解文利，方月月，吳雨烔，周禮紅

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

紅曲霉作為一種藥食兩用絲狀真菌[1]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物催化等領(lǐng)域。紅曲霉能生物合成紅曲色素、Monacolin K、黃酮類、類黃酮、γ-氨基丁酸等廣泛生理活性物質(zhì)[2-5]，其中Monacolin K是膽固醇合成限速酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（hydroxymethyl glutarate monoacyl coa reductase，HMG-CoA）的顯著抑制劑，用于治療高膽固醇血癥和高脂血癥[6]，含有的γ-氨基丁酸具有降血壓的作用，并且是大腦的一種化學(xué)傳遞物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)大腦興奮與抑制等作用[7-9]。

雙向發(fā)酵是指用真菌為發(fā)酵菌株，以中藥材作為藥性基質(zhì)，該基質(zhì)在為真菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，又與真菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物相互作用、相互影響，從而產(chǎn)生新的性味功能，使整個(gè)發(fā)酵具有雙向性[10-12]。雙向發(fā)酵后的菌質(zhì)相對(duì)于原藥材主要有幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：提高提取效率、減輕毒性、產(chǎn)生新的有效成分、增強(qiáng)藥效[11，13]。銀杏葉具有多種活性物質(zhì)，其中的黃酮和內(nèi)酯類化合物，具有降血脂、抗氧化、抗衰老等作用[14-16]。銀杏葉與微生物進(jìn)行共發(fā)酵，利用微生物的代謝活動(dòng)，可起到增強(qiáng)銀杏葉中活性成分，降低其毒性成分的含量的作用[17]。任金玫[18]利用冠突散囊菌和銀杏毛茶進(jìn)行共發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毒性成分銀杏酸下降了44.6%，活性物質(zhì)黃酮提高了3.14%。Weihua Qiu等[19]利用漆酶與銀杏葉共發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)銀杏葉中黃酮含量比未發(fā)酵基質(zhì)提高了24.11%。目前，甚少有紅曲霉與銀杏葉共發(fā)酵的報(bào)道，故本試驗(yàn)通過前期篩選得出的銀杏葉，以紅曲霉為發(fā)酵菌種，通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究紅曲霉-銀杏葉共發(fā)酵對(duì)銀杏葉藥汁中總黃酮含量以及紅曲霉生物量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫紅曲霉 3.45-1（Monascus 3.45-1）：貴州大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室選育；銀杏葉Ginkgo biloba：貴州同濟(jì)堂制藥有限公司；葡萄糖、麥芽糖、蔗糖：成都金山化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；所用試劑均為分析純。玉米粉、大米粉、甘薯淀粉、麥麩、米糠、馬鈴薯淀粉、甘油、花生粉、魚粉、豬血粉、蠶蛹粉、豬肝粉、黃豆粉：市售；蘆丁標(biāo)品（純度99%）：成都曼斯特生物技術(shù)有限公司；沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，1 000 mL，pH值自然，用于紅曲霉斜面培養(yǎng)。藥汁培養(yǎng)基（空白對(duì)照）：稱取銀杏葉，加適量水浸泡1 h，煮沸30 min，倒出藥汁，補(bǔ)加適量冷水于藥渣中，再煮沸20 min，倒出藥汁。8層紗布過濾，121℃滅菌30 min，作為工藝優(yōu)化的基本培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-82A數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器：金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；LDZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；DH-360A電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；759紫外分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；TD6M低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)：長(zhǎng)沙高新開發(fā)區(qū)湘儀貝克儀器儀表有限公司；DP73生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司；GZX-GF-101-2烘箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸液的制備

紫紅曲霉菌株28℃斜面培養(yǎng)7 d～11 d；用無菌吐溫生理鹽水洗下孢子，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩，充分打散孢子，用4層無菌鏡頭紙過濾除去菌絲，制成終濃度為106cfu/mL的均一孢子懸液，備用。

1.3.2 發(fā)酵藥汁培養(yǎng)基的制備

將紫紅曲霉孢子懸液（106cfu/mL），以10%的接種量接入裝有85 mL藥汁培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，150 r/min，（28±1）℃培養(yǎng)11 d備用。作為未添加碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽發(fā)酵藥汁的對(duì)照組。

1.3.3 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)優(yōu)化

1.3.3.1 碳源確定

分別選取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、大米粉、甘薯淀粉、麥麩、米糠、馬鈴薯淀粉、甘油10種碳源添加到基本培養(yǎng)基中，添加量均為3%，接種紅曲霉，30℃，125 r/min振蕩培養(yǎng)11 d，考察不同碳源對(duì)總黃酮含量、生物量的影響。

1.3.3.2 氮源確定

分別取有機(jī)氮源蛋白胨、酵母膏、花生粉、魚粉、豬血粉、蠶蛹粉、豬肝粉、黃豆粉（添加量1%）；無機(jī)氮源NaNO3、（NH4）2SO4（添加量0.2%）為氮源添加到基本培養(yǎng)基中，接種紅曲霉，培養(yǎng)條件同1.3.3.1，研究不同氮源對(duì)總黃酮含量、生物量的影響。

1.3.3.3 生長(zhǎng)因子優(yōu)化

分別將微量維生素B1、維生素B6、維生素B12、維生素C 4種生長(zhǎng)因子添加到基本培養(yǎng)基中，接種紅曲霉，培養(yǎng)條件同1.3.3.1，考察不同生長(zhǎng)因子對(duì)總黃酮含量、生物量的影響。

1.3.3.4 無機(jī)鹽優(yōu)化

向基本培養(yǎng)基中分別加入 CaCl2、FeSO4、MnSO4、CuSO4、ZnSO4（添加量為 0.1%）5種無機(jī)鹽，接種紅曲霉，培養(yǎng)條件同1.3.3.1，研究不同無機(jī)鹽對(duì)總黃酮含量、生物量的影響。

1.3.3.5 裝液量的優(yōu)化

向 250 mL 錐形瓶中分別裝入 25、40、55、70、85、100 mL基本培養(yǎng)基，接種紅曲霉，培養(yǎng)條件同1.3.3.1，考察不同裝液量對(duì)總黃酮含量、生物量的影響，確定最佳裝液量。

1.3.3.6 接種量?jī)?yōu)化

按照5%、10%、15%的接種量將紅曲霉孢子懸液接種于裝有85 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)，確定最佳接種量。

1.3.3.7 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

在確定最佳裝液量、接種量的基礎(chǔ)上，將紅曲霉接到藥汁培養(yǎng)基中，在30℃，125 r/min振蕩培養(yǎng)條件下分別培養(yǎng) 8、9、10、11、12、13 d。確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.3.8 初始pH值優(yōu)化

調(diào)節(jié)藥汁培養(yǎng)基的初始pH值分別為 3、4、5、6、7、8后，接種紅曲霉，培養(yǎng)條件及方法同1.3.3.1，確定最佳初始pH值。以上試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)采用L18（36）正交表，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定正交試驗(yàn)的因素和水平。選取碳源濃度、氮源濃度、KH2PO4濃度、MgSO4濃度、碳源種類、氮源種類這6個(gè)因素為考察因素進(jìn)行優(yōu)化，以紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵后紅曲霉生物量及發(fā)酵液中總黃酮含量的高低確定最優(yōu)綜合發(fā)酵組合。雙向發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表見表1。

表1 雙向發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factor and level table of orthogonal experiment design of bidirectional fermentation

1.3.5 生物量的測(cè)定

將發(fā)酵液3 000 r/min離心20 min，棄上清，取沉淀，清水重懸沉淀，再3 000 r/min離心20 min，取沉淀即菌絲體，（60±1）℃烘干至恒重，稱重得生物量。

1.3.6 總黃酮的含量測(cè)定

1.3.6.1 對(duì)照樣品的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，置25 mL容量瓶中，加80%乙醇溶解，定容即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.6.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分置于25 mL容量瓶中，加1 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，放置6 min，再加1 mL 10%Al（NO3）3溶液，搖勻，放置6 min，加4%10 mL氫氧化鈉顯色[20]，以在357 nm處的吸光度A對(duì)濃度C（mg/mL）回歸，并求得回歸方程。

1.3.6.3 樣品溶液制備

取銀杏葉中藥汁16 mL（相當(dāng)于2.0 g生藥），分置于索氏提取器中，用石油醚（60℃～90℃）水浴回流脫脂2次（每次2 h），棄去石油醚提取液。揮干石油醚，置100 mL燒瓶中，用80%乙醇回流提取兩次，每次反應(yīng)時(shí)間20 min，提盡黃酮。定量轉(zhuǎn)移入100 mL容量瓶中，加80%乙醇至刻度，搖勻，即得待測(cè)樣品液。

將對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5 mL和供試品溶液2 mL分置于25 mL容量瓶中，依1.3.6.2的方法進(jìn)行顯色[20]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)溶液，以試劑為空白，用分光光度計(jì)在375 nm處測(cè)定吸光度，由回歸方程求出樣品溶液中總黃酮濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。分析結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s，n=3）表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在357 nm處以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（蘆丁量）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：A=29.657X+0.017 5（r=0.999 2）。

2.2 添加不同碳源對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響

不同碳源對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響見圖1。

圖1 不同碳源對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on Monascus purpureus-Ginkgo biloba leaves bilevel fermentation

由圖1可知，發(fā)酵后的銀杏葉藥汁總黃酮含量均低于未發(fā)酵銀杏葉藥汁，與未添加碳源的發(fā)酵藥汁相比，當(dāng)在發(fā)酵藥汁中添加麥芽糖時(shí)，銀杏葉藥汁中總黃酮含量增加最為顯著（P＜0.01），總黃酮含量達(dá)到（0.033±0.002）mg/mL，其次是添加葡萄糖、蔗糖，總黃酮含量分別提高到（0.032±0.001）、（0.032±0.000 6）mg/mL。在添加米糠、麥麩、甘薯淀粉后，與未添加碳源的發(fā)酵藥汁相比，發(fā)酵液中的總黃酮含量由最初的（0.022±0.001 1）mg/mL 分別降低至（0.018±0.000 6）、（0.018±0.001）、（0.019±0.001）mg/mL。對(duì)紅曲霉生物量而言，添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖到發(fā)酵藥汁中，對(duì)紅曲霉生物量的增加最為顯著（P＜0.01），而玉米粉、米糠、麥麩的添加不利于紅曲霉的生長(zhǎng)?？傮w上，碳源結(jié)構(gòu)越簡(jiǎn)單，對(duì)于紅曲霉生物量和發(fā)酵液中總黃酮含量的提高效果越明顯，這是因?yàn)榧t曲霉可以將多糖轉(zhuǎn)化為可利用的單糖[21-22]，但在發(fā)酵初期，菌種量少，淀粉酶，纖維素酶的活力低，碳源結(jié)構(gòu)復(fù)雜無法滿足紅曲霉的生長(zhǎng)代謝[4]，故選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖添加到發(fā)酵藥汁培養(yǎng)基中。

2.3 添加不同氮源對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響

不同氮源對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響見圖2。

從圖2中可以看出，與未發(fā)酵銀杏葉藥汁相比，氮源的添加使發(fā)酵銀杏葉藥汁的總黃酮含量均降低，與發(fā)酵銀杏葉藥汁相比，蛋白胨、（NH4）2SO4、花生粉三者添加到發(fā)酵銀杏葉藥汁時(shí)，銀杏葉藥汁總黃酮含量提高最為顯著（P＜0.01），分別達(dá)到（0.036±0.000 7）、（0.033±0.001 4）、（0.030±0.000 9）mg/mL。與未添加氮源的發(fā)酵藥汁相比，氮源的添加均能使紅曲霉的生物量增加，其中添加蠶蛹粉、NaNO3、花生粉后紅曲霉生物量增加最為顯著（P＜0.01），分別增加（5.26±0.011）、（5.10±0.017）、（4.99±0.007）g/L。有機(jī)氮源比無機(jī)氮源作氮源添加更有利于紅曲霉的生長(zhǎng)，可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源含有紅曲霉所需的必需氨基酸[21]，由于考慮原料來源、成本、是否適合食用等方面，最終選擇蛋白胨、酵母膏、花生粉這3種氮源作為發(fā)酵優(yōu)化的氮源種類。

圖2 不同氮源對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on Monascus purpureus-Ginkgo biloba leaves biloba fermentation

2.4 添加不同生長(zhǎng)因子對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響

不同生長(zhǎng)因子對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響見圖3。

圖3 不同生長(zhǎng)因子對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of different growth factors on the double fermentation of Monascus purpureus-Ginkgo biloba leaves

由圖3可知，添加了維生素B1的銀杏葉發(fā)酵藥汁較未添加生長(zhǎng)因子的銀杏葉發(fā)酵藥汁，其總黃酮含量的提高不顯著（P＞0.05），其它生長(zhǎng)因子添加至銀杏葉發(fā)酵藥汁中，總黃酮含量明顯低于未添加生長(zhǎng)因子的銀杏葉發(fā)酵藥汁。對(duì)紅曲霉生物量而言，生長(zhǎng)因子的添加使生物量均提高，其中維生素B1的添加使生物量提高最為顯著（P＜0.01）。由最初的（3.12±0.049）g/L 提高到（4.85±0.01）g/L。故選擇維生素B1作為發(fā)酵藥汁培養(yǎng)基的生長(zhǎng)因子。

2.5 添加不同無機(jī)鹽對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響

不同無機(jī)鹽對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 不同無機(jī)鹽對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of different inorganic salts on the double fermentation of Monascus purpureus-Ginkgo biloba leaves

由圖4可知，與未發(fā)酵藥汁相比，發(fā)酵藥汁和添加無機(jī)鹽的發(fā)酵藥汁中的總黃酮含量均低于未發(fā)酵藥汁的總黃酮含量，添加FeSO4時(shí)，發(fā)酵藥汁總黃酮含量提高最為顯著（P＜0.01），從最初的（0.022±0.001 1）mg/mL提高到（0.031±0.000 8）mg/mL，添加 FeSO4、MnSO4、CuSO4后，紅曲霉的生物量較未添加無機(jī)鹽時(shí)顯著提高，分別提高到（4.31±0.005 8）、（3.59±0.012）、（4.69±0.006 6）g/L。CaCl2、ZnSO4的添加使銀杏葉藥汁中紅曲霉的生物量減小。鑒于總黃酮含量、生物量的雙重考量，最終選擇FeSO4作為發(fā)酵藥汁培養(yǎng)基的無機(jī)鹽。

2.6 裝液量對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響

裝液量對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響見圖5。

圖5 裝液量對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of loading amount on double direction fermentation of Monascus purpureus-Ginkgo biloba leaves

如圖5所示，當(dāng)裝液量從25 mL逐漸增加到100 mL時(shí)，紅曲霉生物量一直呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，總黃酮含量開始沒有明顯變化，從70 mL增加到85 mL時(shí)，總黃酮含量明顯增加，且在裝液量為85 mL時(shí)生物量的值也達(dá)到最大，生物量從最初的（1.04±0.007）g/L升高到（3.47±0.008 1）g/L。從85 mL增加到100 mL時(shí)，總黃酮含量不變，生物量減小，原因可能是由于裝液量的增加在使搖瓶中養(yǎng)分增加的同時(shí)也降低了發(fā)酵液中的溶氧，氧氣減少成為了發(fā)酵的主要限制因素，故生物量減小。綜合兩者的裝液量曲線，在裝液量為85 mL時(shí)兩者產(chǎn)量均最高，故確定85 mL為紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的最佳裝液量。

2.7 接種量對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響

接種量對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響見圖6。

如圖6所示，銀杏葉發(fā)酵藥汁中總黃酮含量隨接種量的增大無多大變化。紫紅曲霉生物量呈先增大后減小，當(dāng)接種量為 10%時(shí)，生物量（3.12±0.017 1）g/L含量達(dá)到最大。隨著接種量增大，菌體代謝旺盛，分泌大量胞外酶類，能較好的利用發(fā)酵基質(zhì)，故有利于菌體生長(zhǎng)，可以縮短菌體繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，并且可減少雜菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)，但是接種量過大，也會(huì)導(dǎo)致單位體積內(nèi)養(yǎng)料和溶氧不足以及消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過多，導(dǎo)致菌的生長(zhǎng)受到影響，最終影響產(chǎn)物的合成[23-25]。綜合該因素對(duì)銀杏葉藥汁總黃酮含量和紅曲霉的生物量的影響，選擇10%為最佳接種量。

圖6 接種量對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on double direction fermentation of Monascus purpureus-Ginkgo biloba leaves

2.8 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響見圖7。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響Fig.7 Effects of culture time on the double direction fermentation of Monascus purpureus-Ginkgo biloba leaves

由圖7可以看出，從第8天到第12天，總黃酮含量呈先減后增再減的趨勢(shì)，在11 d時(shí)，總黃酮含量又升高到最大值（0.022±0.000 3）mg/mL。然后從12 d到13 d時(shí)總黃酮的含量又呈減少趨勢(shì)。在發(fā)酵初期，發(fā)酵時(shí)間過短，不利于目標(biāo)產(chǎn)物的積累，發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗及多種代謝產(chǎn)物的積累導(dǎo)致環(huán)境不利于菌體生長(zhǎng)[26]。紅曲霉生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而一直呈上升趨勢(shì)，在10 d到11 d之間增速是最快的，11 d到13 d增長(zhǎng)速度是趨于平緩的。綜上分析，將紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的最佳發(fā)酵時(shí)間定為11 d。

2.9 初始pH值對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響

初始pH值對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響見圖8。

圖8 初始pH值對(duì)紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵的影響Fig.8 Effect of initial pH on double fermentation of Monascus purpureus-Ginkgo biloba leaves

如圖8所示，初始pH值為3時(shí)，發(fā)酵藥汁總黃酮含量和紅曲霉生物量都不高，可能是銀杏葉藥汁中過酸的環(huán)境不利于紅曲霉生長(zhǎng)的原因。在初始pH值調(diào)至4～5時(shí)，有利于總黃酮含量的提高，且在pH 5時(shí)達(dá)到最大值（0.022±0.000 8）mg/mL。當(dāng) pH＞5時(shí)，紅曲霉的生物量先增后減，而發(fā)酵藥汁總黃酮含量呈下降后增趨勢(shì)。經(jīng)分析，選擇初始pH值為5時(shí)是紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵時(shí)的最適pH值。

2.10 紅曲霉-銀杏葉雙向發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)優(yōu)化

銀杏葉發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表2可看出，對(duì)總黃酮含量的影響最大的是碳源種類，其次是碳源和氮源濃度，影響最小的是氮源種類，總黃酮含量最高的最優(yōu)組合是A2B3C1D2E1F3。對(duì)生物量影響最大的是氮源濃度，其次MgSO4濃度，影響最小的是氮源種類，生物量最大的最優(yōu)組合為A2B3C1D2E1F3。由表3可知，碳源濃度、氮源濃度、MgSO4濃度以及碳源種類對(duì)總黃酮含量和生物量這兩者的影響極顯著（F＞F0.01），KH2PO4濃度對(duì)總黃酮含量的影響顯著（F＞F0.05），對(duì)生物量的影響極顯著（F＞F0.01），氮源種類對(duì)總黃酮含量和生物量的影響都不顯著（F＜F0.05）。

表2 發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experimental

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results

從表2可以看出，正交試驗(yàn)最佳發(fā)酵條件（A2B3C1D2E3F1）和在極差結(jié)果中得出的最優(yōu)組合（A2B3C1D2E1F3）不一致，通過試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。即在葡萄糖濃度4%、花生粉濃度1.5%、KH2PO4濃度0.1%、MgSO4濃度0.12%的條件下進(jìn)行紅曲霉和銀杏葉雙向發(fā)酵，對(duì)所得發(fā)酵液中的總黃酮含量、生物量進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定總黃酮含量為0.074 mg/mL、生物量為13.26 g/L，均高于在正交組合中的最大值。因此選取組合A2B3C1D2E1F3為發(fā)酵的最優(yōu)組合。即葡萄糖濃度4%、花生粉濃度1.5%、KH2PO4濃度0.1%、MgSO4濃度0.12%。在此組合下，雙向發(fā)酵體系中的總黃酮含量比未利用紅曲霉發(fā)酵的對(duì)照組提高了100%；紅曲霉生物量比未優(yōu)化前的對(duì)照組提高了76.47%。發(fā)酵體系中總黃酮含量的升高，可能是紅曲霉能利用銀杏葉藥汁中的某些物質(zhì)，經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)換成黃酮或萜內(nèi)酯類[27-28]。辛燕花等[29]利用靈芝與銀杏葉進(jìn)行雙向液體發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)與未發(fā)酵的銀杏葉相比黃酮類物質(zhì)明顯增加，趙林果等[30]將銀杏葉與黑曲霉進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)銀杏葉通過微生物代謝轉(zhuǎn)化后總黃酮含量提高5.77%。

3 結(jié)論

以銀杏葉藥汁中的總黃酮含量和紅曲霉生物量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，獲得的最佳發(fā)酵組合為葡萄糖濃度4%、花生粉濃度1.5%、KH2PO4濃度0.1%、MgSO4濃度0.12%，在此優(yōu)化組合下，銀杏葉發(fā)酵藥汁的總黃酮含量為0.074 mg/mL，紅曲霉生物量為13.26 g/L。銀杏葉藥汁中總黃酮含量的增加，可能是紅曲霉產(chǎn)生的龐大酶系可以搭建起藥性基質(zhì)里更多活性物質(zhì)合成的途徑，另外，在發(fā)酵過程中，微生物的代謝作用可能將其他成分轉(zhuǎn)化為黃酮類物質(zhì)。