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秋茄葉抗腫瘤有效成分的分離與鑒定

2020-12-01 04:15溫揚敏邱丹纓羅彩林謝永華泉州醫(yī)學高等專科學校福建泉州362000
特種經(jīng)濟動植物 2020年11期
關(guān)鍵詞:石油醚乙酸乙酯提取物

●溫揚敏 邱丹纓 羅彩林 謝永華(泉州醫(yī)學高等??茖W校 福建 泉州 362000)

紅樹植物屬海區(qū)潮間帶的木本植物類群,其獨特的生境使紅樹植物富含結(jié)構(gòu)獨特、具有多種生物活性的化合物,天然的次生代謝產(chǎn)物是篩選藥物先導化合物的重要來源[1]。紅樹植物的果實、皮和根等在民間長期作為藥物使用,可用于麻風病、糖尿病、風濕病等一些常見疾病的治療,以及作為動物創(chuàng)傷和中毒的外敷藥等。開展紅樹林植物化學成份和藥理活性研究,對紅樹林資源的保護和合理開發(fā)具有重要意義。

秋茄(Kandelia candel)屬于紅樹科秋茄屬植物,是最耐寒的紅樹植物種類,廣泛分布于越南、印度、日本以及中國的福建、臺灣、廣東、廣西等地[2]。Majumdar 等[3]最早從秋茄葉中分離出三萜和甾醇化合物,后來研究者們陸續(xù)從秋茄中分離鑒定出甾醇、萜類、鞣質(zhì)類、黃酮類等具有一定生理活性的單體化合物。但目前對秋茄化合物的生理活性研究不夠深入,化學成分研究還處于起步階段。因此,研究秋茄的化學成分和生理活性,對秋茄資源的保護與利用以及新型先導化合物開發(fā)具有十分重要的意義[4]。本研究采用活性追蹤方法對泉州灣紅樹植物秋茄葉抗腫瘤活性物質(zhì)進行分離純化,為秋茄藥用成分的開發(fā)與新型抗腫瘤藥物研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

秋茄葉采自泉州灣紅樹林保護區(qū)洛陽橋段,由泉州市紅樹林自然保護區(qū)陳若海工程師鑒定。采回實驗室自來水洗凈后烘箱45℃烘干,粉碎機粉碎后備用。

1.2 主要儀器與試劑

AVANCE Ⅲ500M 核磁共振儀( 德國Bruker公司);KHBST-360 型酶標儀(上??迫A科技公司);紫外光譜儀( 英國Amersham Biosciences公司);HF-90 型CO2培養(yǎng)箱(北京陽光思特生物公司);ESI-MS 質(zhì)譜儀(美國Thermo 公司);酶標儀(美國Dynex 公司);食管癌細胞株(天呈科技生物公司);反相柱層析硅膠RPC-18(德國Merck 公司);胎牛血清(美國Hyclone 公司);凝膠柱層析Sephadex LH-20 (上海宸喬生物科技有限公司);細胞培養(yǎng)基(北京賽默飛世爾公司);正相柱層析硅膠(青島海洋化工有限公司)。

1.3 提取與分離

提取分離流程見圖1。稱兩份質(zhì)量為2kg 的秋茄葉,分別用雙蒸水和95%乙醇浸泡3 次,每次24h,合并三次提取液,過濾蒸餾獲得浸膏。95%乙醇浸膏用水混懸,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,減壓回收溶劑,分別收集石油醚(357g)、乙酸乙酯(534g)和正丁醇(286g)萃取物。將乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱,用氯仿-甲醇梯度洗脫,分別收集氯仿-甲醇40∶1和10∶1 洗 脫2 個 組 份Fr.1(2 650mg)和Fr.2(1 960mg)。組份Fr.1 再經(jīng)聚酰胺柱,用石油醚-氯仿梯度洗脫,分別收集3個組份Fr.1-1(660mg)、Fr.1-2(730mg)和Fr.1-3(570mg)。組份Fr.1-1經(jīng)Sephadex LH-20 柱、氯仿-甲醇1∶1 洗脫,得到化合物1(92mg);組份Fr.1-2 經(jīng)Sephadex LH-20 柱,氯仿-甲醇1∶1 洗脫,得到化合物2(86mg);組份Fr.1-3 經(jīng)Sephadex LH-20 柱,氯仿-甲醇1∶1 洗脫,得到化合物3(88mg)和化合物4(79mg)。

圖1 秋茄葉化合物分離工藝流程圖

1.4 MTT 實驗

根據(jù)實驗室已有方法[5],在100 mL 細胞懸液中分別加入不同濃度待測藥物,培養(yǎng)72h 后,用酶標儀測定OD450值,按以下公式計算腫瘤抑制率。

抑制率=(OD 對照-OD 實驗)/OD 對照×100%

2 結(jié)果

2.1 秋茄葉水提物和乙醇提取物抗腫瘤活性

為研究秋茄葉水和乙醇提取物的抗腫瘤活性,分別進行人食管癌EC-9706 細胞株抗腫瘤活性測定。細胞培養(yǎng)72h 后結(jié)果,見圖2。從圖2可以看出秋茄葉水提物和乙醇提取物對人食管癌EC-9706 細胞均有一定抑制效果。其中水提物和乙醇提取物對食管癌細胞抑制IC50為4.81mg/mL 和3.27mg/mL。不同濃度下,乙醇提取物的腫瘤抑制活性均顯著高于水提物(p<0.05)。除0.2mg/mL外,乙醇提取物和水提物對食管癌細胞抑制活性存在極顯著差異(p<0.01)。

圖2 秋茄葉水提物和乙醇提取物對人食管癌EC-9706 細胞的抑制活性

2.2 秋茄葉乙醇提取物不同萃取部分抗腫瘤活性

秋茄葉水提物和乙醇提取物抗腫瘤活性結(jié)果顯示,乙醇提取物對食管癌細胞體外抑制活性顯著高于水提物。因此,對乙醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分別測定不同萃取部分對人食管癌細胞體外抑制活性(圖3)。從圖3 可以看出,石油醚萃取部分對食管癌細胞抑制活性較差,其中濃度為0.5mg/mL 時,石油醚萃取部分對食管癌細胞抑制率最高為5.97%,但不同濃度之間對食管癌抑制活性無顯著差異(p>0.05)。乙酸乙酯和正丁醇萃取部分對人食管癌均有較強抑制活性,其中對食管癌細胞抑 制IC50為2.10mg/mL 和3.01mg/mL。乙 酸 乙酯和正丁醇萃取部分對人食管癌抑制活性均隨濃度增加而增大。不同濃度下,乙酸乙酯萃取部分對食管癌抑制活性均極顯著高于正丁醇萃取部分(p>0.01)。

圖3 秋茄葉乙醇提取物不同萃取部分對人食管癌EC-9706 細胞的抑制活性

2.3 硅膠柱分離各洗脫組分抗腫瘤活性

秋茄葉乙醇提取物不同萃取部分抗腫瘤活性結(jié)果顯示,乙酸乙酯萃取部分對人食管癌體外抑制活性最大,因此采用硅膠柱進一步對乙酸乙酯萃取部分進行分離,得到兩個組分(Fr.1 和Fr.2)。分別測定Fr.1 和Fr.2 對人食管癌細胞體外抑制活性(圖4)。從圖4 可以看出,不同濃度Fr.1 對人食管癌細胞均有一定抑制活性,且隨濃度增加抑制活性增大,其中對食管癌細胞抑制IC50為0.37mg/mL。而不同濃度Fr.2 對人食管癌細胞抑制活性均小于10%,且不存在劑量關(guān)系。Fr.1 對人食管癌細胞抑制活性極顯著高于Fr.2(p<0.01)。

圖4 硅膠柱各洗脫組分對人食管癌EC-9706 細胞抑制活性

2.4 分離單體化合物抗腫瘤活性

Fr.1 和Fr.2 對人食管癌細胞體外抑制結(jié)果顯示,F(xiàn)r.1 的抗腫瘤活性顯著大于Fr.2。因此,采用聚酰胺柱和葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱分離得到四個單體化合物。本文分別測定了四個化合物對人食管癌細胞體外抑制活性(圖5)。從圖5 可以看出四個化合物對人食管癌細胞均有一定抑制活性,且抑制活性均隨濃度增加和培養(yǎng)時間延長而增大。細胞培養(yǎng)72h 后,化合物1、化合物2、化合物3 和化合物4 對食管癌細胞抑制IC50分別為27.28μg/mL、30.47μg/mL、93.17μg/mL 和34.10μg/mL。

圖5 秋茄分離單體化合物對人食管癌EC-9706 細胞的抑制活性

2.5 結(jié)構(gòu)鑒定

單體化合物抗腫瘤活性結(jié)果顯示,四個化合物均有一定抗腫瘤活性,所以分別對其進行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.5.1 化合物1白色粉末, mp 294~296℃。Liebermann-Burchard 反應(yīng)陽性,Molish 反應(yīng)陰性。由HR-ESI-MS 得到分子式C30H48O3。ESI-MSm/z:456 [M]+。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δH: 4.94(1H, brs, H-29α), 4.76 (1H, brs, H-29β), 3. 52 (1H,d,J= 9. 8 Hz, H-19),3. 49 (2H, t,J= 7. 8 Hz, H-3),1.94 (3H, brs, H-30), 1.21 (3H, s,H-27), 1.06 (3H, s,H-26), 1.05 (3H, s, H-23), 1.00 (3H, s, H-25), 0.82(3H, s, H-24).以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[6],加上與對照品呈現(xiàn)一致的Rf 值,故鑒定化合物為白樺脂酸(圖6-A)。

2.5.2 化合物2白色粉末, mp 275~276℃。Liebermann-Burchard 反應(yīng)陽性,Molish 反應(yīng)陰性,溴甲酚綠反應(yīng)陽性。ESI-MSm/z: 456 [M]+,分子式為C30H48O3。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δH: 5.48 (1H, t,J= 3.2 Hz, H-12), 3.47 (1H, dd,J=11.5, 4.8 Hz, H-3), 2.64 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-18),1.36 (3H, s, 29-CH3), 1.24 (3H, s, H-27), 1.21(3H, s, H-23β), 1.04 (3H, s,H-24α), 1.01 (3H, s,H-30), 0.94 (3H, s, H-26), 0.87 (3H, s, H-5). 以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[7],加上與對照品呈現(xiàn)一致的Rf 值,故鑒定化合物為熊果酸(圖6-B)。

2.5.3 化合物3白色粉末, mp 253~255℃。Liebermann-Burchard 反應(yīng)陽性,茴香醛顯色為紫紅色。EI-MSm/z:442[M]+。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δH:4.67(1H,s,H-29α),4.57(1H,s,H-29β),4.03(1H,d,J=9.8Hz,H-28b),3.32(1H,d,J=9.8 H z,H-2 8 a),3.1 8(2 H,t,J=7.8 H z,H-3),2.38(1H,m,H-19),1.93(3H,s,H-30),1.01(3H,s,H-26),0.96(3H,s,H-23),0.81(3H,s,H-25),0.75(3H,s,H-24)以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[8],加上與對照品呈現(xiàn)一致的Rf 值,故鑒定化合物為白樺脂醇(圖6-C)。

2.5.4 化合物4白色粉末,mp 213~215℃。Liebermann-Burchard 反應(yīng)陽性,茴香醛顯色為紫紅色,三氯醋酸反應(yīng)呈陽性。ESI-MSm/z:427[M + H]+。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δH:4.68(1H,d,J=2.4Hz,H-29a),4.58(1H,d,J=2.4Hz,H-29b),3.19(1H,dd,J=11.4,4.8Hz,H-3),1.68(3H,s,H-30),1.03(3H,s,H-26),0.97(3H,s,H-23),0.94(3H,s,H-27),0.83(3H,s,H-25),0.79(3H,s,H-28),0.76(3H,s,H-24)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[9],加上與對照品呈現(xiàn)一致的Rf 值,故鑒定化合物為羽扇豆醇(圖6-D)。

圖6 秋茄葉中分離化合物的分子結(jié)構(gòu)

3 討論

秋茄是一種常見的紅樹植物,生長在熱帶、亞熱帶海岸潮間帶特殊生境,不僅具有重要的生態(tài)意義,還具有重要經(jīng)濟和藥用價值[10]。由于秋茄所處的特殊生長環(huán)境,已從秋茄中分離出多種具有特定生理功能的化合物。Majumdar 等[3]從秋茄葉分離出β-香樹脂醇、木醛酮、蒲公英甾醇3 個三萜化合物和1 個甾醇化合物β-谷甾醇。Ghoshet 等[11]從秋茄的樹皮中分離出包括6 個新鞣質(zhì)類化合物。盧昌義等[12]等對秋茄葉脂肪酸組成研究表明秋茄葉中脂肪酸碳鏈多為12~28 個碳原子,富含軟脂酸和硬脂酸等飽和脂肪酸,油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸。從秋茄葉中分離出黃酮化合物蘆丁對動脈樣硬化和高血壓有一定治療作用。秋茄作為海洋藥用植物已經(jīng)被《現(xiàn)代本草綱目》收錄[13]。

腫瘤是當前危害人類健康的主要疾病之一,研究表明秋茄的皮、果實、葉子等均有不同程度抗腫瘤活性。研究證實秋茄乙醇提取物對人鼻癌細胞CNE-1 具有抑制作用[14]。本研究結(jié)果顯示秋茄葉乙醇提取物對人食管癌細胞體外抑制活性顯著高于水提取物。陳虹等[15]研究表明,秋茄根石油醚提取物對人肝癌細胞SMMC-7721、小鼠黑色素瘤細胞B16 和人胃癌細胞BCG803 等均有體外抑制活性,其半致死濃度IC50分別為335.2μg/mL、378.6μg/mL 和275.6μg/mL。 本 研究結(jié)果與以上結(jié)論相似,顯示秋茄葉乙醇提取物的石油醚萃取部分對人食管癌細胞具有體外抑制活性,其中秋茄葉乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分對人食管癌細胞體外抑制活性顯著高于石油醚萃取部分。

為克服天然產(chǎn)物傳統(tǒng)的先分離化合物再進行活性測定研究模式的盲目性,有效提高分離抗腫瘤活性物質(zhì)的準確性。本研究以對人食管癌細胞體外生長抑制活性為指標,采用活性追蹤的方式從秋茄葉中得到的4 個三萜類單體化合物:白樺脂酸、熊果酸、白樺脂醇和羽扇豆醇。且4 個三萜類單體化合物對人食管癌細胞均具有一定體外抑制活性,其結(jié)果與其他研究一致[16-17]。證實秋茄中含有多種抗腫瘤活性成分,具有重要的抗腫瘤等藥用開發(fā)價值。未來有待進一步研究秋茄活性成分的抗腫瘤機制,為新型抗腫瘤藥物及紅樹植物開發(fā)提供實驗依據(jù)。

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