吳建文，黎貴卿，關(guān)繼華，湯星月，楊素華，邱米，李秋庭，陸順忠，黃湘穎，*

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧530002；2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004）

在植物中，脂類物質(zhì)以三酰甘油酯的形式存儲(chǔ)在被稱為油體或油質(zhì)體的球形細(xì)胞器中，外圍由單層磷脂分子和獨(dú)特的油體蛋白構(gòu)成[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)責(zé)三酰甘油酯的合成并最終形成油體[2]。化學(xué)和超微結(jié)構(gòu)分析表明油體外層磷脂分子的疏水?；c油體內(nèi)側(cè)的三酰甘油相互作用，而親水頭部基團(tuán)則與油體外的細(xì)胞液進(jìn)行接觸[3]。油體蛋白由N端兩性區(qū)、中間高度疏水區(qū)和C端構(gòu)成，其中中間疏水區(qū)可形成極為保守的發(fā)卡結(jié)構(gòu)[4]。油體蛋白對(duì)維持油體的穩(wěn)定性和油體的大小具有重要作用[5]。不同植物的油體大小不一，變化可從納米級(jí)至微米級(jí)[6]。在種子的發(fā)育過程中，油體主要聚集在子葉、胚乳等組織中[7]。植物種子中油體與含油率的相關(guān)性備受人們的廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)花生[8]、油茶[9]、油棕[10-11]、甘藍(lán)型油菜種子[12]的油體數(shù)量、大小與含油率呈正相關(guān)。

油茶作為我國特有的木本油料作物，被譽(yù)為“東方橄欖油”，其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分受到廣大消費(fèi)者的青睞。諸多學(xué)者[13-14]對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育過程中糖類、蛋白質(zhì)及油脂等代謝情況開展了大量研究，以期對(duì)油茶良種的選育提供理論支撐。然而，采后的油茶果仍然是一個(gè)生命活體，其糖類、蛋白質(zhì)及油脂的相互轉(zhuǎn)化并未停止，在生理后熟過程中內(nèi)含物會(huì)發(fā)生一系列的變化，尤其是油脂含量會(huì)進(jìn)一步積累[15]。因此，本課題組從應(yīng)用研究的角度對(duì)采摘后的油茶果進(jìn)行了有光處理、無光處理、室內(nèi)陰干（避光）和自然曬干處理，采用尼羅紅染色和共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，分析4種不同方式處理后油茶果油體的大小、形狀、數(shù)量及分布等情況與含油率的關(guān)系，以期通過采后油茶鮮果的前處理實(shí)現(xiàn)含油率的提升，為油茶加工企業(yè)提供數(shù)據(jù)參考，促進(jìn)油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣西普通油茶果：廣西鳳山春天有機(jī)農(nóng)業(yè)有限公司提供，2018年11月1日采摘于廣西壯族自治區(qū)河池市鳳山縣。

石油醚、冰乙酸、乙醇，甲醛：均為分析純，南寧藍(lán)天實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；尼羅紅染料：上海麥克林生化科技有限公司；0.1 μmol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KD-Ⅲ冰凍切片機(jī)：浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；FV3000共聚焦激光掃描顯微鏡：Olympus Corporation；DFY-1000C粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將采后的100 kg油茶果隨機(jī)、均勻分成4份，分別進(jìn)行有光處理、無光處理、室內(nèi)陰干（避光）和自然曬干處理。有光處理方式為：將油茶果平鋪放置在35℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)48 h后在60℃烘箱內(nèi)干至水分含量約10%；無光處理為：將油茶果平鋪放置在35℃培養(yǎng)箱中無光培養(yǎng)48 h后在60℃烘箱內(nèi)干至水分含量約10%；室內(nèi)陰干處理方式為：在避光條件下，將油茶果平鋪放置，陰干至水分含量約為10%；自然曬干處理為：將油茶果平鋪放置室外，自然晾曬至水分含量約10%。

1.3.2 含油率的測(cè)定

用粉碎機(jī)將油茶仁（去除種皮）快速地磨碎成均勻的細(xì)顆粒，棄去最先粉碎的約二十分之一的樣品后，用6 mm條形篩處理，混勻后在30 min內(nèi)測(cè)定。稱取粉碎后的試樣10 g，精確至0.001 g。采用索式抽提法測(cè)定油脂含量，試劑為石油醚，每個(gè)處理均重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.3 油體的觀察

隨機(jī)選取不同處理后的油茶籽，從子葉部分切取規(guī)格為1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm的樣品。在4℃條件下，將樣品放入福爾馬林—冰乙酸—50%酒精混合液（體積比5∶6∶89）中固定24 h。將固定好的樣品用冰凍切片機(jī)進(jìn)行切片，冰凍切片機(jī)冷臺(tái)和刀片的溫度均設(shè)為-20℃。隨后，將切好的樣品置于尼羅紅染液中避光孵育。染色好的樣品用0.1 mol/LPBS緩沖液漂洗3次，清除未結(jié)合的染料。接著用浸鏡油進(jìn)行封片，減少染色劑淬滅。在激光共聚焦激光顯微鏡20倍和40倍物鏡進(jìn)行觀察，吸收波長(zhǎng)為553 nm。

制片過程中切片厚度和染色時(shí)間的優(yōu)化設(shè)計(jì)：（1）切片厚度：采用冰凍切片的方式，切片厚度分別為：20、40、60 μm。（2）染色時(shí)間：4、8、12 h。

1.4 數(shù)據(jù)處理

油體直徑的計(jì)算：每個(gè)處理隨機(jī)選取30個(gè)油體，利用Image J軟件測(cè)定其截面積，計(jì)算出直徑。含油體率/%=單個(gè)細(xì)胞內(nèi)油體截面積總和/整個(gè)細(xì)胞截面積×100。每個(gè)處理隨機(jī)選取30個(gè)細(xì)胞，利用Image J軟件分別算出每個(gè)細(xì)胞內(nèi)油體截面積總和及單個(gè)細(xì)胞截面積[16]。模型擬合及殘差分析采用SPSS 19.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 切片厚度對(duì)染色效果的影響

切片厚度取決于細(xì)胞大小，切片過薄對(duì)細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞液在后期染色、洗脫過程中容易流失，油體也容易隨之流失，切片過厚影響共聚焦激光掃描顯微鏡的觀察效果。因此，試驗(yàn)前隨機(jī)選取了30個(gè)細(xì)胞，采用共聚焦激光掃描顯微鏡調(diào)出細(xì)胞界面清晰的圖片，利用Image J軟件計(jì)算每個(gè)不規(guī)則細(xì)胞的截面長(zhǎng)度，最終算出平均長(zhǎng)度為（69.61±14.23）μm。由于試驗(yàn)所用KD-Ⅲ型冰凍切片機(jī)最大切片厚度為60 μm，綜合共聚焦激光掃描顯微鏡的觀察效果，對(duì)切片厚度試驗(yàn)設(shè)置了20、40、60 μm3個(gè)梯度，結(jié)果依次對(duì)應(yīng)圖1中a、b、c。切片厚度對(duì)油體的影響見圖1。

圖1 切片厚度對(duì)油體的影響Fig.1 Effect of slice thickness on oil body

從圖1可以看出，隨著切片厚度的增加，油體數(shù)量呈現(xiàn)明顯增多的趨勢(shì)。圖1a切片厚度為20 μm，只保留了極個(gè)別油體，這是由于切片過薄，大部分細(xì)胞被破壞，油體在制片過程中被洗脫導(dǎo)致，試驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)洗脫液表層有明顯的油層出現(xiàn)。圖1b的切片厚度為40 μm，油體數(shù)量有所增加，但大部分細(xì)胞仍然只保存有少量甚至沒有油體，這與羅麗萍等[16]確定的25 μm為最佳切片厚度結(jié)論差距較大，可能是由于不同油茶品種細(xì)胞大小引起的差異。從圖1c中可以看出，切片厚度為60 μm時(shí)油體數(shù)量明顯增多，為了便于觀察更多細(xì)胞的油體保存情況，圖1c（標(biāo)尺20 μm）的放大的倍數(shù)較a、b?。?biāo)尺10 μm），因此最終選擇切片厚度為60 μm。

2.2 染色時(shí)間對(duì)染色效果的影響

尼羅紅是一種疏水性染料，在固定后的組織中具有很強(qiáng)的信號(hào)。根據(jù)前期試驗(yàn)得知，一定濃度范圍內(nèi)的尼羅紅染液濃度對(duì)油體的著色效果差異不顯著，因此試驗(yàn)沒有對(duì)染色液濃度進(jìn)行探討，并選定其濃度為15 μg/mL。試驗(yàn)組探討了4、8、12 h 3個(gè)染色時(shí)間對(duì)油體染色效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 染色時(shí)間對(duì)油體染色效果的影響Fig.2 The effect of dyeing time on oil body dyeing

從圖2d中可以清晰的看出，染色4 h后的油體著色效果不理想，染色劑全部包裹在油體外圍，說明染色時(shí)間不足。隨著染色時(shí)間的增加，著色效果出現(xiàn)明顯的差異，圖2e染色時(shí)間為8 h，染色效果已經(jīng)明顯優(yōu)于圖2d，但還有一部分油體沒有完全著色。從圖2f中可以看出，隨著染色時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至12 h后，細(xì)胞內(nèi)的油體基本都能著上色，觀察界面清晰，油體之間能夠完好的區(qū)分。因此，最終選擇的染色時(shí)間為12 h。

2.3 不同處理對(duì)油體形態(tài)的影響

不同處理油茶果油體的直徑見表1。

表1 不同處理油茶果油體的直徑Table 1 Diameter of oil body of Camellia oleifera seeds after different treatments

不同采后處理油茶果的油體見圖3。

圖3 不同采后處理油茶果的油體Fig.3 Oil bodies of Camellia oleifera seeds after different post-harvest treatments

4種不同方式處理后的油茶果油體均呈規(guī)則的圓形球體，無光處理和室內(nèi)陰干后的油茶果油體大小不一，均勻分散在細(xì)胞內(nèi)，有光處理和自然曬干的油體明顯較大，數(shù)量較少。從表1可知，有光處理和自然曬干后油茶果油體的直徑均明顯大于無光處理和室內(nèi)陰干，無光處理和室內(nèi)陰干（避光）油茶果的油體直徑相當(dāng)，有光處理與自然曬干雖都有光照參與，但有光處理是持續(xù)光照，而自然曬干屬間歇光照，所以可能是光照因素導(dǎo)致油體直徑的差異，后續(xù)還需進(jìn)一步深入探討。合成后的油體可通過相互融合使體積增大，這種融合可自發(fā)進(jìn)行，需要消耗能量，通過微管運(yùn)輸?shù)街参镄枰牟课籟17-19]。通過采后的處理使油茶果油體的體積增大，或許對(duì)油茶籽油的提取有一定幫助，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。不同植物品種的油體直徑差異較大，羅麗萍等[16]報(bào)道的7個(gè)品系油茶油體平均直徑為（2.52±1.99）μm，明顯小于廣西普通油茶品種。齊玉紅等[20]測(cè)定的水稻、亞麻芥、黃豆、黑豆和紅花5種植物油油體粒徑分別為 0.5 μm～12.0 μm、0.3 μm～11.0 μm、0.4 μm～13.0 μm、0.4 μm～13.0 μm、0.4 μm～11.0 μm。Tzen等[21]報(bào)道的油菜、玉米、花生、芝麻的油體直徑分別為 0.65、1.45、1.95、2.00 μm。

2.4 含油體率與含油率的相關(guān)性

表2為不同處理后油茶果種仁含油率與含油體率的比較。

表2 不同處理油茶果含油率及含油體率的比較Table 2 Comparison of oil content and oil body content of Camellia oleifera seeds treated with different treatments

從表2中可知，含油體率越高，油茶籽種仁含油率也越高，為探討含油率與含油體率的線性關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行了回歸線性分析，結(jié)果見表3、表4、表5。

表3 模型匯總Table 3 Summary of models

表4 方差分析Table 4 Anova

表5 系數(shù)Table 5 Coefficient

從表3中可知，R2為0.974，可以初步判斷含油率與含油體率線性模型擬合效果良好。從表4方差分析結(jié)果可知，p值為0.013＜0.05，說明含油率與含油體率建立的線性關(guān)系回歸模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表5可得出含油體率與含油率的線性方程為：Y含油率=0.686X含油體率+35.777。標(biāo)準(zhǔn)化殘差直方圖見圖4。標(biāo)準(zhǔn)化殘差P-P圖見圖5。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)化殘差直方圖Fig.4 Standardized residual histogram

圖5 標(biāo)準(zhǔn)化殘差P-P圖Fig.5 Standardized residual P-P chart

從圖4中可知，含油率與含油體率的線性方程的標(biāo)準(zhǔn)化殘差直方圖對(duì)稱性較好，而且圖5中標(biāo)準(zhǔn)化殘差P-P圖中散點(diǎn)較為靠近斜線，所以線性方程殘差正態(tài)性結(jié)果較好。模型方程DW為2.074，經(jīng)查詢Durbin Watson table可知，DW值在無自相關(guān)性的范圍內(nèi)，接受檢驗(yàn)，殘差獨(dú)立。

3 結(jié)論與討論

切片厚度是影響油體觀察最重要的因素，取決于細(xì)胞大小，最大限度的保留細(xì)胞完整，能夠減少細(xì)胞破損；其次是尼羅紅的染色時(shí)間，時(shí)間不足，染色不夠充分，這可能與細(xì)胞壁有關(guān)系。切片厚度60 μm，染色12 h后，廣西普通油茶果在共聚焦激光掃描顯微鏡下的觀察效果良好。采用有光處理、無光處理、自然曬干和室內(nèi)陰干4種方式處理油茶果，其油體均呈圓形球體狀，有光處理的油茶果油體直徑最大，其次是自然曬干處理，無光處理和室內(nèi)陰干處理后油茶果的油體直徑大小相當(dāng)且均小于曬干處理，說明油體的直徑大小可能跟光的參與有一定關(guān)系。有光處理后油茶果仁的含油率最高（53.08%），且油體直徑最大，這可能有利于油茶加工企業(yè)對(duì)油茶籽油的提取。4種不同處理油茶果的含油率跟含油體率具有較好的線性相關(guān)性，擬合系數(shù)為0.974，擬合度較好，線性方程為：Y含油率=0.686X含油體率+35.777。因此，光照和溫度是采后油茶果前處理的重要因素，合理的利用可以使油茶果進(jìn)一步積累油脂，增加油茶加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，今后還需對(duì)其中的機(jī)理進(jìn)一步深入的探討。