楊宇華，黃艷，鄭寶東

（1.武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建武夷山354300；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

艾草（Artemisia argyi），又稱遏草、醫(yī)草、灸草等，是一種藥食兼用的草本植物，具有獨(dú)特的天然生物活性，艾草黃酮即為其天然生物活性成分之一[1-3]。為使艾草黃酮成分能夠得到全面開(kāi)發(fā)，本研究在艾草黃酮粗提取的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分離純化，黃酮類化合物分離純化的方法已比較成熟，如溶劑萃取法、膜分離法、超臨界流體萃取法、薄層色譜分離、高效液相色譜分離等，但以上方法各存在不足之處，如純化成本高、產(chǎn)品純度低、設(shè)備要求較高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等。

大孔吸附樹(shù)脂技術(shù)因其成本低、選擇性好、產(chǎn)品純度高、樹(shù)脂可再生、工藝簡(jiǎn)單利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[4-6]，近年來(lái)被廣泛用于中草藥活性成分的分離純化研究。本文開(kāi)展大孔吸附樹(shù)脂對(duì)艾草總黃酮的吸附純化研究，比較6種大孔樹(shù)脂的吸附及解吸性能，篩選出最佳大孔樹(shù)脂，并利用最佳大孔樹(shù)脂對(duì)艾草總黃酮進(jìn)行靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附純化研究，確定最佳純化工藝，以期為艾草總黃酮的高效利用及性質(zhì)組分鑒定提供相關(guān)理論依據(jù)。

動(dòng)物機(jī)體代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）、過(guò)氧化氫（H2O2）等傷害機(jī)體的自由基[7-9]，從而引起蛋白質(zhì)病變、DNA鏈斷裂、酶失活等，因此，清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，對(duì)于維持機(jī)體健康尤為重要。本文以VC為陽(yáng)性對(duì)照，從總還原力、對(duì)羥基自由基（·OH）和二苯代苦味?；杂苫―PPH·）、超氧陰離子自由基（O2-·）、清除效果等方面開(kāi)展艾草總黃酮粗提物及純化物的體外抗氧化活性研究，以期為艾草黃酮類化合物作為天然抗氧劑的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：成都西亞試劑有限公司；DPPH：Sigma公司；過(guò)硫酸鉀、水楊酸、氯化鐵、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。HP-20型樹(shù)脂：非極性，比表面積（m2/g）500～550；ADS 17 型樹(shù)脂：中極性，比表面積（m2/g）90～150；DM-301型樹(shù)脂：弱極性，比表面積（m2/g）≥330；HPD500 型樹(shù)脂：弱極性，比表面積（m2/g）500～550；AB-8 型樹(shù)脂：弱極性，比表面積（m2/g）≥400；D101 型樹(shù)脂：非極性，比表面積（m2/g）≥550。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16G型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-3200PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；WSC-S型測(cè)色色差計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；QYC-200型全溫培養(yǎng)搖床：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；RE 2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HL-2型恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；BSZ-100-LCD型自動(dòng)部分收集器：上海琪特分析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣液制備

參照前期試驗(yàn)艾草總黃酮的最佳提取工藝[10]：乙醇濃度 43%、提取溫度 80℃、料液比 1∶69（g/mL）、超聲功率350 W，提取時(shí)間40 min，在此條件下得到艾草總黃酮提取率最高為18.62%，純度為36.1%，收集備用。

1.3.2 大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理

將 6 種 樹(shù) 脂 （D101、HP-20、ADS 17、DM301、HPD500、AB-8）用95%乙醇溶液浸泡24 h，浸泡至充分溶脹，于100目篩中用蒸餾水充分洗滌，無(wú)乙醇味且流出的洗滌液澄清不渾濁，后置于鹽酸溶液（5%）中浸泡5 h用蒸餾水過(guò)100目篩充分洗滌，直至pH試紙顯示流出的洗滌液呈中性，再于5%氫氧化鈉溶液浸泡5 h，用蒸餾水充分洗滌，直至流出的洗滌液使pH試紙顯示中性，最后將處理好的樹(shù)脂置于蒸餾水中備用。

1.3.3 大孔吸附樹(shù)脂篩選

分別稱取上述預(yù)處理后的6種大孔樹(shù)脂各2.0 g，置于50mL的錐形瓶中，加入20mL艾草總黃酮粗提液，置于30℃恒溫振蕩箱中，于150 r/min轉(zhuǎn)速下充分振蕩24 h，真空抽濾，測(cè)定濾液中艾草總黃酮的濃度。用蒸餾水沖洗，直至大孔吸附樹(shù)脂表面的艾草總黃酮洗凈為止，抽濾得到吸附飽和的樹(shù)脂，再加入80%乙醇溶液20 mL作為解吸液，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫振蕩箱中充分振蕩24 h，真空抽濾，測(cè)定濾液的總黃酮濃度。大孔吸附樹(shù)脂吸附量、吸附率和解吸率的計(jì)算公式如下：

式中：Q 為大孔樹(shù)脂吸附量，mg/mL；Q1、Q2分別為大孔吸附樹(shù)脂吸附率和解吸率，%；C0為吸附前艾草總黃酮溶液濃度，mg/mL；C1為吸附后艾草總黃酮溶液濃度，mg/mL；C2為艾草總黃酮溶液解吸液中濃度，mg/mL；V為樣品溶液的體積，mL；M為樹(shù)脂濕重，g。

1.3.4 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

1.3.4.1 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)動(dòng)力學(xué)曲線繪制

精確稱取AB-8大孔吸附樹(shù)脂1.000 0 g于50 mL錐形瓶中，加入30 mL艾草總黃酮溶液，將其置于轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為30℃的恒溫振蕩器中振蕩充分。每間隔30 min快速?gòu)闹形? mL溶液，測(cè)定總黃酮溶液的濃度，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.4.2 pH值對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附率的影響

精確稱取AB-8大孔樹(shù)脂1.000 0 g于50 mL錐形瓶中，加入艾草總黃酮溶液20 mL，pH值分別為2～8，于恒溫振蕩箱中溫度30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min、充分振蕩150 min，真空抽濾，測(cè)定總黃酮溶液的濃度，計(jì)算AB-8大孔吸附樹(shù)脂在不同pH值下的吸附率。

1.3.4.3 溫度對(duì)AB-8大孔樹(shù)脂吸附率的影響

精確稱取AB-8大孔樹(shù)脂1.000 0 g于50 mL錐形瓶中，加入pH值為4的艾草總黃酮溶液20 mL，分別調(diào)節(jié)恒溫振蕩箱溫度為20℃～60℃，于150 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩吸附，每隔20 min吸取上清液測(cè)定總黃酮溶液濃度，繪制艾草總黃酮溶液吸附曲線。

1.3.4.4 乙醇濃度對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂解吸率的影響

精確稱取AB-8大孔吸附樹(shù)脂1.000 0 g于50 mL錐形瓶中，于30℃、150 r/min下恒溫振蕩180 min后抽濾，在樹(shù)脂中加入20 mL的乙醇溶液，濃度分別為50%～100%，再于上述恒溫振蕩箱中，充分振蕩，解吸24 h，測(cè)濾液總黃酮溶液濃度，繪制AB-8大孔吸附樹(shù)脂在不同乙醇濃度的解吸曲線。

1.3.5 AB-8大孔吸附樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

1.3.5.1 上樣液濃度對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附率的影響

用預(yù)處理過(guò)的大孔吸附樹(shù)脂裝柱，將濕樹(shù)脂瀝干并采用濕法裝柱，自然沉降。配置pH值為4的艾草總黃酮液1.0 mg/mL～3.0 mg/mL，上樣量50 mL，控制上樣流速為1 mL/min，計(jì)算吸附率，探討上樣液濃度對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附率的影響。

1.3.5.2 上樣液速率對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附率的影響

裝柱方法同1.3.5.1，配制pH值為4，濃度為2.5 mg/mL的艾草總黃酮溶液，上樣量為50 mL，控制上樣速度為0.5 mL/min～2.5 mL/min，計(jì)算吸附率，探討上樣液速率對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響。

1.3.5.3 洗脫劑用量對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂解吸率的影響

裝柱方法同1.3.5.1，配制pH值為4、濃度為2.5 mg/mL的艾草總黃酮溶液，上樣量為50 mL，上樣速率1.5 mL/min，待樹(shù)脂吸附完全后，分別用40 mL～120 mL的80%乙醇溶液以1.5 mL/min的速率進(jìn)行洗脫，測(cè)定濾液的總黃酮濃度，繪制不同洗脫劑用量對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂的解吸效果。

1.4 純度計(jì)算

將艾草總黃酮用AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附純化，對(duì)比純化前后的純度，計(jì)算其純度。計(jì)算公式如下：

1.5 抗氧化能力的測(cè)定

1.5.1 艾草總黃酮總還原力的測(cè)定

參照溫晉芳等[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。具體操作為：分別配置濃度為0.1 mg/mL～0.8 mg/mL的艾草總黃酮粗提液和純化液、VC溶液，各取1 mL于離心管中，加入2.5 mL磷酸緩沖液（pH6.6，0.2 mol/L）和鐵氰化鉀溶液（1%），混勻置于水浴鍋（50℃）中水浴20 min，急速冷卻，加入三氯乙酸溶液（10%）2.5 mL，攪拌均勻，于離心機(jī)（3 000 r/min）中離心10 min，移取2.5 mL上清液，再加入蒸餾水2.5 mL和FeCl3（0.1%）0.5 mL，混勻后靜置10 min，于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度值。

1.5.2 艾草總黃酮清除DPPH·能力的測(cè)定

參考Wang等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。具體操作為：將4 mg DPPH溶解于100 mL無(wú)水乙醇中，4℃下避光保存；將0.75 mL的0.1 mmol/L DPPH與1.5 mL不同濃度的總黃酮溶液混勻，暗處?kù)o置30 min，以無(wú)水乙醇為空白，于波長(zhǎng)517 nm測(cè)定吸光度A1?？瞻讓?duì)照為：0.75 mL無(wú)水乙醇與1.5 mL不同濃度的總黃酮溶液混勻，暗處?kù)o置30 min，以無(wú)水乙醇為空白，于波長(zhǎng)517 nm測(cè)定吸光度A2；陰性對(duì)照為：將0.75 mL的0.1 mmol/L DPPH與1.5 mL無(wú)水乙醇混勻，暗處?kù)o置30 min，以無(wú)水乙醇為空白，于波長(zhǎng)517 nm測(cè)定吸光度A0。根據(jù)公式（5）計(jì)算總黃酮溶液對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.5.3 艾草總黃酮清除·OH能力的測(cè)定

采用Fenton法進(jìn)行測(cè)定。具體操作為：將VC和純化前后的艾草總黃酮配制成0.1 mg/mL～1.6 mg/mL的溶液，以蒸餾水為空白，分別量取4 mL待測(cè)溶液于比色管中，加入2 mol/L的FeSO4溶液3 mL和6 mmol/L水楊酸3 mL，再于比色管中加入2 mmol/L H2O23 mL，搖勻，于37℃下反應(yīng)15 min后在510 nm處測(cè)定吸光度值，按照公式（6）計(jì)算·OH的清除率：

式中：A0為空白吸光度值；A1為待測(cè)液吸光度值。

1.5.4 艾草總黃酮清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[13]進(jìn)行測(cè)定。具體操作為：將VC和純化前后的艾草總黃酮配制成1 mg/mL的溶液，分別于比色管中加入待測(cè)液0.1 mL～0.8 mL，然后加入3.7 mL pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液，搖勻，于25℃水浴鍋中水浴20 min，再加入3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，迅速搖勻倒入比色皿中，以10 mmol/L鹽酸作空白對(duì)照，于320 nm處測(cè)定吸光度值，每30 s記錄一次數(shù)值A(chǔ)320，共測(cè)10次，隨時(shí)間變化作A320線性關(guān)系圖，斜率為鄰苯三酚自氧化速率，根據(jù)公式（7）計(jì)算O2-·的清除率：

式中：V0為空白對(duì)照鄰苯三酚自氧化速率；V1為待測(cè)液鄰苯三酚自氧化速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

2.1.1 不同大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解吸效果比較

6種大孔樹(shù)脂吸附及解吸試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 6種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)艾草總黃酮靜態(tài)吸附及解吸附性能比較Table 1 Determination of dynamic desorption rate of total flavonoids from Artemisia argyi by six kinds of adsorption resin

D101在6種大孔吸附樹(shù)脂中的吸附率最高，HPD500、AB-8和 HP-20次之，DM301、和 ADS17的吸附率較低，但同時(shí)AB-8的解吸效果最好，作為合適的分離純化樹(shù)脂不僅吸附能力要強(qiáng)，且需要形成可逆吸附。同時(shí)，由于生產(chǎn)率與樹(shù)脂的吸附動(dòng)力學(xué)特征關(guān)系緊密，因此，選取吸附和解吸附兼好的AB-8大孔吸附樹(shù)脂作為分離純化艾草總黃酮的最佳樹(shù)脂，后續(xù)試驗(yàn)均以AB-8大孔吸附樹(shù)脂為研究對(duì)象，具體探究其靜態(tài)及動(dòng)態(tài)的吸附和解吸性能。

2.1.2 AB-8大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)試驗(yàn)結(jié)果分析

AB-8大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖1。pH值對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂的吸附效果的影響見(jiàn)圖2。吸附溫度對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附效果影響見(jiàn)圖3。乙醇濃度對(duì)AB-8樹(shù)脂解吸效果影響見(jiàn)圖4。

由圖1可得吸附時(shí)間30 min～180 min時(shí)，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，艾草總黃酮溶液的吸附率逐漸升高；180min后，曲線逐漸趨于平緩，樹(shù)脂吸附基本達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，吸附時(shí)間選擇180 min為宜。

圖1 AB-8大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 AB-8 resin static adsorption kinetics curve

圖2 pH值對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂的吸附效果的影響Fig.2 Effect of pH value on adsorption rate and desorption rate of AB-8 resin

圖3 吸附溫度對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附效果影響Fig.3 Effect of adsorption temperature on adsorption of AB-8 resin

圖4 乙醇濃度對(duì)AB-8樹(shù)脂解吸效果影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption of AB-8 resin

由圖2可得：溶液pH值為2～4時(shí)，艾草總黃酮的吸附率增大；當(dāng)pH值為4時(shí)，總黃酮的吸附率達(dá)到87.50%；當(dāng)pH值超過(guò)4時(shí)，吸附率隨pH值的升高而逐漸下降。這是因?yàn)辄S酮為多羥基酚類化合物，呈酸性，在酸性條件下以分子狀態(tài)存在，通過(guò)范德華力與樹(shù)脂吸附，因此易被吸附，而在堿性條件下，黃酮分子羥基去離子化，黃酮類化合物形成離子型結(jié)構(gòu)，故不易被吸附[14]。因此，在上樣液pH值為4時(shí)，AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)艾草總黃酮吸附效果最好。

由圖3可得：在不同溫度下，隨著吸附時(shí)間的增加，AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)艾草總黃酮的吸附率均呈上升趨勢(shì)；當(dāng)時(shí)間小于40 min時(shí)，不同溫度條件對(duì)應(yīng)的總黃酮吸附率相差較小，當(dāng)時(shí)間大于40 min后，20、30℃和50℃對(duì)應(yīng)的總黃酮吸附率要高于40℃和60℃，且100 min后，20℃對(duì)應(yīng)的艾草總黃酮吸附率要高于其它溫度條件下的吸附率。因此，選取20℃為最佳吸附溫度。

由圖4可得：選取乙醇溶液作為洗脫劑，對(duì)樹(shù)脂具有很好的解吸效果。當(dāng)乙醇濃度為50%～80%時(shí)，樹(shù)脂的解吸能力隨著乙醇濃度的增加而逐漸提高；當(dāng)乙醇濃度超過(guò)80%時(shí)，解吸率趨于平緩。這是由于黃酮類化合物與樹(shù)脂間有強(qiáng)烈的氫鍵作用，吸附在樹(shù)脂上的黃酮類化合物不容易被水和低濃度的乙醇洗脫下來(lái)[15]。因此，從解吸效果和節(jié)約乙醇兩方面考慮，選擇80%的乙醇最為適宜，對(duì)應(yīng)解吸率達(dá)84.4%。

2.2 動(dòng)態(tài)試驗(yàn)分析

上樣液濃度對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附率的影響見(jiàn)圖5。上樣速度對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附率的影響見(jiàn)圖6。洗脫劑流速對(duì)大孔吸附樹(shù)脂解吸率的影響見(jiàn)圖7。乙醇用量對(duì)大孔吸附樹(shù)脂解吸率的影響見(jiàn)圖8。

圖5 AB-8上樣濃度對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附效果的影響Fig.5 Effect of loading concentration on adsorption of AB-8 resin

圖6 上樣液流速對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附效果的影晌Fig.6 Effect of the flow rate of the sample solution on the adsorption of AB-8 resin

圖7 洗脫液流速對(duì)解吸效果的影響Fig.7 Effect of eluent flow rate on desorption

圖8 乙醇用量對(duì)洗脫的影響Fig.8 Effect of different ethanol volumes on desorption

由圖5可得：當(dāng)上樣液濃度為1.0 mg/mL～2.5 mg/mL時(shí)，樹(shù)脂的吸附率隨著上樣液濃度增加而升高；當(dāng)上樣液濃度超過(guò)2.5 mg/mL時(shí)，吸附率反而降低。這是由于濃度低的黃酮溶液在通過(guò)柱床時(shí)，其流速過(guò)大，大于傳質(zhì)速度，傳質(zhì)未進(jìn)行徹底吸附；而濃度高的上樣液通過(guò)柱床的流速減慢，向內(nèi)部傳質(zhì)速度變慢，使得有些黃酮成分沒(méi)有被及時(shí)吸附就泄漏出來(lái)[16]；此外，上樣液濃度過(guò)大也可能造成大孔吸附樹(shù)脂使用周期短，再生次數(shù)增多，影響樹(shù)脂的使用壽命。當(dāng)上樣液濃度為2.5 mg/mL時(shí)，吸附率最高為83.2%，故選擇上樣液濃度2.5 mg/mL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖6可得：上樣液流速在0.5 mL/min～1.5 mL/min時(shí)，隨著流速的增大，總黃酮的吸附率增大；當(dāng)流速為1.5 mL/min時(shí)，總黃酮吸附率最大，達(dá)到87.1%；當(dāng)流速在1.5 mL/min～2.5 mL/min時(shí)，隨著流速增大，總黃酮吸附率減小。這是因?yàn)榱魉龠^(guò)低時(shí)溶液與樹(shù)脂的接觸時(shí)間長(zhǎng)，吸附率逐漸升高，可適當(dāng)增大流速，但流速過(guò)高時(shí)溶液與樹(shù)脂的接觸時(shí)間太短，有效成分不能完全吸附在樹(shù)脂上，從而導(dǎo)致黃酮的泄漏量增加，吸附率降低[17-18]，因此選擇上樣流速1.5 mL/min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖7可得：當(dāng)洗脫流速為1.5 mL/min時(shí)，解吸率最高為91.2%。在過(guò)高或過(guò)低的洗脫速率下，解吸率均較低。這是因?yàn)樵谳^低流速下，不能完全洗脫樹(shù)脂上的黃酮；當(dāng)流速過(guò)快時(shí)，由于洗脫劑與黃酮接觸時(shí)間太短，無(wú)法徹底從樹(shù)脂上洗脫。因此，選擇洗脫速率1.5 mL/min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖8可得：當(dāng)乙醇用量為40 mL～100 mL時(shí)，隨著乙醇用量的增加，解吸率逐漸增加；當(dāng)乙醇用量為100 mL時(shí)，樹(shù)脂的解吸率最高為95%；繼續(xù)增大乙醇用量，解吸率反而降低。這是因?yàn)橄疵搫┮掖加昧康蜁r(shí)，樹(shù)脂對(duì)黃酮的吸附作用使其難以完全解吸，造成洗脫不徹底，當(dāng)洗脫用量過(guò)大時(shí)，樹(shù)脂未能對(duì)黃酮完全吸附，并在淋洗過(guò)程中造成泄漏損失[19-20]。因此，選擇乙醇用量100 mL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 艾草總黃酮純化前后純度比較

純化前后艾草總黃酮的純度比較結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 純化前后艾草總黃酮的純度比較Table 2 Comparison of purity before and after purification

由表2可知，經(jīng)過(guò)純化艾草總黃酮的純度由（36.1±0.50）%增加至（75.43±0.93）%，純度提高了近 2倍，說(shuō)明純化效果良好。

2.4 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

艾草總黃酮粗提物、純化物和VC的總還原力比較見(jiàn)圖9。艾草總黃酮粗提物、純化物和VC對(duì)DPPH·的清除能力見(jiàn)圖10。艾草總黃酮粗提物、純化物和VC對(duì)·OH清除能力見(jiàn)圖11。艾草總黃酮粗提物、純化物和VC對(duì)O2-·清除能力見(jiàn)圖12。

由圖9可得：物質(zhì)的還原力可反映其抗氧化能力，當(dāng)某物質(zhì)的還原力很強(qiáng)時(shí)，其供應(yīng)的電子可還原氧化性物質(zhì)，還可與其自由基反應(yīng)，形成穩(wěn)定性較強(qiáng)的物質(zhì)，因此，還原力越強(qiáng)代表物質(zhì)抗氧化性越強(qiáng)[21]。總黃酮粗提物、純化物和VC的總還原力均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，即濃度越大，還原力越強(qiáng)，表明總黃酮溶液具有一定的還原力；在同一濃度下，純化物總還原力大于粗提物，但粗提物和純化物的還原力均小于VC。

圖9 艾草總黃酮粗提物、純化物和VC總還原力比較Fig.9 Total reduction force of VC，purified substance and flavonoid crude extract

圖10 艾草總黃酮粗提物、純化物和VC對(duì)DPPH·清除能力的比較Fig.10 The ability to eliminate DPPH radical of flavonoids from VC，purified substance and flavonoid crude extract

圖11 艾草總黃酮粗提物、純化物和VC對(duì)·OH的清除率Fig.11 ·OH clearance rate of flavonoids crude extract，VCand purified substance

圖12 艾草總黃酮粗提物、純化物和VC對(duì)O2-·的清除率Fig.12 O2-·clearance rate of flavonoids crude extract，VCand purified substance

由圖10可得：DPPH·是用于測(cè)定植物提取液抗氧化能力的一種快速、簡(jiǎn)便的方法，其溶解性好，性質(zhì)穩(wěn)定，在有機(jī)溶劑中是一種較穩(wěn)定的自由基，抗氧化劑供質(zhì)子的能力決定了DPPH自由基的清除能力[22]。隨濃度的增大，艾草總黃酮粗提物和純化物、VC對(duì)DPPH·的清除率均呈上升趨勢(shì)，當(dāng)濃度為0.1 mg/mL～0.4 mg/mL時(shí)，艾草總黃酮粗提物和純化物對(duì)應(yīng)的清除率增加明顯，增幅分別為41.6 mg/mL和31.7 mg/mL；當(dāng)濃度為1.6 mg/mL時(shí)，黃酮粗提物和純化物對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到最大值，分別為67.1%、80.8%。在相同濃度下，艾草總黃酮純化物清除DPPH·的能力高于粗提物。綜上，艾草總黃酮粗提物和純化物對(duì)DPPH·均有一定的清除能力，純化物的清除效果優(yōu)于粗提物，但均弱于VC。

由圖11可得：羥基自由基是氧自由基中的一種對(duì)細(xì)胞及大分子生物破壞作用較強(qiáng)的自由基，它會(huì)與體內(nèi)如氨基酸、糖類、脂類等一系列物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而引起機(jī)體組織核酸斷裂、脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)聚合等生化反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞組織發(fā)生病變，引發(fā)各類疾病產(chǎn)生和加快機(jī)體衰老速度[23-24]。隨著質(zhì)量濃度的增加，黃酮粗提物、純化物和VC對(duì)·OH的清除率不斷增大，當(dāng)濃度為0.1 mg/mL～1.6 mg/mL時(shí)，艾草總黃酮粗提物的清除率從18.01%提高至65.03%，純化物的清除率從28.04%提高至86.01%。在質(zhì)量濃度相同的條件下，對(duì)·OH清除率由高到低的排序?yàn)椋篤C＞純化物＞粗提物。

由圖12可得：艾草總黃酮粗提物、純化物和VC對(duì)O2-·清除能力。超氧陰離子自由基是代謝過(guò)程中產(chǎn)生的第一氧自由基，自身具有強(qiáng)烈的毒害物質(zhì)，其生成的衍生物（羥自由基和過(guò)氧化氫）具有一定的細(xì)胞毒性[25]。隨著質(zhì)量濃度的增加，黃酮粗提物、純化物和VC對(duì)O2-·的清除率不斷增大，濃度為0.6 mg/mL時(shí)三者對(duì)應(yīng)的清除率均達(dá)最大值，粗提物和純化物的清除率分別為49.92 mg/mL和58.03 mg/mL；當(dāng)濃度＞0.6 mg/mL時(shí)，三者清除率無(wú)明顯變化。在質(zhì)量濃度相同的條件下，對(duì)O2-·清除率由高到低的排序?yàn)椋篤C＞純化物＞粗提物。

3 結(jié)論

通過(guò)比較6種大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附和解吸附效果，結(jié)果表明AB-8大孔吸附樹(shù)脂的綜合效果最佳，其最佳工藝條件為：上樣液濃度為2.5 mg/mL，上樣液pH值為4，吸附溫度為20℃，上樣速度為1.5 mL/min，選用80%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1.5 mL/min，洗脫用量為100 mL。在此吸附和解吸條件下，艾草總黃酮的純度由36.1%上升至75.43%，純度提高了近2倍。該方法成本低、選擇性好、產(chǎn)品純度高、樹(shù)脂可再生、工藝簡(jiǎn)單利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。體外抗氧化試驗(yàn)表明：艾草總黃酮具有良好的體外抗氧化能力。純化物總還原力和DPPH·、·OH、O2-·清除能力均強(qiáng)于粗提物，但都弱于VC。