島素原(Proinsulin，PROIN)、GAD65抗原表位等]，受體植物從較為簡單的模式植物煙草、擬南芥，逐漸擴展為表達量相對較高的番茄、萵苣、白菜(Brassicapekineniss)、大豆、羽扇豆、玉米、馬鈴薯等。

美國最先批準Tacket等[3]將轉入LTB的馬鈴薯進行了臨床試驗：14名志愿者中，11名食用轉基因馬鈴薯，3名食用非轉基因馬鈴薯，其中11名志愿者中有10名檢測到血液中含有抗體。隨后，Kapusta等[4]也進行了含乙肝病毒表面抗原(hepatits B surface an tigne, HBsAg)萵苣的臨床試驗，結果顯示，3名志愿者在2個月內進行2次免疫，兩周后檢測體內的抗體滴度最高可達100 IU·L-1。隨著生物技術的不斷發(fā)展和優(yōu)化，轉基因植物疫苗可能開創(chuàng)疫苗生產及應用的新途徑，其產生的經濟及社會效益將極大地推動疫苗研制、病原防治、機體免疫方面的發(fā)展。

1 轉基因植物疫苗創(chuàng)制的基本流程

常規(guī)轉基因植物疫苗的獲取途徑有兩種：1)穩(wěn)定性遺傳表達：通過抗原的結構基因構建植物表達載體，再借助一系列方法將外源基因整合至植物基因組，獲得能夠穩(wěn)定遺傳的目標植株；2)瞬時性高效表達：瞬時表達系統(tǒng)中外源DNA與受體植物基因組并不發(fā)生整合，而是在導入細胞一定時間后進行表達。植物中建立該系統(tǒng)的方法包括聚乙二醇法、電激法、基因槍法、病毒感染法和農桿菌介導法等。以最常用的病毒感染法為例(圖1)[5]，將目標抗原與作為載體的植物病毒進行融合表達，感染植株或植物細胞后，使之瞬時表達。常規(guī)需對表達的目標蛋白進行分離及純化以確定其表達準確性，最后進行生物檢測，獲取轉基因植物疫苗。

圖1 轉基因植物疫苗的基本操作流程[5]Fig.1 Basic operational procedures for transgenic plant vaccines[5]

1.1 目的抗原的選擇

轉基因植物疫苗生產的是亞單位疫苗，其中僅含具有免疫原性的抗原結構基因，不含其他遺傳信息。通過使用這種疫苗，可以使機體誘導產生免疫應答從而起到抵抗病原微生物、防治寄生蟲、避孕、預防治療糖尿病等作用[6]。在選擇抗原時，首先要選取病原體具有免疫活性的抗原DNA，一般為病原體表面編碼糖蛋白的基因。而對于易變異的病毒，則選取各亞型共有的核心蛋白為主要保護性抗原基因序列[7]。目前，已成功將細菌、病毒、寄生蟲等部分結構基因作為外源基因導入受體植物并得到有效地表達，并檢測到良好的免疫原性。

1.2 受體植物的選擇

轉基因受體植物的選擇對于抗原編碼基因的表達量及口服疫苗的應用前景有著十分重要的意義。受體植物應具備易遺傳操作、表達量高、基因序列已知、易再生、種植區(qū)域廣泛、易于儲存及運輸和適宜口服等特點[8]。在選擇受體植物的過程中，要根據各種植物的優(yōu)勢與不足，所表達的疫苗類型以及免疫對象來選擇合適的受體植物。煙草作為最早的模式植物生物反應器，因其無法直接食用等缺點，不易于大規(guī)模推廣生產。隨著轉基因技術的日趨成熟，能夠利用的轉基因植物種類越來越多，目前常用于表達轉基因疫苗的植物有芥菜、芒果(Mangileraindica)、萵苣、菠菜、番茄、胡蘿卜、蘋果、豇豆、苜蓿及一系列農作物等(附表1)。

1.3 表達載體的構建

載體的構建是通過酶切等手段將目的基因與選取的質粒進行連接，驗證并提純后轉化至感受態(tài)細胞，從而用于植物的外源蛋白表達。構建植物表達載體的主要目的是將目的基因進行修飾改造，使其轉入受體植物后表達符合需求，常用穩(wěn)定遺傳表達載體包括Gateway、pBI系列、pCAMBIA系列、pRTL系列、pPZP系列等(附表2)，而瞬時表達系統(tǒng)通常選用花椰菜花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus，CMV)、煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)等作為載體。

1.4 載體的表達與轉化

1.4.1 穩(wěn)定性表達系統(tǒng) 穩(wěn)定表達系統(tǒng)是將外源抗原基因序列連接至載體上，并通過一系列方法將免疫原基因導入植物細胞中，使其在植物基因組中穩(wěn)定地整合，在一定條件下將含有外源基因的植物細胞誘導長成新的植株，并在生長過程中表達目標抗原基因，將此性狀傳給子代，成為表達疫苗的品系[9]。目前廣泛運用的基因整合方式有兩種：一是整合到核基因組；二是整合到葉綠體基因組。該表達系統(tǒng)可以通過使用種子、塊莖、根和葉組織來積累重組抗原。穩(wěn)定表達系統(tǒng)的優(yōu)點在于整合穩(wěn)定、無需純化、安全性好，可同時將多個外源基因進行表達，且較易獲得大量轉基因株系，但同時也存在目標蛋白表達量低、表達效率低、外源基因易失活、植株再生和純合周期長、基因插入而造成的位置效應等弊端[10]。

1.4.2 瞬時性表達系統(tǒng) 瞬時表達系統(tǒng)是將編碼疫苗抗原決定簇基因序列插入病毒基因組中，基于植物病毒對植物的感染，以病毒作為載體將重組病毒接種至植物葉片上，使得抗原基因隨病毒在植物體內進行復制、轉錄、翻譯和裝配，在轉基因植物或細胞中產生多拷貝重組蛋白基因[11]。該體系具有用時較短、簡單易操作、表達速度快、拷貝數高、不存在染色體上的位置效應等優(yōu)點，而缺點是工作量較大、不能穩(wěn)定遺傳以及外源基因易丟失等。

1.5 轉基因植株的檢測

根據自身試驗需要，轉化成功的植株要進行檢測，以驗證其表達出的疫苗抗原蛋白的真實性，一般分為三個階段：一是針對導入的目標抗原核酸的檢測；二是針對外源基因編碼表達的目標蛋白的檢測；三是進行生物試驗，檢測表達的目標蛋白是否具有生物活性(圖2)。

關于核酸的檢測分為DNA與RNA的檢測。目前常用的檢測DNA的技術有聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)，包括常規(guī)PCR[12]、競爭性定量PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR、數字PCR[13]、巢式和半巢式PCR[14]等，Southern blot，核酸等溫擴增技術[15]，包括環(huán)介導等溫擴增、依賴核酸序列的等溫擴增、鏈替代擴增和滾環(huán)擴增等，此外還有DNA芯片、表面等離子共振傳感器[16]等方法。

現有常用的蛋白質檢測技術有Western blot[17]、ELISA、測流免疫測定[18]、磁免疫電化學傳感器、二維凝膠電泳[19]、質譜法、蛋白芯片等。除此之外，還應進行一系列生物試驗，包括環(huán)境抗性試驗、生物飼喂試驗、生物注射試驗及臨床試驗等。

2 基因植物疫苗的研究現狀

轉基因植物疫苗的研究按受體植物可分為煙草、擬南芥、番茄、苜蓿、蘋果、馬鈴薯等，按功能大致可分為五類，分別為細菌疫苗、病毒疫苗、避孕疫苗、糖尿病疫苗和寄生蟲疫苗。目前，數十種轉基因植物疫苗已進入動物試驗，并檢測出良好的免疫原性。一些轉化編碼基因的植物疫苗，如HbsAg、LTB、諾沃克病毒等，也已進入臨床試驗，用于預防和治療乙型肝炎及細菌性腹瀉，并在人體中產生免疫應答，顯示出良好的免疫效果。

2.1 細菌疫苗

2.1.1 霍亂腸毒素B亞單位 CTB能與腸道粘膜細胞表面特異性的神經節(jié)苷脂結合而引起腹瀉。最早由Arakawa等[20]將該基因導入馬鈴薯中，并獲得穩(wěn)定遺傳的植株，小鼠經靜脈注射后，其腹瀉累積減少60%；隨后Kim等[21]也成功將該基因通過農桿菌轉化至馬鈴薯植株；Jiang等[22]借助農桿菌介導法將CTB基因轉入番茄植株，獲得較高純度可溶性蛋白，將表達抗原基因的番茄飼喂小鼠一段時間后，在小鼠的血清和黏膜中檢測出了霍亂毒素抗體。盡管CTB已在胡蘿卜[23]等可食植物中成功表達，但Soh等[24]認為水稻更適合應用于口服疫苗，且獲得了谷類作物中CTB含量較高的轉基因植物，水稻種子中目標蛋白表達量在可溶性總蛋白中可達到21.3 ng·μg-1。CTB的研究相對較早，轉化體系也相對較為成熟，現多與其他抗原進行融合表達。

圖2 轉基因植物的常規(guī)檢測方法Fig.2 Conventional detection methods for transgenic plants

2.1.2 大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位 大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labile toxin，LT)是由1個A亞單位(LTA)和5個B亞單位(LTB)組成，其中B亞單位具有與真核細胞表面的GM1-神經節(jié)苷脂受體特異性結合的能力。LTB不僅是強烈的免疫原，也是一種強有力的黏膜免疫佐劑。LTB基因最早由Haq等[25]于1995年在煙草和馬鈴薯中得到表達，通過管飼法免疫的小鼠產生了腸粘膜抗LTB免疫球蛋白，并且喂養(yǎng)小鼠新鮮轉基因馬鈴薯塊莖也引起口服免疫。而后Mason等[26]和Lauterslager等[27]也分別以農桿菌轉化法將LTB基因導入馬鈴薯，并檢測到小鼠產生了粘膜免疫反應。目前無毒性的LTB表達蛋白已在玉米[28]等植株中得到表達，且Soh等[24]在水稻球蛋白(Glb)啟動子的控制下獲得更高表達的外源蛋白，應用于口服疫苗以預防腹瀉。由于人們習慣土豆和水稻熟食，但高溫可能導致外源蛋白變性失活，從而影響免疫效果，故提高可直接食用植物的表達效率將有助于該類疫苗在人類臨床上的發(fā)展。

2.1.3 幽門螺旋桿菌 幽門螺桿菌病是一種螺旋形、微厭氧、對生長條件要求十分苛刻的細菌，已確認為是慢性胃炎和化性潰瘍的主要致病因子。幽門螺旋桿菌細胞毒素相關蛋白(cytotoxin-associated gene A, CagA)已成功轉入煙草和番茄[29]。Zhang等[30]利用農桿菌轉化法獲得轉尿素酶B亞單位(urease B, UreB)胡蘿卜植株，轉化和再生的胡蘿卜根中表達的UreB蛋白為25 μg· g-1，并且有效誘導了小鼠的免疫反應，此外，UreB抗原還在擬南芥[31]、煙草和水稻等植物中進行了表達。而Yang等[32]通過構建包含花生種子特異性啟動子Oleosin的二元載體，獲得高產UreB蛋白的轉基因花生植株；Kalbina等[33]也于2010年成功構建3種不同幽門螺旋桿菌TonB蛋白載體，其表達量差異并不大，植物中的表達蛋白質濃度占總可溶性蛋白質的至少0.05%。近年來，幽門螺桿菌的相關基因的研究主要集中在細胞毒素相關蛋白(CagA)和尿素酶及其亞單位(Urease)上，但鮮有研究者對表達的上述3種外源蛋白的免疫效果進行比較。考慮到該類轉基因植物疫苗的未來發(fā)展，研究者還應進一步探究其不同抗原基因表達產物的免疫活性。

2.1.4 其他細菌疫苗 結核分枝桿菌是引起結核病的病原菌，可侵犯全身各器官，以肺結核最多見。目前已有結核桿菌ESAT-6在番木瓜[13]以及結核桿菌MPT64在胡蘿卜[34]中分別進行了表達。Módolo等[35]在2018年獲得了結核桿菌糖蛋白APA轉基因擬南芥植株；Hajibehzad等[36]將志賀氏痢疾桿菌IpaD在煙草中獲得瞬時表達，煙草葉片和毛狀根中均檢測到IpaD，且煙草毛狀根中可溶性總蛋白最高表達量為0.94 ng·μg-1。Tregoning等[37]于2003年將破傷風毒素C片段(tetanus C segment, TetC)通過葉綠體轉化煙草，煙草葉綠體中積累的TetC占可溶性細胞總蛋白的10%，質體所表達的TetC抗體使小鼠產生了粘膜免疫應答。從以上研究結果來看，細菌疫苗的研究還處于初級階段，由于研究范圍的限制，大多細菌疫苗以模式植物為主，且未能進入臨床研究和試驗，日后該類疫苗臨床試驗的開展將為人類抵御各類細菌病原體提供新的方向。

2.2 病毒疫苗

2.2.1 乙型肝炎病毒疫苗 乙型肝炎病毒攜帶者最終會因肝硬化或肝癌而死亡。乙肝表面抗原(hepatitis B sarface antigen, HBsAg)現已有表面S、M、L、HBc等蛋白獲得表達。Mason等[38]最早將HbsAg導入煙草中，獲得轉基因植株。動物實驗證明,將抗性植株葉片的蛋白提取物注入接種乙型肝炎病毒的小鼠中后，產生的免疫反應與酵母表達的HbsAg相當。隨后也成功獲得了含編碼基因的番茄[39]、香蕉[40]、胡蘿卜[41]、花生[42]、人參[43]、大豆[44]、蘋果[45]、豇豆[46]、煙草[47]等植株。Deineko等[48]發(fā)現將preS2-S抗原定向轉運至內質網腔的信號肽序列，可明顯增強目標蛋白在轉基因胡蘿卜中的積累，這為轉基因植物疫苗的研制提供了新的思路。Thanavala等[49]將HBsAg抗原含量為8.5±2.1 μg·g-1的轉基因馬鈴薯對42名志愿者進行了試驗，隨機分為3組，結果顯示，食用HBsAg馬鈴薯的志愿者均表現出滴度明顯增強的效果，且食用次數越多滴度越高。乙型肝炎病毒易產生變異，可使機體免疫應答低下，增加了肝炎發(fā)病率及患者死亡率，轉基因植物疫苗在乙型肝炎病毒方面的研究將為臨床上治療由該病毒引發(fā)的疾病提供新的方法。

2.2.2 口蹄疫病毒疫苗 口蹄疫(foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)是由口蹄疫病毒引起的一種感染偶蹄動物的急性、熱性、高度接觸性傳染病。其結構蛋白基因 VP1為主要抗原位點，可產生中和抗體、誘導免疫反應，是重點研究對象[50]。1993年，Usha等[51]率先將VP1基因插入豇豆花葉病毒 (CowpeaMosaicVirus，CPMV)外殼蛋白基因組中，將利用雜合病毒粒子制備的成疫苗免疫豚鼠，結果在機體中檢測到抗體蛋白。隨后，將該編碼基因陸續(xù)導入了擬南芥、苜蓿、煙草、馬鈴薯、番茄等植物中并成功表達，獲得了具有免疫原性的抗體蛋白。此外，Dus Santos等[52]利用農桿菌轉化法將口蹄疫病毒(FMDV)衣殼蛋白前體P1及蛋白酶3C導入苜蓿，將轉基因植物提取物3次免疫小鼠，10 d后在小鼠血樣中檢測到特異性FMDV抗體。FMDV表位疫苗的研究一直廣受關注，O型FMDV合成肽疫苗現已被應用于豬的免疫，具有明確的免疫保護效果。針對抗原結構差異較大的A型FMDV表位疫苗的免疫效果是廣受關注的研究內容，將為未來A型FMDV的防控提供新的方法。

2.2.3 輪狀病毒 輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科，是病毒性腹瀉最主要的病原物。研究證實，輪狀病毒表面抗原VP7、VP4具有中和抗原活性，VP6具有保護抗原活性，具有較高的免疫原性和反應原性[53-54]。已報道將輪狀病毒VP7導入馬鈴薯和胡蘿卜中，結果均反映在植株中產生了具有活性的抗原蛋白。Kim等[55]將輪狀病毒VP6導入番茄細胞，在懸浮培養(yǎng)體系中，借助丁酸鈉的誘導獲得最高重組VP6 0.73 mg·L-1；而Dong等[56]利用農桿菌轉化法獲得了轉基因輪狀病毒VP6苜蓿植株，苜蓿中VP6蛋白表達量占總可溶性蛋白的0.28%，強飼小鼠后，小鼠的腹瀉癥狀明顯減輕。輪狀病毒是引起嬰兒及幼齡動物胃腸炎和腹瀉的主要病因，從研究結果上看，VP6蛋白可能具有更好的免疫效果且具有更廣泛的應用前景。

2.2.4 其他人類致病病毒 人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，abbr: HIV)，是于1981年首次在美國發(fā)現的造成人類免疫系統(tǒng)缺陷的一種病毒。它是一種感染人類免疫系統(tǒng)細胞的慢病毒(Lentivirus)，屬逆轉錄病毒。2002年Zhang等[57]報道了將人類免疫缺陷病毒(HIV-1)P4蛋白導入煙草。隨后Karasev等[58]運用基因槍法獲得轉HIV-1 Tat蛋白基因菠菜，對小鼠進行時隔一周的3次口服免疫，發(fā)現小鼠體內Tat抗體滴度升高，并在接種4周后達到峰值。截至目前，HIV-1的gap及gp120在番茄中得到表達，Vafaee等[59]于2018年在轉基因萵苣中獲得較高的重組蛋白，表達量高達8.942 μg·100 mg-1。

人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒，是球形DNA病毒，可引起人類良性的腫瘤和疣?，F已成功將HPV-16 L1轉入馬鈴薯[60]、煙草[61]和番茄[62-63]。此類疫苗還有諾沃克病毒疫苗[64]、結腸直腸癌(Carcinomaofcolonandrectum)疫苗[65]、非霍奇金淋巴瘤(Non-hodgkin’slymphoma，NHL)疫苗[66]、麻疹病毒(Measlesvirus，MV)疫苗[67]、扎伊爾埃博拉病毒(Zaire ebolavirus)疫苗[68-69]、登革熱病毒(Denguevirus，DV)疫苗[70]、人巨細胞病毒(Humancytomegalovirus)疫苗[71]、花粉過敏疫苗[72]、狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)[73-74]等。這些致病病毒主要集中于瞬時表達，未來在上述病毒的穩(wěn)定遺傳表達方面的發(fā)展，將推動各病毒類疾病在臨床上的預防和治療。

2.2.5 其他動物致病病毒 動物致病病毒通常會對牲畜、家禽類動物的飼養(yǎng)過程帶來巨大損失，為有效防止病害帶來的災難性后果，現已成功獲得一批轉基因植物疫苗。Tien等[75]將豬流行性腹瀉病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus, PEDV)S1D抗原通過葉綠體轉化法導入煙草，植株可溶性S1D蛋白單獨表達量約為總量的0.07%，融合蛋白S1D-CTB表達水平達到1.4%；An等[76]獲得了表達豬生殖和呼吸綜合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV)GP4D和GP5D蛋白的擬南芥植株，在轉化的擬南芥中獲得1.66%目標蛋白，并在生物試驗的豬體內檢測到特異性抗體。2015年，Mbewana等[77]在煙草中瞬時表達了甲型H5NI禽流感病毒M2e蛋白，并將植物產生的重組蛋白純化后注射到小鼠中，Western印跡分析證實在免疫的小鼠血清中存在M2e特異性抗體。動物與人類的生活息息相關，對畜禽類動物的病原微生物密切關注并及時采取預防措施不僅有利于保護動物，減少飼養(yǎng)損失，還可間接地對人的生命健康產生積極影響。

2.3 寄生蟲疫苗

瘧疾是世界性的嚴重寄生蟲病。寄生蟲病嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)，在生產實踐中，因化學藥物的大量使用，導致許多寄生蟲已產生抗藥性，傳統(tǒng)的化學藥物防治方法受到了嚴重挑戰(zhàn)，而轉基因植物疫苗開辟了有效控制寄生蟲病的途徑。Turpen等[78]將編碼瘧原蟲抗原決定簇基因插入煙草花葉病毒，以構建植物病毒載體，然后轉染煙草, 在葉片中獲取到0.4～1.2 mg·g-1濕重重組蛋白。李霞等[79]將瘧原蟲多表位抗原基因與CTB基因融合構建植物表達載體，隨后轉化至煙草，經PCR檢驗證實整合成功。目前，已有弓形蟲SAG1基因[80]、肝片吸蟲主要保護性抗原基因FH3、日本血吸蟲鐵蛋白[81]基因轉入到番茄、紫花苜蓿和油菜植株中，并成功獲得了表達抗原的轉化植株。

2.4 避孕疫苗

哺乳動物卵透明帶是由卵母細胞及顆粒細胞分泌并覆蓋于卵母細胞及著床前受精卵外的一層基質，ZP蛋白在精卵結合及精子穿透卵透明帶中起著非常重要的作用，影響受精過程的成敗。Fitchen等[82]將小鼠ZP3蛋白的抗原決定簇插入TMV的衣殼蛋白中，轉染植物并獲得高水平的融合蛋白，用這些提取病毒樣顆粒作為抗原進行腸胃外免疫，使得小鼠血清抗體識別了體內的ZP3表位，且發(fā)現透明帶聚集有抗ZP3抗體，從而達到了避孕的效果。截至目前，轉基因避孕疫苗的報道相對較少，若轉基因避孕疫苗開發(fā)成功，則將極大地便利相關人群。

2.5 糖尿病疫苗

人類Ⅰ型糖尿病是一種器官特異性自身免疫疾病，目前主要通過注射胰島素來控制高血糖。陳麗[83]將胰島素原和胰島素B鏈(insulin B chain，INSB)導入馬鈴薯，獲得轉基因植株；而侯宇清[84]利用基因槍法，將多Ⅰ型糖尿病發(fā)生的一種自身抗原—肽P277與CTB融合基因轉入小麥，獲得轉基因糖尿病疫苗。Ruhlman等[85]通過葉綠體轉化法將CTB與人胰島素原(Pins)導入煙草，與陰性對照的胰島中剩余的少量β細胞相比，CTB-Pins處理的小鼠的胰島中產生胰島素的β細胞顯著增加，具有較低的血液或尿液葡萄糖水平；Kwon等[86]在煙草中使CTB與艾塞那肽(exenatide)進行融合表達，其表達水平達到總葉蛋白的14.3%； Choi等[87]使用瞬時轉化法，在普通煙草葉片中檢測到艾塞那肽-4與人轉鐵蛋白融合蛋白產量高達37 μg·g-1，并且在本塞姆氏煙草的瞬時轉化葉中獲得137 μg·g-1的表達量。糖尿病作為人體的一種代謝障礙疾病，若不進行有效地控制，將為人體帶來一系列致命的影響，而糖尿病疫苗在各類可食用植物方面的研制，將為各類型糖尿病人的治療提供新的手段，這在糖尿病防治歷程中具有里程碑式的意義。

3 總結與展望

相較于傳統(tǒng)疫苗轉基因植物疫苗有極大的優(yōu)勢，但還存在一些問題：1)抗原表達效率低：這也是目前轉基因植物疫苗所面臨的最大問題之一，外源蛋白表達含量低，在使用過程中易失去生物活性，限制了其開發(fā)與應用。2)生物安全性：轉基因植物的基因滲入[11]，一方面轉基因植物的抗生篩選可能對應用機體產生不可預測的危害，另一方面若進行大規(guī)模的種植也可能會對周圍環(huán)境中其他生物造成一定影響。3)免疫效果差：轉基因植物作為一種口服疫苗使用時，其外源蛋白會經消化系統(tǒng)被不同程度地降解，從而降低抗原性[88]。4)耐受性：機體的免疫耐受性是免疫劑量、免疫程序、抗原特異性等多因素綜合作用的結果，當機體對該疫苗產生免疫耐受性，會導致免疫效果變差。

針對上述問題，目前對于轉基因植物疫苗的優(yōu)化可采取以下措施：1)不同的啟動子在不同的轉基因植物中表達效率差異大，且不同植物對目標抗原的表達量也不同，因此，采取優(yōu)化啟動子或優(yōu)選受體植物的方法提高目標蛋白的表達量。此外，將抗原DNA整合至葉綠體基因組或核基因組也有利于提高表達效率。2)利用葉綠體的母系遺傳使外源蛋白靶向于葉綠體也可以解決基因滲入的不良影響。此外，也可在種子特異性或花粉特異性啟動子的控制下，使用可逆抑制基因以產生不育植物或利用基因工程技術對轉基因植物的抗性基因進行敲除。3)嘗試使用沙門氏菌和弧狀霍亂桿菌作為載體菌株[89]或利用包衣對口服疫苗進行保護性包被從而提高其在消化道內的穩(wěn)定性，提高免疫效果。4)可減少服用或使用次數，加大單次攝入量等方式以避免耐受性問題。

綜上所述，因植物疫苗能提供相對廉價的蛋白質源，故利用轉基因植物開發(fā)新型疫苗是一種較經濟有效的途徑，且具有廣闊的發(fā)展前景。相信隨著植物學、免疫學、分子生物學等各個學科領域的迅速發(fā)展，對轉基因植物的編碼基因表達、產物植株的免疫原性和臨床評價的深入研究，轉基因植物疫苗能夠不斷優(yōu)化，得到廣泛應用并造福人類。

附表1 目標抗原與受體植物、表達系統(tǒng)對照表Schedule 1 List of target antigens, their recipient plants and expression systems

附表1(續(xù))

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附表2 近年常用植物表達載體與受體植物一覽表Schedule 2 List of commonly used plant expression vectors and accepted plants